專(zhuān)利名稱(chēng)：一種bar/PAT蛋白單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種單克隆抗體的制備和應(yīng)用，涉及抗除草劑標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
如基因，為抗除草劑基因，編碼蛋白一膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)。該基因廣泛應(yīng)用于基因工程育種中，也是遺傳轉(zhuǎn)化中的標(biāo)記基因，它使植物抵抗以L-phosphiothricin(PPT)為活性成分的除草劑。2001年全球種植的轉(zhuǎn)基因作物面積達(dá)5260萬(wàn)hm2，抗除草劑作物占全球轉(zhuǎn)基因作物的85%。從發(fā)展趨勢(shì)上看，轉(zhuǎn)基因的作物比例仍在不斷增加。由于抗除草劑標(biāo)記在商業(yè)化轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用廣泛，隨著轉(zhuǎn)基因食品的快速發(fā)展，國(guó)外轉(zhuǎn)hr或基因的作物和食品的大量進(jìn)入我國(guó)，轉(zhuǎn)hr基因的食品檢測(cè)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因食品安全性評(píng)價(jià)的重要技術(shù)平臺(tái)，其研究具有重要的意義。·開(kāi)展轉(zhuǎn)基因外源蛋白的檢測(cè)，主要的方法有即Western雜交、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)等,這些方法都依賴(lài)特異性高、純度高、效價(jià)高的蛋白抗體。本發(fā)明針對(duì)bar/pat基因表達(dá)蛋白檢測(cè)設(shè)計(jì)的抗PAT蛋白單克隆抗體，該單抗具有高特異性、與其他轉(zhuǎn)基因材料或表達(dá)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)，效價(jià)高，達(dá)到IO7以上。而單抗本身具有成本低，比多抗更敏感、精確、穩(wěn)定，便于人為處理和質(zhì)量控制，并可大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，該單抗可用于快速檢測(cè)植物、食品等農(nóng)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分，及對(duì)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件的檢測(cè)，為抗除草劑轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種bar I pat蛋白單克隆抗體及分泌改單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。本發(fā)明保護(hù)一種分泌如蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4C2,已于2012年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC No. 6341
本發(fā)明還保護(hù)所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。所述單克隆抗體在輔助鑒定轉(zhuǎn)bar基因植物及其產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述單克隆抗體在輔助轉(zhuǎn)基因植株培育中(玉米、大豆、水稻、棉花等)的篩選鑒定的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述植物體可為轉(zhuǎn)基因初世代材料。本發(fā)明還保護(hù)所述單克隆抗體在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒功能為如下Ca)輔助鑒定抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物；
(b)輔助鑒定待測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否為抗甘膦草除草劑植株；
(C)輔助鑒定食品、飼料或其他加工產(chǎn)品原料中是否含有轉(zhuǎn)bar/pat基因的轉(zhuǎn)基因植物成分。本發(fā)明還保護(hù)含有所述單克隆抗體的試劑盒；所述試劑盒功能如下(a)輔助鑒定抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物；
(b)輔助鑒定待測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否為抗甘膦草除草劑植株；
(C)輔助鑒定食品、飼料或其他加工產(chǎn)品原料中是否含有轉(zhuǎn)bar/pat基因的轉(zhuǎn)基因植物成分。所述植物具體可為水稻、大豆、玉米、煙草、苜蓿、棉花等。所述待測(cè)外源蛋白為bar或pat基因的表達(dá)蛋白。本發(fā)明提供的單克隆抗體用于植物中外源PAT蛋白檢測(cè)，具有特異性好，效價(jià)高、廣譜性等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明研制的抗PAT蛋白單克隆抗體，可用于研制轉(zhuǎn)基因bar/pat的免疫學(xué)診斷試劑，如酶聯(lián)免疫診斷試劑，膠體金免疫試紙條，抗體芯片等。
本發(fā)明的積極效果在于可用于快速檢測(cè)植物、食品等農(nóng)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分，及對(duì)公共衛(wèi)生應(yīng)急事件的檢測(cè)，為抗除草劑轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)提供技術(shù)支撐。本發(fā)明通過(guò)小鼠腹腔注射單抗細(xì)胞株，即可獲得大量的單克隆抗體，可直接用于轉(zhuǎn)基因植株的抗除草劑標(biāo)記篩選，對(duì)今后轉(zhuǎn)基因植物研發(fā)過(guò)程的陽(yáng)性篩選和轉(zhuǎn)基因食品安全評(píng)價(jià)具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。


圖I SDS電泳分析PAT蛋白表達(dá)M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)I為300nm洗脫峰2為200nm洗脫峰3為IOOnm洗脫峰4為IOnm洗脫峰,5為穿透峰。圖2純化單抗的SDS-PAGE電泳圖1，2為該細(xì)胞株表達(dá)的抗體蛋白，3為陰性細(xì)胞株;M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖3利用該單抗進(jìn)行轉(zhuǎn)bar基因棉花Western blot檢測(cè) I為陰性細(xì)胞株對(duì)照；2為轉(zhuǎn)bar基因棉花總蛋白；3為非轉(zhuǎn)基因棉花總蛋白4為轉(zhuǎn)EPSPS基因玉米種子總蛋白。圖4該單抗在Elisa檢測(cè)特異性的結(jié)果。圖5該單克隆抗體在檢測(cè)不同轉(zhuǎn)Bar成分含量的檢測(cè)靈敏度結(jié)果。圖6試紙條檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中PAT蛋白I為陰性水稻2為轉(zhuǎn)bar基因水稻。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下列實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例中所用的植物材料樣品均來(lái)自農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中心(長(zhǎng)春)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品庫(kù)。配制方法參考農(nóng)業(yè)部178號(hào)公告-8-2012《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備技術(shù)規(guī)范》每I升包被緩沖液按照如下方法配制將碳酸鈉I. 59g、碳酸氫鈉2. 93g和疊氮化鈉O. 2g溶于去離子水，定容至IL ;包被緩沖液的PH值為9. 6。每I升洗滌緩沖液按照如下方法配制將氯化鈉8. 0g、磷酸二氫鉀O. 2g、磷酸氫二鈉I. 15g、氯化鉀O. 2g、吐溫200. 5ml和疊氮化鈉O. 2g溶于去離子水中，定容至IL;洗滌緩沖液的PH值為7.4。每I升磷酸鹽緩沖液(PBS)按照如下方法配制將氯化鈉8. 0g、磷酸二氫鉀O. 2g、磷酸氫二鈉I. 15g、氯化鉀O. 2g和疊氮化鈉O. 2g溶于去離子水中，定容至IL;緩沖液的PH值為7.4。HEPES buffer 蛋白抽提緩沖液IOOmM HEPES，pH 7. 5 ；5mM EDTA, 5mM HEPESbuffer EGTA ；10mM Na3V04 ；10mM NaF ；5% Glycerol ；2% 2-ME。封閉液溶于磷酸鹽緩沖液中的1%BSA。底物緩沖液(磷酸鹽-檸檬酸緩沖液)NaHP04 18. 42g，檸檬酸5. 10g, ddH20定容至 1L, PH 5. O。TMB 儲(chǔ)存液IgTMB 溶于 100ml DMF。底物顯色工作液ELISA底物緩沖液IOOml + 100 μ I TMB儲(chǔ)存液+5 μ I預(yù)冷去離子水(用之前加)。
一、抗原的表達(dá)和制備
I.原核表達(dá)的bar基因片段合成
根據(jù)Genebank公布的Bar基因序列，并使用“clustal”軟件對(duì)Bar基因核苷酸序列(552bp)，進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列(183aa)比對(duì)。在氨基酸序列不變的情況下，利用http://www. jcat. de/提供的信息進(jìn)行密碼子優(yōu)化,獲得更適合在大腸桿菌中表達(dá)的基因序列，核酸序列見(jiàn)說(shuō)明書(shū)核苷酸和氨基酸序列表。表達(dá)載體的構(gòu)建
將上述優(yōu)化核酸序列通過(guò)全基因合成，獲得的567bp的bar基因片段克隆至pET-28a載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-Bar。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，篩選陽(yáng)性克隆。挑取含pET-Bar質(zhì)粒的單克隆菌落，接種于IOOml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(用LB (Amp+)表示)中，37°C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日用LB(Amp+)稀釋至1000ml，37°C培養(yǎng)至0D_ = I左右，加IPTG至終濃度為ImM。37°C繼續(xù)培養(yǎng)6小時(shí)。4°C，5，OOOrpm離心10分鐘，收集沉淀并用PBS洗滌。3.原核表達(dá)PAT蛋白的分離
灌制10%分離膠60ml和5%濃縮膠15ml，灌膠。上樣后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電壓100V，電泳6-7小時(shí)。終止電泳后，用冷O. IM KCl浸泡膠2_3分鐘，切下目的條帶置透析袋內(nèi)。將透析袋置于水平電泳洗脫裝置內(nèi)，60V洗脫過(guò)夜。次日100V繼續(xù)洗脫I小時(shí)。然后反轉(zhuǎn)電極向相反方向洗脫3-5分鐘。吸出透析帶內(nèi)液體，蔗糖包埋濃縮，PBS透析。pGEX-1893在IPTG誘導(dǎo)6個(gè)小時(shí)后能穩(wěn)定表達(dá)PAT融合蛋白。融合蛋白以包涵體形式存在，約占菌體總蛋白的10%。其分子量約為27kD。如圖I所示。獲得的純化的PAT蛋白為本實(shí)驗(yàn)所用抗原。
二、雜交瘤細(xì)胞的獲得
I.免疫小鼠
將純化的PAT蛋白在其同體積的弗氏完全佐劑中乳化，乳化后，對(duì)8周齡balb/c雌性小鼠進(jìn)行第一次免疫(腹腔注射，每只小鼠200ugPAT蛋白)，2周后，進(jìn)行第二次免疫，即將50mg PAT蛋白與不完全弗氏佐劑(IFA)等體積混勻，進(jìn)行背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射(每只小鼠200ugPAT蛋白)。第二次免疫后的2周之后,進(jìn)行第三次免疫,每次加強(qiáng)免疫后的第10天取小鼠尾血2ul，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)。第三次免疫I周后，進(jìn)行第四次免疫，用酒精棉球消毒小白鼠尾部，把吸取的O.Iml溶于PBS的PAT蛋白，注射入小白鼠尾部靜脈，注射完畢，有酒精棉消毒注射部位，以防感染。細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞的篩選和保藏
取免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按細(xì)胞數(shù)量10:1混合，(本實(shí)驗(yàn)脾細(xì)胞I. 5 X 108個(gè)，SP2/0細(xì)胞I. 7X107個(gè)，融合后滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，使脾細(xì)胞數(shù)為3X 105個(gè)/每孔)使兩種細(xì)胞混合均勻，加入到IOmL的離心管內(nèi)，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液(購(gòu)自ATCC，貨號(hào)30-2002)補(bǔ)液至IOmL,混合均勻，1000r/min離心IOmin,吸上清棄去；用手指輕擊管底,使兩種細(xì)胞充分混勻；將其置于37°C水浴中，吸取37°C預(yù)熱的50% PEG3350溶液O. 6mL，沿轉(zhuǎn)動(dòng)的離心管壁在60s內(nèi)緩慢滴入，然后37°C水浴中靜止90s，立即在5min內(nèi)加入IOmL 37°C預(yù)熱的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液使PEG稀釋而失去促融作用。在第Imin加ImL,在第2min加4mL,隨后3min內(nèi)加完剩余液體，混勻后，IOOOrpm離心lOmin，吸取上清棄去，加入DMEM培養(yǎng) 液，混勻，再洗一次，盡量除去剩余PEG，減少PEG對(duì)細(xì)胞的毒性(朱立平等，2000)。然后將沉淀細(xì)胞輕懸于含20%胎牛血清的預(yù)溫HAT選擇培養(yǎng)液中，混合均勻，加入到已加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，將培養(yǎng)板移至37°C，5% C02飽和濕度溫箱中培養(yǎng)。融合后10天進(jìn)行換液培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)的第10天，10塊96孔板中700孔有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，融合率達(dá)到70%。雜交瘤的篩選融合后10天換用HT培養(yǎng)液，第15天后用普通DMEM完全培養(yǎng)液。待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底1/4-1/3時(shí)，于換液3-4天后即可在無(wú)菌條件下取有克隆細(xì)胞生長(zhǎng)孔的上清液100 μ L，不作稀釋?zhuān)瞄g接ELISA篩選方法對(duì)上清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液作陰性對(duì)照，并設(shè)陽(yáng)性、陰性血清對(duì)照，測(cè)出的陽(yáng)性孔及時(shí)進(jìn)行克隆化和轉(zhuǎn)移。克隆采用液相有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆將陽(yáng)性孔中的雜交瘤細(xì)胞集落吹起混勻，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)后進(jìn)行系列稀釋到ImL含10個(gè)細(xì)胞，將稀釋好的細(xì)胞懸液每孔100 μ L加入到事先加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。適時(shí)補(bǔ)液或換液(如果液體蒸發(fā)不明顯盡量不要補(bǔ)液或換液)并將克隆化剩余細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移擴(kuò)大培養(yǎng)凍存。克隆后，選取單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)集落孔上清進(jìn)行檢測(cè)，從中選取I個(gè)陽(yáng)性值最高的孔再進(jìn)行克隆，方法同上，直至檢測(cè)陽(yáng)性率為100%，陽(yáng)性克隆細(xì)胞及時(shí)凍存。獲得了 I株能穩(wěn)定分泌抗PAT蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將雜交瘤細(xì)胞株命名為4C2，于2012年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC,地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC No. 6341。三、單克隆抗體的鑒定
I.單克隆抗體的純化
取20-22克Balb/c雌性小鼠，每只腹腔注射O. 5ml降殖烷(2，6，10，14_Tetramethylpen- tradecane, Janssen Chimica 公司)。一周后，每只小鼠腹腔注射約
2X IO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞。7-10天后小鼠腹部顯著膨隆，收集腹水。12，000 rpm離心30秒，去除沉淀和上層油脂，收集中段液體。收集的液體用33%硫酸胺沉淀過(guò)夜。次日，10，OOOrpm離心4分鐘，沉淀溶于去離子水，并用PBS透析。用結(jié)合緩沖液(O. IM碳酸鈉緩沖液(pH
9.5)，3M NaCl 或者 O. 05M 硼酸鈉緩沖液(pH9. 5)，3M NaCl 平衡 Protein A S印harose_4B層析柱(Pharmacia公司)。用結(jié)合緩沖液I稀釋樣品后通過(guò)層析柱。待流出液體的OD值為O. Ol時(shí)，用O. IM檸檬酸鈉(pH 2. 6)洗脫層析柱，收集洗脫液。用5M Tris (pH 8. 8)調(diào)節(jié)pH至7，PBS透析。純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，如圖2所示，單克隆抗體的分子量約147kd，在還原劑的作用下，抗體分解為兩個(gè)片段，其中重鏈50KD，輕鏈25KD。單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定 I)包被
將分離純化的PAT蛋白用包被緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)尤朊笜?biāo)板中(IOOul/孔)，PAT蛋白的包被濃度為10ug/ml ;37°C孵育2h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。將Ig非轉(zhuǎn)基因大豆葉片總蛋白加入IOml包被緩沖液中，在研缽中研磨，得到陰性對(duì)照液，將陰性對(duì)照加入酶標(biāo)板中(IOOul/孔)，即為陰性對(duì)照孔；37°C孵育2h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。
2)封閉
每孔加入IOOul含5%脫脂奶粉的磷酸緩沖液，37°C孵育30min，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。3)每孔加入IOOul上述純化得到的單克隆抗體或其稀釋液(用酶標(biāo)抗體稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋)，37°C孵育2h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。4)每孔加入IOOul酶標(biāo)二抗工作液，37°C孵育2h，然后用洗滌緩沖液沖洗酶標(biāo)板。5)每孔加入IOOul底物溶液，室溫避光孵育60min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)下的吸收值。將吸收值為陰性對(duì)照孔兩倍以上的孔判斷為陽(yáng)性孔。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清、小鼠腹水及純化后抗體的效價(jià)見(jiàn)表I。表I單克隆抗體的效價(jià)
3.抗體亞類(lèi)的鑒定
ISO-1 Capture ELASA試劑盒購(gòu)自Sigma公司。取待測(cè)雜交瘤細(xì)胞4C2上清液15ml,加等量飽和硫酸胺，混勻后4°C過(guò)夜。次日10，OOOrpm離心10分鐘，沉淀溶于500ml去離子水。羊抗鼠IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM按I :1000稀釋后包被96孔板，37°C作用I小時(shí)。PBS清洗，每孔加待測(cè)上清50ul，室溫作用I小時(shí)。力卩HRP-羊抗鼠二抗，室溫作用30分鐘。OPD顯色。CGMCC No. 6341細(xì)胞株分泌的單克隆抗體為IgGl亞類(lèi)。實(shí)施例I本發(fā)明的單抗應(yīng)用之一，采用轉(zhuǎn)印免疫印跡方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)PAT蛋白。種子總蛋白的提取轉(zhuǎn)bar基因棉花、非轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)EPSPS玉米種子各lg，采用HEPES buffer直接提取蛋白，具體方法為加入預(yù)冷的提取液I mL，混懸后冰上靜置3
4h，4°C、12 000 r/min，離心20 min，上清液置于_80°C冰箱中備用。SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳
3.轉(zhuǎn)膜
4.封閉及雜交
I)封閉轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，小心取出凝膠和膜，可將凝膠再用考馬斯亮藍(lán)染色以判斷轉(zhuǎn)移情況。將膜放入TBST洗一次，再置于麗春紅染色液中，在室溫下染色5min，用雙蒸水洗膜至水變清無(wú)色蛋白條帶清晰。將膜放入盛有封閉液(5%的脫脂奶粉)的容器中，室溫?fù)u床封閉Ih0
2)—抗孵育根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)以適當(dāng)比例(1:1000)用5%的脫脂奶粉稀釋一抗，每張膜約4ml。將封閉后的PVDF膜小心放入雜交袋內(nèi)，然后加入配好的一抗溶液，，小心排除氣泡，室溫下?lián)u床緩慢搖蕩孵育l_3h。孵育后將膜取出，用TBST搖床洗膜3次，每次5min，以去除殘留的一抗。3) 二抗孵育用5%的脫脂奶粉按二抗說(shuō)明書(shū)比例稀釋二抗(1:4000)，將PVDF膜小心置于雜交袋中，每張膜加4ml 二抗溶液，避免氣泡產(chǎn)生，封好雜交帶口，室溫?fù)u床孵育2h。孵育后將膜取出，用TBST搖床洗膜3次，每次5min。5.曝光鑒定；
在暗室中取出一張X光膠片，根據(jù)熒光強(qiáng)弱調(diào)整曝光時(shí)間，一般為l-5min。曝光后，打開(kāi)暗盒取出X光膠片，顯影、定影并沖洗膠片。6.將膠片進(jìn)行掃描,用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。圖 3為利用該單抗進(jìn)行轉(zhuǎn)bar基因的棉花Western blot檢測(cè),結(jié)果表明，該單克隆抗體能夠特異識(shí)別植物中表達(dá)PAT蛋白。實(shí)施例2本發(fā)明的單抗應(yīng)用之二，利用該單克隆抗體，采用雙抗夾心ELISA法，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因材料。實(shí)驗(yàn)材料的選擇和蛋白提取
取不同轉(zhuǎn)基因成分的轉(zhuǎn)基因玉米品系，Btl76 (轉(zhuǎn)bar基因玉米)、Mon810 (轉(zhuǎn)CrylAb基因抗蟲(chóng)玉米)、GA21 (轉(zhuǎn)EPSPS基因玉米)、T25 (轉(zhuǎn)pat基因玉米)籽粒分別與非轉(zhuǎn)基因玉米混合成樣品材料。樣品材料中轉(zhuǎn)基因成分質(zhì)量比分別為1%、10%、100%。分別取樣品材料Ig加入IOml樣品預(yù)冷的抽提緩沖液lmL，并研磨。混懸后冰上靜置3 4 h，4°C、12000r/min，離心20 min，上清液置于_80°C冰箱中備用。單克隆抗體的特異性鑒定
I)兔PAT蛋白多抗制備方法如下
選體重2. Okg左右、雄性、健康的家兔3只，免疫前耳緣靜脈采血分離血清作為陰性對(duì)照，-80°C保存?zhèn)溆谩Ｃ庖叱绦蛉缦率酌猓乖c等量弗氏完全佐劑充分乳化后，皮下多點(diǎn)注射，Img/只。二免(第15日)，用加弗氏不完全佐劑的抗原進(jìn)行免疫，部位為雙后腳掌，500yg/只。三免(第30日)，劑量同上，免疫部位為腫大的胭淋巴結(jié)。加強(qiáng)免疫(第37日)，不加佐劑，劑量同上。加強(qiáng)免疫一周后心臟采血并分離血清，用間接ELISA檢測(cè)抗體水平。效價(jià)為1:32000，心臟采血，分離血清，加入O. 01%的疊氮鈉，過(guò)濾除菌，_80°C保存?zhèn)溆谩Ｐ了嵋涣蛩徜@法提純兔抗bar基因蛋白IgG高免血清，將血清3000rpm離心30min，棄沉淀；按1:2的比例將離心后的血清與醋酸鹽緩沖液(O. 06M，pH=5. O)混合，用
O.IM HCl調(diào)節(jié)pH值至4. 5。4°C下邊攪拌邊加入辛酸(每mL血清加入75 μ I辛酸)，攪拌30min, 4°C靜止2h, 12000rpm離心30min,棄沉淀；上清液用IM NaOH調(diào)pH值至7. 4,邊攪拌邊加入4°C放置的飽和(NH4)2SO4，使其濃度達(dá)45%，4°C靜置Ih以上；4°C 12000rpm離心30min棄上清，沉淀用少量PBS (O. 01Μ,ρΗ=7· 4)溶解，在O. 01M,pH=7. 4 PBS溶液中4°C透析過(guò)夜，期間換液3-5次，5%BaC12檢測(cè)透析液中S042-存留情況；4°C 12000rpm離心30min，吸取上清于-20°C保存。將粗純物進(jìn)一步用親和層析法進(jìn)行純化，步驟如下平衡加起始緩沖液平衡柱床至進(jìn)入與洗出液PH值相同；上樣樣品經(jīng)濾膜濾過(guò)，取5mL上柱，輕輕振蕩5min，豎直放置。待所有懸浮物沉淀后，吸出上清；洗脫加起始緩沖液5mL，輕輕振蕩5min，豎直放置。待所有懸浮物沉淀后，吸出上清。反復(fù)操作3次。加洗脫緩沖液3mL，輕輕振蕩5min，豎直放置。待所有懸浮物沉淀后，吸出上清。反復(fù)操作2次。收集洗脫液，每毫升洗脫液加70 μ L中和緩沖液。提純前和提純后的兔抗bar基因蛋白IgG高免血清純度鑒定采用普通的聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE )，并用測(cè)定抗體濃度。2)兔抗PPV IgG與McAb最佳工作濃度的確定
用方陣試驗(yàn)確定兔抗bar基因蛋白多抗與McAb最佳工作濃度。單抗雙夾心ELISA的一般流程兔抗bar基因IgG包被-洗板-封閉-洗板-加樣-洗板-加McAb-洗板-加酶標(biāo)二抗-洗板-顯色-終止-判定結(jié)果。具體步驟如下包被用包被液將兔抗bar基因 IgG 作 I: 100、I: 200、I: 400、I: 800、I: 1600、I: 3200、I: 6400 稀釋?zhuān)?00 μ L/孔，每個(gè)稀釋度一行，37°C包被2h后或4°C過(guò)夜；棄掉孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3次，5min/次，拍干；封閉用39^八作封閉劑，100^ /孔，并去除各孔內(nèi)可能產(chǎn)生的氣泡，37°C封閉3h，同上洗滌三次，拍干；加樣，100 μ L/孔，同時(shí)設(shè)PBS空白對(duì)照，37°C作用40min，同上洗漆三次，拍干；加 McAb 用稀釋液將 McAb 作 1:25、1:50、1: 100、I: 200、I: 400、I: 800、I 1600稀釋?zhuān)尤朊笜?biāo)板中，IOOyL/孔，每個(gè)稀釋度作兩列，同時(shí)設(shè)PBS空白對(duì)照，37°C·作用40min，同上洗滌三次，拍干；加酶標(biāo)二抗加入I: 5000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100 μ L/孔，37°C作用40min，同上洗滌三次，拍干；顯色與終止，加入新配制的TMB底物顯色液IOOyL /孔，室溫避光顯色10_15min，加入終止液(2M H2S04溶液)，50 μ L/孔，在酶標(biāo)儀上讀取0D450nm。以陽(yáng)性孔OD值接近1，P/N值最大時(shí)，兔抗PPV IgG和McAb的最大稀釋度為其最佳工作濃度。確定的兔抗PPV IgG包被濃度為1:3200 ;單抗稀釋倍數(shù)為1:800。雙抗夾心Elisa檢測(cè)該單抗對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株中PAT蛋白的特異性
分別將樣本液Btl76、Mon810、GA21和T25 (1%、10%、100%)作為待測(cè)樣本液進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)提取的植物蛋白(包括葉片和種子的提取液)，每孔100 μ L加于微量反應(yīng)板，4°C過(guò)夜包被，洗滌緩沖液洗滌后，以每孔100 μ L加入3% BSA封閉液，37°C封閉3h，PBST洗滌，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔100 μ L加于微量反應(yīng)板，SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為陰性對(duì)照。37°C作用60min，洗滌，加入酶標(biāo)二抗，37°C作用60min，洗滌，加入新配制的TMB底物顯色液每100 μ L，室溫避光顯色10-15min，2mol/L H2SO4 ;每孔50 μ L終止反應(yīng)，酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定0D450nm各孔的吸收值。結(jié)果見(jiàn)圖4。上述結(jié)果說(shuō)明，制備獲得的單抗與非轉(zhuǎn)bar基因植物不發(fā)生交叉反應(yīng)，對(duì)轉(zhuǎn)bar基因植物具有較強(qiáng)的特異性。該單抗僅對(duì)PAT蛋白有特異性反應(yīng)，而與Bt蛋白、EPSP無(wú)特異性反應(yīng)，說(shuō)明用這單抗具有檢測(cè)bar/PAT蛋白良好的特異性。單克隆抗體的靈敏度鑒定
樣本制備將Btl76 (bar基因陽(yáng)性材料)，與其非轉(zhuǎn)基因玉米親本籽粒，按照質(zhì)量比進(jìn)行混合，制備轉(zhuǎn)基因成分分別為100%、10%、5%、1%、0. 1%、0. 01%、0%的待測(cè)樣品。選用Mon810(未含有bar基因的轉(zhuǎn)基因玉米品系)為陰性對(duì)照，其與非轉(zhuǎn)基因玉米的混合比例同上。采用HEPES buffer直接提取蛋白，具體方法為加入預(yù)冷的提取液I mL，混懸后冰上靜置3 4 h，4°C、12 000 r/min，離心20 min，上清液置于_80°C冰箱中備用。分別將將含有10%，5%，1%，O. 1%，O. 01%, O. 001%、0%的轉(zhuǎn)bar基因成分的種子提取植物蛋白提取液，稀釋濃度為10yg/mL，作物樣本液，進(jìn)行Elisa檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(步驟同特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn))，結(jié)果見(jiàn)圖5。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用本發(fā)明獲得的單克隆抗體可以檢測(cè)限達(dá)到
O.1%，完全能夠?qū)崿F(xiàn)目前國(guó)內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因成分含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。
實(shí)施例3本發(fā)明單抗的應(yīng)用之三，采免疫層析法對(duì)植物源加工食品、飼料中的轉(zhuǎn)基因成分半定量檢測(cè)。I.膠體金標(biāo)記bar基因蛋白單克隆抗體的制備
采用改良的檸檬酸三鈉還原法，其過(guò)程為在攪拌條件下，98 mL去離子水加熱至65°C后，加入I. 5 mL 1%的氯金酸，繼續(xù)加熱，待溫度上升至95°C時(shí)，加入2mL 1%的檸檬酸三鈉，當(dāng)溶液呈酒紅色時(shí)停止加熱，冷卻后，4°C避光保存。取膠體金溶液，pH7. 2 7. 5，金顆粒大小20 30nm。將bar基因蛋白單克隆抗體O. 5mg/mLlul加入膠體200ul金溶液中，混合均勻，即得金標(biāo)鼠抗蛋白單克隆抗體溶液。經(jīng)純化及濃縮，用稀釋液稀釋4倍后備用。·
2.試紙條的組裝
整個(gè)測(cè)試條由2層吸水玻璃纖維，I層硝酸纖維素膜，吸水濾紙及白色塑料墊板組成。將吸水紙、包被NC膜(包被有單克隆抗體和羊抗兔IgG)、噴涂玻璃纖維(金標(biāo)抗體)從上到下依次固定于白色塑料板上。裁取40 mm X5 mm的吸水紙，將吸水紙、包被NC膜、噴涂玻璃纖維膜、樣品墊從上到下依次固定在帶有粘合劑的PVC背板上，切成5mm寬的試紙條，室溫干燥備用，即成測(cè)試條。將做好的測(cè)試條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)，密封貯存。3.測(cè)試樣品檢測(cè)
將樣品磨碎并加水或提取液提取，溶解獲取蛋白。檢測(cè)時(shí)，先將樣品墊浸在已提取好的蛋白樣品溶液中，樣品溶液在毛細(xì)吸收作用下由樣品墊沿NC膜向吸收墊流動(dòng)。樣品溶液中的特定蛋白在流經(jīng)結(jié)合墊時(shí)首先與其中膠體金標(biāo)記的抗體發(fā)生抗原-抗體的特異性的結(jié)合作用，流經(jīng)檢測(cè)帶時(shí)抗原-抗體復(fù)合物被固定在檢測(cè)帶上的捕獲抗體結(jié)合，聚集形成肉眼可見(jiàn)的金標(biāo)條帶，顯示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。過(guò)量的金標(biāo)抗體繼續(xù)流動(dòng)被固定在控制帶上的第二抗體結(jié)合聚集形成條帶，顯示檢測(cè)的結(jié)果有效。圖6為應(yīng)用本發(fā)明的單抗，組裝試紙條，并進(jìn)行的轉(zhuǎn)bar基因水稻和陰性水稻的檢測(cè)結(jié)果。表明該單抗可用于免疫層析法檢測(cè)轉(zhuǎn)bar基因植物材料。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
SEQUENCE LISTING<110>吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；
〈120〉一種bar/PAT蛋白單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用 〈130〉 2012 〈160〉 I
<170> PatentIn version 3.5〈210〉 I〈211〉 567〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400〉 I
cgcggatcca tgtctccgga acgtcgtccg gctgacatcc gtcgtgctac cgaagctgac60
atgccggctg tttgcaccat cgttaaccac tacatcgaaa cctctaccgt taacttccgt120
accgaaccgc aggaaccgca ggaatggacc gacgacctgg ttcgtctgcg tgaacgttac180
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tggcacgacg ttggtttctg gcagctggac ttctctctgc cggttccgcc gcgtccggtt540
ctgccggtta ccgaaatcaa gcttggg56權(quán)利要求
1.一種分泌抗6ar/PAT蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,所述雜交瘤細(xì)胞保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 6341。
2.由權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求I所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗如r/PAT蛋白單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟 基因序列的優(yōu)化和基因合成 根據(jù)Genebank的Bar基因序列，對(duì)Bar基因核苷酸序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)；在氨基酸序列不變的情況下進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使得基因序列適合于大腸桿菌表達(dá)； 2)原核表達(dá)載體構(gòu)建 將合成的基因片段連接入pET-28a載體，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞中；篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定；連入外源片段的質(zhì)粒并命名為pET-Bar ； 3)PAT蛋白表達(dá)和分離純化 將pET-Bar質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞中；用終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)已BL21(DE3)細(xì)胞中的Bar基因表達(dá)；確定目的蛋白的表達(dá)，并分離純化； 4)單抗制備 用純化bar/PAT蛋白腹腔注射BALB/C小白鼠，用福氏完全佐劑；經(jīng)15天后進(jìn)行二次相同劑量免疫，用福氏不完全佐劑；再15天后進(jìn)行三次免疫，用加倍劑量的純蛋白不加佐劑；3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合；將免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按比例在無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中混勻，離心去除培養(yǎng)基，用50% PEG3350作為融合劑融合，用DMEM培養(yǎng)基終止融合后，離心，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37°C，5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底10% -50%時(shí)，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔； 篩選出的特異性強(qiáng)陽(yáng)性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲得單抗細(xì)胞株DG-4C2 ;細(xì)胞株DG-4C2進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，用于制備單抗腹水和液氮凍存； 取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射O. 3-0. 5ml降植烷，7_10天后腹腔注入5_10 X IO5個(gè)雜交瘤細(xì)胞，小鼠腹部明顯膨大時(shí)采取腹水，離心收集上清液，即為單克隆抗體腹水；辛酸-硫酸銨鹽析法純化單克隆抗體，_70°C保存；即為可專(zhuān)一識(shí)別PAT蛋白的抗體。
4.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的用途。
5.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在抗以L-phosphiothricin為活性成分的除草劑的轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的用途。
6.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的用途。
7.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在抗以L-phosphiothricin為活性成分的除草劑的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的用途。
8.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在檢測(cè)轉(zhuǎn)如r/PAT基因植物中的用途。
9.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在檢測(cè)轉(zhuǎn)如r/PAT基因食品中的用途。
10.一種轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
11.如權(quán)利要求10所述的檢測(cè)試劑盒，所述轉(zhuǎn)基因?yàn)檗D(zhuǎn)如r/PAT基因。
12.—種ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了針對(duì)植物中抗bar/PAT基因表達(dá)蛋白的單克隆抗體。所說(shuō)的分泌單抗的細(xì)胞株4C2,其保藏編號(hào)為CGMCCNo.6341。本發(fā)明獲得了抗體效價(jià)高、特異性強(qiáng)的雜交瘤細(xì)胞株，用該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體在制備成檢測(cè)植物中bar/PAT轉(zhuǎn)基因成分的免疫膠體金試紙或Elisa試劑盒,可同時(shí)玉米、大豆、水稻、棉花及以其為原料的衍生產(chǎn)品,對(duì)轉(zhuǎn)基因篩選和轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)，具有較為廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12R1/91GK102911919SQ20121040442
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者龍麗坤, 李飛武, 張明, 宋新元, 王月華, 劉巍巍 申請(qǐng)人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司