專(zhuān)利名稱(chēng)：一株新月彎孢霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株新月彎孢霉菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
稗草(Echinoloa crusgalli (L. ) Beauv)，屬于禾本科，分布于熱帶合溫帶地區(qū)，在全國(guó)范圍內(nèi)普遍存在，是對(duì)作物危害最嚴(yán)重的雜草種類(lèi)之一。稗草是水稻田惡性雜草之一， 與水稻伴生，極難清除。亦發(fā)生于潮濕早地，危害棉花、大豆等秋熟旱地作物。通常隨著雜 草密度的增大，其競(jìng)爭(zhēng)力增強(qiáng)，作物產(chǎn)量損失增加。作為高光合速率的C4植物，在CO2濃度 較低時(shí)，稗草對(duì)CO2的利用率大于C3植物的水稻和大豆。適應(yīng)性強(qiáng)，喜溫暖濕潤(rùn)環(huán)境，既能 生長(zhǎng)在淺水中又較耐旱，并耐酸堿。繁殖力強(qiáng)，一株結(jié)子可達(dá)1萬(wàn)粒左右。由于根系龐大， 吸收肥水能力強(qiáng)，植株高于水稻而使水稻減產(chǎn)。為了防治稗草，世界上許多國(guó)家和地區(qū)，每年都要耗費(fèi)很多的人力、物力和資金。 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)稗草的防治以化學(xué)手段為主，常用的化學(xué)除草劑有丁草胺、快殺稗、敵稗、草 克星、芐嘧磺隆等。然而，大量化學(xué)除草劑的使用和農(nóng)藥的殘留問(wèn)題，已經(jīng)對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán) 重的影響。同時(shí)，化學(xué)有些除草劑對(duì)一些非靶標(biāo)生物的安全也有一定影響，對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng) 的生物多樣性造成了不利的影響。另一方面，隨著化學(xué)除草劑的大規(guī)模使用，關(guān)于抗除草劑 稗草的報(bào)道也越來(lái)越多。因此，研究和開(kāi)發(fā)安全、有效的新型生物除草劑就顯得越來(lái)越重 要。利用微生物防治稗草是生物除草劑最常見(jiàn)的手段，也將成為一條有 效的新途徑。早在1984年，Reis等人已經(jīng)從稗草上分離篩選出具有致病力的 Helminthosporiumsativum。之后陸續(xù)有研究者發(fā)現(xiàn)并分離到稗草上的病原真菌。人們對(duì) 這些稗草病原真菌的培養(yǎng)特性、致病性、毒素作用及寄主范圍等都做了大量研究。但是，到 目前為止商品化的生物除稗劑還沒(méi)有開(kāi)發(fā)成功。其主要原因是菌體本身。一些已發(fā)現(xiàn)的稗 草病原菌的分生孢子獲取比較困難，需要特殊的工藝才能生產(chǎn)出足夠使用的接種體用來(lái)防 治稗草。因此，研究、開(kāi)發(fā)一種環(huán)保、安全、低成本、高效率、使用方便的防治稗草的微生物 除草劑，來(lái)滿(mǎn)足生態(tài)效益。經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益等方面的綜合需求，具有重要的實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一株新月彎孢霉及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的新月彎孢霉為新月彎孢霉(Curvularia limata) B6，其保藏編號(hào) 為 CGMCC No. 2928。新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928的孢子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該菌株新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6已于2009年3月5日保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 2928，分類(lèi)命名為新 月彎孢霉(Curvularia lunata)，菌株名稱(chēng)為B6。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCCNo. 2928的孢子的方法。
本發(fā)明所提供的制備新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928的孢 子的方法，是用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928，培 養(yǎng)的溫度為15°C -30°C，培養(yǎng)的光照條件為黑暗，培養(yǎng)的時(shí)間為10-14天，得到新月彎孢 霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928的孢子；所述培養(yǎng)的溫度具體為15°C、28°C或 30°C，所述培養(yǎng)的時(shí)間具體為14天。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCCNo. 2928 的方法。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928的方 法，是用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928，培養(yǎng)的溫 度為15°C _30°C，培養(yǎng)的光照條件為黑暗，培養(yǎng)的時(shí)間為10-14天；所述培養(yǎng)的溫度具體為 15°C、28°C或30°C，所述培養(yǎng)的時(shí)間具體為10、11、12、13或14天。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于稗草生物防治的生物制劑。本發(fā)明所提供的用于稗草生物防治的生物制劑，其活性成分為新月彎孢霉 (Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928 和 / 或新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子。上述生物制劑具體由新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928的孢 子、表面活性劑和無(wú)菌水組成；所述新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的 孢子在所述生物制劑中的濃度為4 X IO4個(gè)孢子/ml-5 X IO6個(gè)孢子/ml，具體為1 X IO6個(gè)孢 子/ml、4X IO4個(gè)孢子/ml或5X IO6個(gè)孢子/ml ；所述表面活性劑在所述生物制劑中的濃度 為0. 5%0 (體積千分含量)。上述生物制劑中的所述表面活性劑具體為吐溫20。新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928在稗草的生物防治中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928的孢子在稗草的生物防治中 的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述生物制劑在稗草的生物防治中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928在抑制稗草生長(zhǎng)中的應(yīng)用也 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子在抑制稗草生長(zhǎng)中的 應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述生物制劑在抑制稗草生長(zhǎng)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的新月彎孢霉菌株B6 CGMCC No. 2928對(duì)稗草具有強(qiáng)烈、快速的致病力，田 間實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明菌株的孢子噴灑到稗草葉片上，7天后，稗草即出現(xiàn)斑點(diǎn)和枯死癥狀， 28天后對(duì)稗草的鮮重抑制率可達(dá)90%。本發(fā)明的真菌菌株新月彎孢霉菌株B6 CGMCC No. 2928是從田間天然發(fā)病的稗草葉片上分離得到的，沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何人工的基因修飾，因此將它們釋放到自然界中不會(huì)在成任何生態(tài)的、環(huán)境的隱患，是絕對(duì)安全的生物防治介體。本發(fā)明的新月彎孢霉菌株B6 CGMCC No. 2928及其孢子，或由其孢子制成的生物防 治劑基本上不會(huì)對(duì)非靶標(biāo)植物造成影響，對(duì)非靶標(biāo)植物，尤其是水稻的安全性極高。投放到 環(huán)境中之后不會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生影響。在環(huán)境保護(hù)方面具有積極的作用。本發(fā)明中的制備新月彎孢霉菌株B6 CGMCC No. 2928的方法操作簡(jiǎn)單，產(chǎn)孢量很 大，大大降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的生物防治劑中的可濕性粉劑劑型加工方便，開(kāi)發(fā)成本相對(duì)低。綜上所述，本發(fā)明提供了一個(gè)環(huán)保、安全、低成本、高效率、使用方便的防治稗草的 微生物真菌菌株。


圖1為新月彎孢霉菌株B6 (保藏編號(hào)CGMCC No. 2928)的孢子形態(tài)。圖2為新月彎孢霉菌株B6 (保藏編號(hào)CGMCC No. 2928)對(duì)稗草植株的致病力。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、菌株的分離和鑒定一、菌株的分離(1)野外采集自然感病的稗草葉片。(2)從病葉的病、健結(jié)合部位取下長(zhǎng)約4毫米 的組織若干片，用2% (ν/ν)次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒10分鐘，重復(fù)3次；之后用65% (ν/ν)酒精表面消毒1分鐘，重復(fù)3次。最后，用無(wú)菌水漂洗。將這些組織轉(zhuǎn)移到PDA平板 上，置于28°C培養(yǎng)箱種培養(yǎng)。(3)經(jīng)過(guò)單孢分離、純化得到純培養(yǎng)菌。二、菌株的篩選葉段法將稗草第3葉剪下，切取中部平展的4cm長(zhǎng)的葉段，將其正面朝上地貼于 水瓊脂(含苯并咪唑0. 05/L)平板表面。將待測(cè)菌株用無(wú)菌水將其孢子洗下，并調(diào)節(jié)其孢 子懸浮液濃度至1 X IO4個(gè)孢子/ml。在孢子懸浮液中加入吐溫20 (終濃度為0. 5%0)。取 孢子懸浮液1ml，用小型手持噴霧器接種于稗草葉段，分別于接種后3天和7天調(diào)查稗草也 斷發(fā)病情況。每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值。篩選結(jié)果通過(guò)葉段法檢測(cè)，結(jié)果表明接種菌株B6的稗草葉段在處理3天后明顯 開(kāi)始變黃，7天后葉段完全萎蔫，在其表面可以看見(jiàn)黑褐色的孢子堆(如圖2A所示)。該篩 選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此菌株B6能夠侵染稗草葉片，并且對(duì)稗草葉片由很強(qiáng)的破壞作用。將該菌株命名為B6。三、菌株的鑒定1、形態(tài)鑒定方法將菌株B6在PDA平板上培養(yǎng)10天，用無(wú)菌水將培養(yǎng)基表面的分生孢子洗 下，制成分生孢子懸浮液，調(diào)節(jié)濃度至1 X IO4個(gè)孢子/毫升；在400倍顯微鏡下觀察菌株B6 的分生孢子形態(tài)；對(duì)照真菌鑒定手冊(cè)，對(duì)菌株B6進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。
結(jié)果菌株B6的孢子形態(tài)如圖1所示。菌落在PDA平板上，25°C 7天直徑70毫米，質(zhì)地緊密絮狀，灰黑色，背面藍(lán)黑色。分生孢子梗側(cè)頂生，菌絲形，暗色，長(zhǎng)于30 μ m,直徑 3-3. 6 μ m0分生孢子頂生，輪狀排列，具3個(gè)橫隔，彎曲；中間細(xì)胞深褐色，其中之一顯著的 大；兩端細(xì)胞較小，色淺；18-25 X 8-12 μ m。2、rDNA的ITS區(qū)序列鑒定提取菌株B6 的基因組 DNA，用通用引物 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，)禾口 ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)得序列如序列表 中序列1所示。序列 1 所示序列提交至Ij NCBI (National Center for Biotechnology Information，美國(guó)生物信息中心，www. ncbi. nlm. nih. gov)的 GeneBank 進(jìn)行 BLAST 分析。 結(jié)果表明，該序列與AF071339(Cochlibolus lunatus UAMH 1349)的相似度達(dá)到99%。綜合以上鑒定結(jié)果，表明本發(fā)明菌株B6屬于為新月彎孢霉(Curvularia lunata)0該菌株已于2009年3月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵 編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 2928，分類(lèi)命名為新月彎孢霉(Curvularialunata)，菌株 名稱(chēng)為B6。實(shí)施例2、孢子的獲得及噴霧劑的制備
一、孢子的獲得、收集及保存(一 )方法 I將新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928接種于PDA平板培養(yǎng)基， 在28°C且黑暗條件下，培養(yǎng)14天，培養(yǎng)基表面即是菌株產(chǎn)生的分生孢子；用毛筆刷下培養(yǎng) 基表面生長(zhǎng)的孢子，收集孢子粉，直接用于制作稗草生物防治制劑，或者保存在4°C冰箱中， 需使用時(shí)取出。PDA培養(yǎng)基的組成葡萄糖20g，瓊脂15g，200g馬鈴薯的浸提液，蒸餾水定容到 IL0 200g馬鈴薯的浸提液按照如下方法制備稱(chēng)取200g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水 1000ml煮沸半個(gè)小時(shí)，紗布過(guò)濾，取濾液，即得到200g馬鈴薯的浸提液。結(jié)果孢子產(chǎn)量可達(dá)每升固體PDA培養(yǎng)基產(chǎn)孢至少5 X IO9個(gè)孢子；(二)方法 II將新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928接種于PDA平板培養(yǎng)基， 在15°C且黑暗條件下，培養(yǎng)14天，培養(yǎng)基表面即是菌株產(chǎn)生的分生孢子；用毛筆刷下培養(yǎng) 基表面生長(zhǎng)的孢子，收集孢子粉，直接用于制作稗草生物防治制劑，或者保存在4°C冰箱中， 需使用時(shí)取出。PDA培養(yǎng)基的組成與實(shí)驗(yàn)(一)中所述相同。結(jié)果孢子產(chǎn)量可達(dá)每升固體PDA培養(yǎng)基產(chǎn)孢至少5 X IO7個(gè)孢子；(三)方法III將新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928接種于PDA平板培養(yǎng)基， 在30°C且黑暗條件下，培養(yǎng)14天，培養(yǎng)基表面即是菌株產(chǎn)生的分生孢子；用毛筆刷下培養(yǎng) 基表面生長(zhǎng)的孢子，收集孢子粉，直接用于制作稗草生物防治制劑，或者保存在4°C冰箱中，需使用時(shí)取出。PDA培養(yǎng)基的組成與實(shí)驗(yàn)(一)中所述相同。結(jié)果孢子產(chǎn)量可達(dá)每升固體PDA培養(yǎng)基產(chǎn)孢至少6X IO9個(gè)孢子。方法III與方法I的結(jié)果沒(méi)有顯著性差異。二、稗草生物防治制劑_噴霧劑及其制備(一)噴霧劑的組成噴霧劑I 由新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928 的孢子、吐溫 20 和無(wú)菌水組成；所述新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子在所述噴 霧劑中的濃度為IX IO6個(gè)孢子/ml ；所述吐溫20在所述噴霧劑中的濃度為0.5%。(體積千
分含量)。噴霧劑II 由新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928 的孢子、吐 溫20和無(wú)菌水組成；所述新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子在 所述噴霧劑中的濃度為具體為4X IO4個(gè)孢子/ml ；所述吐溫20在所述噴霧劑中的濃度為 0. 5%0 (體積千分含量)。噴霧劑III 由新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928 的孢子、吐 溫20和無(wú)菌水組成；所述新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子在 所述噴霧劑中的濃度為具體為5X IO6個(gè)孢子/ml ；所述吐溫20在所述噴霧劑中的濃度為 0. 5%0 (體積千分含量)。(二)噴霧劑的制備過(guò)程向無(wú)菌水中加入吐溫20，制成吐溫20水溶液，吐溫20在吐溫20水溶液中的濃度 為0. 5% (體積千分含量)；將收集到的菌株B6分生孢子粉加入配制好的吐溫20水溶液 中，混合均勻；并用吐溫20水溶液調(diào)節(jié)孢子濃度，制成所需的噴霧劑。實(shí)施例3、生物制劑的應(yīng)用—、生物制劑對(duì)稗草的防治(一 )溫室實(shí)驗(yàn)溫室中種植稗草，得到稗草植株。在稗草處于2葉一心期之前，用實(shí)施例2中的噴 霧劑對(duì)稗草植株進(jìn)行莖葉噴霧，每處理噴液量為10ml，每盆20株稗草，4盆為1個(gè)處理。對(duì)照組以未噴霧的稗草植株作為對(duì)照，除未噴霧外，植株的生長(zhǎng)條件與實(shí)驗(yàn)組完 全相同。稗草鮮重的稱(chēng)量方法于取樣當(dāng)天分別收集不同處理稗草植株的地上部分，立即 稱(chēng)取稗草鮮重病記錄結(jié)果。鮮重抑制率的計(jì)算公式FWR = (FWck-FW) /FWckX 100%。其中FWR_鮮重抑制率； FWck-對(duì)照平均鮮重；FW-處理平均鮮重。噴霧劑I對(duì)稗草的鮮重抑制率為69. 28% ；噴霧劑II對(duì)稗草的鮮重抑制率為 39. 49% ；噴霧劑III對(duì)稗草的鮮重抑制率為85. 99%。(二)田間實(shí)驗(yàn)1、方法實(shí)驗(yàn)組分別用實(shí)施例2中的噴霧劑進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，具體步驟將收集到的菌株B6 分生孢子制成實(shí)施例2中的三種噴霧劑，用于下述實(shí)驗(yàn)。
選擇與稗草伴生的水稻田地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在稗草2葉期之前對(duì)稗草植株進(jìn)行莖葉噴 霧，每畝噴液量為30L。對(duì)照組同時(shí)以同一塊田地中未噴霧的樣方作為對(duì)照，除未噴霧外，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn) 組的條件均相同。2、結(jié)果(1)噴霧劑I結(jié)果以噴霧當(dāng)天記作第0天，噴霧后7天觀察；實(shí)驗(yàn)組稗草出現(xiàn)明顯癥狀，葉片出現(xiàn) 褐色斑點(diǎn)，有的已經(jīng)枯死；對(duì)照組的稗草葉色為正常綠色，植株健康，在葉片上也沒(méi)有發(fā)現(xiàn) 病斑出現(xiàn)。以噴霧當(dāng)天記作第0天，接種后28天調(diào)查稗草的鮮重；實(shí)驗(yàn)組其鮮重抑制率平 均為 95. 74%。取樣方法五點(diǎn)取樣法，即小區(qū)內(nèi)按照“X形”取樣。稗草鮮重的稱(chēng)量方法于取樣當(dāng)天在實(shí)驗(yàn)田中按照上述取樣方法收集小區(qū)內(nèi)樣點(diǎn) 處稗草植株的地上部分，立即稱(chēng)取稗草鮮重病記錄結(jié)果。鮮重抑制率的計(jì)算公式FWR = (FWck-FW) /FWckX 100%。其中FWR_鮮重抑制率； FWck-對(duì)照平均鮮重；FW-處理平均鮮重。同時(shí)，觀察噴霧對(duì)水稻的影響，實(shí)驗(yàn)組植株沒(méi)有發(fā)現(xiàn)被侵染的癥狀，與對(duì)照組中水 稻植株性狀相同。(2)噴霧劑II結(jié)果以噴霧當(dāng)天記作第0天，噴霧后7天觀察；實(shí)驗(yàn)組稗草出現(xiàn) 明顯癥狀，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，有的已經(jīng)枯死；對(duì)照組的稗草葉色為正常綠色，植株健康，在 葉片上也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病斑出現(xiàn)。以噴霧當(dāng)天記作第0天，接種后28天調(diào)查稗草的鮮重；實(shí)驗(yàn)組其鮮重抑制率平 均為 89. 56%。取樣方法、鮮重稱(chēng)量方法及鮮重抑制率計(jì)算方法與(1)相同。同時(shí)，觀察噴霧對(duì)水稻的影響，實(shí)驗(yàn)組植株沒(méi)有發(fā)現(xiàn)被侵染的癥狀，與對(duì)照組中水 稻植株性狀相同。(3)噴霧劑III結(jié)果以噴霧當(dāng)天記作第0天，噴霧后7天觀察；實(shí)驗(yàn)組稗草出現(xiàn) 明顯癥狀，葉片出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，有的已經(jīng)枯死；對(duì)照組的稗草葉色為正常綠色，植株健康，在 葉片上也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病斑出現(xiàn)。以噴霧當(dāng)天記作第0天，接種后28天調(diào)查稗草的鮮重；實(shí)驗(yàn)組其鮮重抑制率平 均為 90. 96%。取樣方法、鮮重稱(chēng)量方法及鮮重抑制率計(jì)算方法與(1)相同。同時(shí)，觀察噴霧對(duì)水稻的影響，實(shí)驗(yàn)組植株沒(méi)有發(fā)現(xiàn)被侵染的癥狀，與對(duì)照組中水 稻植株性狀相同。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明噴霧劑對(duì)稗草具有非常好的抑制作用，新月彎孢霉菌 株B6 CGMCC No. 2928可以被用來(lái)控制水稻田發(fā)生的稗草，并且該微生物對(duì)水稻是安全的。二、生物制劑對(duì)作物的安全性分別用實(shí)施例2中的噴霧劑進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。對(duì)13個(gè)屬的39種植物進(jìn)行生物安全實(shí)驗(yàn)，在溫室中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)植物分別為小麥、大麥、玉米、大豆、綠豆、西蘭花、反枝覽、灰綠藜、向日葵、萵苣、芥藍(lán)、油菜、白菜、蘿卜、西 瓜、甜瓜、黃瓜、絲瓜、紅小豆、蕓豆、田菁、大巢菜、苘麻、棉花、潷草、芝麻、華北剪股穎、野燕 麥、馬唐、高羊茅、黑麥草、早熟禾、花生、辣椒、番茄、煙草、爬山虎和葡萄。本實(shí)驗(yàn)中的各植物均是非常常見(jiàn)和常用的植物。其中，反枝莧、灰綠藜、潷草、大巢 菜、苘麻、野燕麥、馬唐均采自北京田間；其余植物均購(gòu)自蔬菜市場(chǎng)。具體方法為溫室中種植各植物，在各植株生長(zhǎng)至2. 5-3葉期，對(duì)每種植物的植株 進(jìn)行葉片噴霧；接種后14天，進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。以未噴霧的作為對(duì)照。結(jié)果統(tǒng)計(jì)包括以下方面在結(jié)果統(tǒng)計(jì)當(dāng)日，目測(cè)各植株在接種B6之后的癥狀，并 記錄；剪取各處理植株的地上部分，立即稱(chēng)取植株鮮重，計(jì)算鮮重抑制率。三種噴霧劑的結(jié)果相同，具體如下結(jié)果表明在大豆、綠豆和西蘭花葉片上發(fā)現(xiàn)零星的過(guò)敏性壞死病斑，但是對(duì)這幾 種作物的鮮重沒(méi)有明顯的抑制。B6菌株對(duì)如下植物均表現(xiàn)為安全反枝莧、灰綠藜、向日葵、萵苣、芥藍(lán)、油菜、白 菜、蘿卜、西瓜、甜瓜、黃瓜、絲瓜、紅小豆、蕓豆、田菁、大巢菜、苘麻、棉花、潷草、芝麻、華北 剪股穎、野燕麥、馬唐、高羊茅、黑麥草、早熟禾、花生、辣椒、番茄、煙草、爬山虎和葡萄。判斷安全的標(biāo)準(zhǔn)在植株葉片或莖桿上未發(fā)現(xiàn)病斑出現(xiàn)，同時(shí)這些植株的鮮重與 各自的對(duì)照之間差異不顯著，則判斷B6菌株對(duì)植物表現(xiàn)為安全。三、對(duì)水稻的九個(gè)品種的安全性分別用實(shí)施例2中的噴霧劑進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。水稻的九個(gè)品種分別為兩優(yōu)932、培兩優(yōu)3076、鄂中4號(hào)、鄂中5號(hào)、珍糯、鄂粳雜 1號(hào)、鄂粳雜3號(hào)、武育粳3號(hào)、秀水63。九個(gè)品種的水稻是非常常見(jiàn)和常用的。本實(shí)驗(yàn)中的九個(gè)品種均是購(gòu)自種子公司。致病力檢測(cè)方法溫室中種植各水稻品種，在各植株生長(zhǎng)至2. 5-3葉期，對(duì)各品種 植株進(jìn)行葉片噴霧；接種后14天，進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)。以未噴霧的作為對(duì)照。結(jié)果統(tǒng)計(jì)包括以下方面在結(jié)果統(tǒng)計(jì)當(dāng)日，目測(cè)各品種蜘蛛在接種B6之后的癥 狀，并記錄；剪取各處理植株的地上部分，立即稱(chēng)取植株鮮重，計(jì)算鮮重抑制率。。結(jié)果在各品種水稻葉片表面沒(méi)有發(fā)現(xiàn)由于菌株B6侵染而造成的病斑；另外通過(guò) 稱(chēng)量各水稻品種的鮮重，也表明處理鮮重與其各自對(duì)照的鮮重之間沒(méi)有顯著性差異。以上結(jié)果證明菌株不侵染水稻，對(duì)水稻沒(méi)有致病作用。表明該菌株在水稻田間使 用時(shí)具有很高的安全性。
權(quán)利要求
新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6，其保藏編號(hào)為CGMCC No.2928。
2.新月彎孢霉(Curvularialunata)B6 CGMCC No. 2928 的孢子。
3.制備新月彎孢霉(Curvularialunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子的方法，是 用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)新月彎孢霉(Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928，培養(yǎng)的溫度為 15°C _30°C，培養(yǎng)的光照條件為黑暗，培養(yǎng)的時(shí)間為10-14天，得到新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子；所述培養(yǎng)的溫度具體為15°C、28°C或30°C，所述培養(yǎng)的 時(shí)間具體為14天。
4.培養(yǎng)新月彎孢霉(Curvularialunata) B6 CGMCC No. 2928的方法，是用PDA培養(yǎng)基 培養(yǎng)新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928，培養(yǎng)的溫度為15°C-30°C，培養(yǎng) 的光照條件為黑暗，培養(yǎng)的時(shí)間為10-14天；所述培養(yǎng)的溫度具體為15°C、28°C或30°C，所 述培養(yǎng)的時(shí)間具體為10、11、12、13或14天。
5.一種用于稗草生物防治的生物制劑，其活性成分為新月彎孢霉 (Curvularialunata) B6 CGMCC No. 2928 和 / 或新月彎孢霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生物制劑，其特征在于所述生物制劑由新月彎孢霉 (Curvularia lunata)B6 CGMCC No. 2928的孢子、表面活性劑和無(wú)菌水組成；所述新月彎孢 霉(Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子在所述生物制劑中的濃度為4X IO4個(gè) 孢子/ml-5X IO6個(gè)孢子/ml，具體為IX IO6個(gè)孢子/ml、4X IO4個(gè)孢子/ml或5X IO6個(gè)孢 子/ml ；所述表面活性劑在所述生物制劑中的濃度為0. 5%0 (體積千分含量)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物制劑，其特征在于所述表面活性劑為吐溫20。
8.新月彎孢霉(Curvularialunata) B6 CGMCC No. 2928，和/或新月彎孢霉 (Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子和/或權(quán)利要求5_7中任一所述生物制劑 在稗草的生物防治中的應(yīng)用。
9.新月彎孢霉(Curvularialunata) B6 CGMCC No. 2928，和/或新月彎孢霉 (Curvularia lunata) B6 CGMCC No. 2928的孢子和/或權(quán)利要求5_7中任一所述生物制劑 在抑制稗草生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株新月彎孢霉菌株及其應(yīng)用。該菌株為新月彎孢霉(Curvularialunata)B6，其保藏編號(hào)為CGMCC No.2928。本發(fā)明的新月彎孢霉菌株B6CGMCC No.2928對(duì)稗草具有強(qiáng)烈、快速的致病力，田間實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明菌株的孢子噴灑到稗草葉片上，7天后，稗草即出現(xiàn)斑點(diǎn)和枯死癥狀，28天后對(duì)稗草的鮮重抑制率可達(dá)90％。本發(fā)明的真菌菌株新月彎孢霉菌株B6 CGMCC No.2928是從田間天然發(fā)病的稗草葉片上分離得到的，沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何人工的基因修飾，因此將它們釋放到自然界中不會(huì)在成任何生態(tài)的、環(huán)境的隱患，是絕對(duì)安全的生物防治介體。
文檔編號(hào)C12N3/00GK101812407SQ20101014943
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者倪漢文, 曹永松, 李靜, 王 琦, 韋韜 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)