專利名稱：檢測人乳頭瘤病毒的基因芯片及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種含有人乳頭瘤病毒(HPV)各亞型探針的基因芯片，本發(fā)明還涉及一種用于HPV檢測及分型的試劑盒。
背景技術(shù)：
全球每年約有51萬名婦女被診斷為宮頸癌，其是僅次于乳腺癌的人類第二大婦 科惡性腫瘤，并且其發(fā)病現(xiàn)在呈年輕化趨勢。在國內(nèi)，每年新增宮頸癌病例約13. 5萬，占全 球發(fā)病數(shù)量的1/3，約有8萬人因此病死亡。研究發(fā)現(xiàn)90%以上的宮頸癌患者伴有人乳頭瘤 病毒(human papillomaviruses, HPV)感染。宮頸癌及其癌前病變的發(fā)生是多種因素協(xié)同 作用的結(jié)果，高危型HPV感染時宮頸癌演變的始動因素，而HPV與宿主染色體的整合則是推 動宮頸癌變進(jìn)展的重要事件。因此檢測宮頸病變中HPV感染及整合情況，有利于早期發(fā)現(xiàn)、 早期診斷宮頸癌及癌前病變；及時治療控制HPV感染，可預(yù)防宮頸內(nèi)瘤變發(fā)生，能有效降低 宮頸癌的發(fā)病率和死亡率，對宮頸癌的防治有極大的臨床價(jià)值。HPV是一種具有種屬特異性的嗜上皮病毒，屬雙鏈閉環(huán)的小DNA病毒。人類是HPV 的唯一宿主，它定向感染人體皮膚及粘膜的復(fù)層鱗狀上皮內(nèi)，具有高度的宿主特異親和力。國際癌癥研究中心(IARC)專題討論會(1995年)明確提出，HPV感染是宮頸癌的 主要病因。目前鑒定出HPV亞型100余種，其中30余種與宮頸感染和病變有關(guān)，根據(jù)其致病 力的大小分為高危型和低危型兩種將HPV6、11、40、42等歸為低危型，主要引起生殖道、肛 周皮膚和陰道下部的外生殖性濕疣類病變、扁平濕疣類病變和低度子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN I)；高危型主要為 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 等，主要導(dǎo)致高 度子宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN II、CIN III)和宮頸癌的發(fā)生，尤其是HPV16和18型。因此，檢 測出樣本中的具體HPV亞型對于宮頸癌的防治具有重要的指導(dǎo)意義。HPV病毒無法在體外培養(yǎng)，在體內(nèi)也不能被誘導(dǎo)出易于檢測的免疫反應(yīng)，因此無法 采用血清學(xué)檢測的方法對其進(jìn)行診斷和分型。早期HPV的診斷主要是根據(jù)典型的臨床表現(xiàn) 和肉眼可見的尖銳濕疣；或是根據(jù)細(xì)胞學(xué)或病理學(xué)特征性改變來判斷，包括巴氏涂片(Pap Smear)和液基薄層細(xì)胞檢測(TCT)，但常會出現(xiàn)一種未確定意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞 (ASCUS)，常可掩蓋一部分有意義的組織病理學(xué)異常而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，需結(jié)合分子生物學(xué) 技術(shù)進(jìn)行確診。近年來各種分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用為檢測病毒基因組的診斷技術(shù)，其中普通及 熒光PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)，但是由于其高靈敏度，容易因非特異性擴(kuò) 增而出現(xiàn)假陽性，并且由于檢測通量的局限性不能滿足臨床的需要。HC2則是目前唯一獲得 美國FDA批準(zhǔn)的，可以應(yīng)用于臨床的診斷方法。但該方法只能檢測出樣本中是否有HPV的 感染，不能鑒定出具體的HPV病毒亞型，不利于臨床跟蹤檢查和治療。高危型HPV DNA整合到宿主基因組將導(dǎo)致宿主細(xì)胞產(chǎn)生包括抑癌基因功能缺陷、 激活癌基因、基因組不穩(wěn)定性和細(xì)胞永生化等一系列不可逆的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是宮頸癌變的重 要機(jī)制之一，其警示價(jià)值高于目前的一般HPV-DNA感染檢測，但目前市售的試劑盒所采用的探針均缺少針對HPV整合情況的檢測，此外目前已有的HPV檢測膜條并未明確分區(qū)檢測 HPV，對于普通臨床醫(yī)生容易誤診，本發(fā)明針對以上2種對臨床有重要意義的指標(biāo)進(jìn)行了檢 測和改進(jìn)，使得臨床HPV感染的檢測更豐富，更精確，更實(shí)用，更有價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種可用于檢測27種HPV亞型與人染色體整合狀態(tài)的基因芯片一種檢測人乳頭瘤病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的人乳 頭瘤病毒檢測探針，其特征在于，所述檢測探針包括SEQ ID No. 9-37的核苷酸序列HPV6 5' -AACTACATCTTCCACATACAC-3，(SEQ ID No. 9)HPVll :5，-GTCTAAATCTGCTACATACAC-3，(SEQ ID No. 10)HPV16 :5，-ATTATGTGCTGCCATATCTACTT-3，(SEQ ID No. 11)HPV18 :5，-ACAGTCTCCTGTACCTGGG-3，(SEQ ID No. 12)HPV31 :5，-CCAATATGTCTGTTTGTGCTGC-3，(SEQ ID No. 13)HPV33 :5，-GTACTAATATGACTTTATGC-3，(SEQ ID No. 14)HPV35 :5，-GTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGT-3，(SEQ ID No. 15)HPV39 :5，-TATAGAGTCTTCCATACCT-3，(SEQ ID No. 16)HPV40 :5，-CCCCACACCAACCCCATATAA-3，(SEQ ID No. 17)HPV42 :5，-CATGACTTTGTGTGCCACTG-3，(SEQ ID No. 18)HPV43 :5，-CGTTATGTGCCTCTACTGACC-3，(SEQ ID No. 19)HPV44 5' -CTACACAGTCCCCTCC-3，(SEQ ID No. 20)HPV45 5' -CTCTACACAAAATCCTGTG-3，(SEQ ID No. 21)HPV51 :5，-CTGCTGCGGTTTCC-3，(SEQ ID No. 22)HPV52 :5，-TTTATGTGCTGAGGTTAAAAAG-3(SEQ ID No. 23)HPV53 5' -CGCAACCACACAGTCTATG-3，(SEQ ID No. 24)HPV54 5' -ACAGCATCCACGCAGG-3，(SEQ ID No. 25)HPV56 5' -CAGAACAGTTAAGTAAATATGAT-3，(SEQ ID No. 26)HPV58 :5，-CACTGAAGTAACTAAGG-3，(SEQ ID No. 27)HPV59 5' -TTCTACTACTTCTTCTATTCCTAA-3，(SEQ ID No. 28)HPV66 :5，-TAATGCAGCTAAAAGC-3，(SEQ ID No. 29)HPV68 5' -TTTGTCTACTACTACTGAATCA-3，(SEQ ID No. 30)HPV70 5' -AACGGCCATACCTGCTGTATAT-3，(SEQ ID No. 31)HPV73 5' -TAGGTACACAGGCTAGTAG-3，(SEQ ID No. 32)HPV83 5' -GCTACACAGGCTAATGAATACACA-3，(SEQ ID No. 33)HPVmm4 5' -CACTGCTGTTACTCAATCTG-3，(SEQ ID No. 34)HPVCP8304 5' -GCTACATCTGCTGCT-3，(SEQ ID No. 35)GP :5，-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT-3，(SEQ ID No. 36)ALU 5' -AGCTACTCGGGAGGCTGAGGC-3，(SEQ ID No. 37)進(jìn)一步地，所述固相載體優(yōu)選為尼龍膜；所述檢測探針的3’端具有氨基標(biāo)記。
本發(fā)明的HPV常見亞型的特異性探針的設(shè)計(jì)是根據(jù)HPV Ll區(qū)域，針對不同的亞型 設(shè)計(jì)的與HPV DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的檢測探針(SEQ ID No. 9-35)。上述的27種HPV亞 型特異性探針，對應(yīng)包括了 22種高危及中危型HPV，5種低危型HPV和2種高危型HPV整合 (HPV16/HPV18)。SEQ ID No. 36是針對人GAPDH基因的探針，由于該類引物對HPV的檢測、特別是對 多亞型感染的檢測比較敏感，提高了 HPV檢測的準(zhǔn)確性。本發(fā)明中探針為3'氨基修飾探針(C7)，較5’氨基修飾探針能得到更好的雜交效^ ο本發(fā)明中27種探針的Tm在42°C _55°C之間，相對比較均一，即27種亞型探針和對應(yīng)的PCR產(chǎn)物雜交時最佳溫度條件基本一致，有利于在同一雜交溫度下以相近的效率同 步結(jié)合，使檢查的準(zhǔn)確性大大增加。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可以用一條窄線代替了一般采用的原點(diǎn)的點(diǎn)探針的方 式，使得單位面積上的所載有的信息量大大增加。本發(fā)明的基因芯片用以下方法制備而成(I)DNA探針的制備合成與HPV DNA互補(bǔ)的3，末端經(jīng)過氨基化的DNA片段；從 HPV DNA的Ll區(qū)域中挑選出特定的序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成出3’末端經(jīng)過氨 基化的DNA片段；(2)固定探針將上述探針固定在活化處理好的尼龍膜上；先對尼龍膜進(jìn)行活化 處理，然后將探針劃在膜上，通過探針末端的氨基與活化膜上的羧基形成共價(jià)結(jié)合，牢固的 將探針固定在膜上；(3)制備基因芯片利用NaOH停止反應(yīng)，封閉未結(jié)合探針的表面負(fù)電荷基團(tuán)，制得 基因芯片。本發(fā)明還提供了一種快速、高通量的檢測樣本中HPV各亞型的檢測試劑盒，包括(i)基因芯片，固定于其上的檢測探針為SEQ ID No. 9-37的核苷酸序列；(ii)檢測用引物序列，用于擴(kuò)增臨床樣本中的人乳頭瘤病毒DNA序列，所述的引 物序列為Gl :5，-CARGGACATAAYAATGGYATTTGCTG-3，(SEQ ID No. 1)G2 5' -CARGGACATAAYAATGGYATTTGTTG-3，(SEQ ID No. 2)G3 5' -GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCCTC-3，(SEQ ID No. 3)G4 5' -GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCTTC-3，(SEQ ID No. 4)16:5，-CATGCGGGTGGTCAGGTAATAT-3，(SEQ ID No. 5)18:5，-CATTTTGGGAATAATGTAATTGATTGT-3，(SEQ ID No. 6)(iii)用于擴(kuò)增臨床樣本中的人GAPDH基因，末端標(biāo)記有生物素，其引物序列為GPl :5，-GCTTCTCTGCTGTAGGCTCATT-3，(SEQ ID No. 7)GP2 5' -GTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3，(SEQ ID No. 8)(iv)人乳頭瘤病毒專用裂解液，其成分為20mmol/TriS.HCL pH8.0,0. 5 % Triton-X-100,10% chelex-100 ；(ν) PCR 反應(yīng)液；(vi)顯色試劑。
進(jìn)一步地，所述檢測用引物序列的5’和3’端均帶有生物素標(biāo)記；所述PCR反應(yīng) 液包括2X PCR Mix,20mM Tris-HCl (pH8. 9), 50mM KCl,3mM MgCl2,0. 4mM dNTPs, ImM DTT, 10% glycerol, 0. 16% NP-40,0. ImM Tween-20, 50U/mlTaq DNA polymerase。本發(fā)明的HPV檢測試劑盒中，HPV16/18與染色體整合擴(kuò)增的引物為SEQ IDNo. 5-6，可檢測2種高危型HPV整合情況。本發(fā)明的陽性對照為人GAPDH，其擴(kuò)增引物為SEQ ID No. 7_8，與HPV同時擴(kuò)增，同 時檢測。利用本發(fā)明所述的HPV檢測試劑盒檢測HPV感染，具體步驟如下(1)擴(kuò)增樣品將臨床樣本中提取的DNA通過HPV基因分型檢測試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增， 所用引物的5’和3’端均標(biāo)記有生物素，擴(kuò)增得到5’和3’端均帶有生物素標(biāo)記的DNA產(chǎn) 物；
(2)雜交將上述擴(kuò)增得到的DNA與基因芯片上分布的DNA探針進(jìn)行反應(yīng)；(3)顯色滴加顯色試劑，肉眼直接觀察結(jié)果。本發(fā)明的用于檢測HPV的試劑盒能夠快速、準(zhǔn)確的檢測出HPV感染及鑒定具體的 亞型，操作簡單，靈敏度高，對于宮頸癌的早期診斷、預(yù)防、治療和術(shù)后跟蹤具有重大意義。


圖1是使用本發(fā)明的HPV檢測試劑盒檢測臨床樣本的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 基因芯片的制備根據(jù)世界范圍內(nèi)的HPV感染研究結(jié)果和國內(nèi)的實(shí)際HPV感染情況，選出27種HPV 亞型，包括22種高危型及中危型HPV，5種低危型HPV和2種整合型(16/18型)。針對每種 HPV亞型，設(shè)計(jì)合成3’端帶有氨基的特異性探針(SEQID No. 9_37)。將膜條按要求裁剪；浸泡于新鮮配制的EDAC溶液中30min ；用蒸餾水洗膜3次， 2min/次，在濾紙上晾干，將膜片固定在濾紙上；按照膜上的格子按順序每格劃探針3次；點(diǎn) 好的膜于室溫放置20min晾干；用0. 5N NaOH浸泡膜條5min ；棄去NaOH，用蒸餾水洗滌3 次，2min/次；充分晾干后，干燥瓶內(nèi)保存?zhèn)溆谩?shí)施例2 樣品制備采用煮沸法制備和純化臨床樣本中的DNA。PCR反應(yīng)體系為20ul，具體配方如下2X PCR Mix10 μ 1Plus solution2μ 1
SeqNo. 1-2 (IOOuM) 0. 03 μ 1SeqNo. 2-4 (IOOuM) 0. 03 μ 1SeqNo. 5-6 (IOOuM) 0. 03 μ 1去離子水5. 91 μ 1模板 DNA2ul每次實(shí)驗(yàn)設(shè)立一個陰性對照，即以2ul無菌水為模板。
按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增Stagel -MV 3minStage2 :94°C 20s51°C Imin72°C 30s40cyclesStage3 :72°C 2min實(shí)施例3 :HPV DNA檢測將實(shí)施例2中擴(kuò)增得到的DNA樣品用實(shí)施例1中制備的基因芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)， 最后根據(jù)顯色情況進(jìn)行判讀，有顯色的位置表示相應(yīng)的HPV亞型。1、雜交取5ml離心管，標(biāo)明患者編號，放入同樣標(biāo)有患者編號的膜條，加入3ml雜交液 (0. 3mol/L NaCl，IOmmol/L NaH2PO4, 2mmol/L EDTA，0. 1% SDS, ρΗ7· 4)及 PCR 產(chǎn)物，沸水浴 IOmin ；51°C 雜交 lh。取50ml離心管，加入40ml B液預(yù)熱至51 "C。對照取IOul PC加入陰性對照的雜交管中進(jìn)行雜交，方法同上。2、洗膜取出膜條，移至裝有預(yù)熱洗膜液(75mmol/LNaCl, 2. 5mmol/L NaH2PO4,0. 5mmol/L EDTA，0. 1% SDS, ρΗ7· 4)的50ml離心管中，于51°C輕搖洗滌15min (每管40ml溶液，最多 可同時洗滌5張膜)。3、顯色用雜交液配制1 2000的POD (過氧化物酶)溶液(五張膜條可用6ul POD母液， 配制成12ml使用液)，室溫輕搖浸泡30min，棄去POD溶液。用雜交液室溫輕搖洗滌2次， 5min/次。用0. lmol/L檸檬酸鈉室溫洗膜l-2min,同時新鮮配制顯色液(19ml 0. lmol/L 檸檬酸鈉，Iml TMB, IOul 3% H2O2)。將膜條浸泡于顯色液中避光顯色5min左右可見斑點(diǎn) 顯現(xiàn)，將膜條浸泡于清水中結(jié)束顯色反應(yīng)，并于4°C保存。4、結(jié)果判讀作為對照，在膜條的陽性質(zhì)控PC位置會出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，提示本次雜交、顯色工作 正常，此次結(jié)果判讀視為有效。結(jié)果見圖1所示，陽性質(zhì)控PC正常高危型HPV16/HPV33/低危型HPV42 整合型HPV1權(quán)利要求
一種檢測人乳頭瘤病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的人乳頭瘤病毒檢測探針，其特征在于，所述檢測探針包括SEQ ID No.9-37的核苷酸序列HPV65’-AACTACATCTTCCACATACAC-3’(SEQ ID No.9)HPV115’-GTCTAAATCTGCTACATACAC-3’(SEQ ID No.10)HPV165’-ATTATGTGCTGCCATATCTACTT-3’(SEQ ID No.11)HPV185’-ACAGTCTCCTGTACCTGGG-3’(SEQ ID No.12)HPV315’-CCAATATGTCTGTTTGTGCTGC-3’(SEQ ID No.13)HPV335’-GTACTAATATGACTTTATGC-3’(SEQ ID No.14)HPV355’-GTGTTCTGCTGTGTCTTCTAGT-3’(SEQ ID No.15)HPV395’-TATAGAGTCTTCCATACCT-3’(SEQ ID No.16)HPV405’-CCCCACACCAACCCCATATAA-3’(SEQ ID No.17)HPV425’-CATGACTTTGTGTGCCACTG-3’(SEQ ID No.18)HPV435’-CGTTATGTGCCTCTACTGACC-3’(SEQ ID No.19)HPV445’-CTACACAGTCCCCTCC-3’(SEQ ID No.20)HPV455’-CTCTACACAAAATCCTGTG-3’(SEQ ID No.21)HPV515’-CTGCTGCGGTTTCC-3’(SEQ ID No.22)HPV525’-TTTATGTGCTGAGGTTAAAAAG-3(SEQ ID No.23)HPV535’-CGCAACCACACAGTCTATG-3’(SEQ ID No.24)HPV545’-ACAGCATCCACGCAGG-3’(SEQ ID No.25)HPV565’-CAGAACAGTTAAGTAAATATGAT-3’(SEQ ID No.26)HPV585’-CACTGAAGTAACTAAGG-3’(SEQ ID No.27)HPV595’-TTCTACTACTTCTTCTATTCCTAA-3’(SEQ ID No.28)HPV665’-TAATGCAGCTAAAAGC-3’(SEQ ID No.29)HPV685’-TTTGTCTACTACTACTGAATCA-3’(SEQ ID No.30)HPV705’-AACGGCCATACCTGCTGTATAT-3’(SEQ ID No.31)HPV735’-TAGGTACACAGGCTAGTAG-3’(SEQ ID No.32)HPV835’-GCTACACAGGCTAATGAATACACA-3’(SEQ ID No.33)HPVmm45’-CACTGCTGTTACTCAATCTG-3’(SEQ ID No.34)HPVCP83045’-GCTACATCTGCTGCT-3’(SEQ ID No.35)GP5’-GGAGCCAAAAGGGTCATCATCT-3’(SEQ ID No.36)ALU5’-AGCTACTCGGGAGGCTGAGGC-3’(SEQ ID No.37)
2.如權(quán)利要求1所述的檢測人乳頭瘤病毒的基因芯片，其特征在于，所述固相載體為 尼龍膜。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測人乳頭瘤病毒的基因芯片，其特征在于，所述檢測探針的 3’端具有氨基標(biāo)記。
4.一種用于檢測人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，包括 (i)如權(quán)利要求1-3之一所述的基因芯片；( )檢測用引物序列，用于擴(kuò)增臨床樣本中的人乳頭瘤病毒DNA序列，所述的引物序 列為Gl :5’ -CARGGACATAAYAATGGYATTTGCTG-3，(SEQ ID No. 1) G2 :5’ -CARGGACATAAYAATGGYATTTGTTG-3，(SEQ ID No. 2) G3 5' -GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCCTC-3，(SEQ ID No. 3) G4:5，-GAAAAAYAAACTGYAAATCATAYTCTTC-3，(SEQ ID No. 4) 16 5' -CATGCGGGTGGTCAGGTAATAT-3，(SEQ ID No. 5) 18 5' -CATTTTGGGAATAATGTAATTGATTGT-3’ (SEQ ID No. 6)(iii)用于擴(kuò)增臨床樣本中的人GAPDH基因，末端標(biāo)記有生物素，其引物序列為 GPl :5，-GCTTCTCTGCTGTAGGCTCATT-3’ (SEQ ID No. 7)GP2 :5’ -GTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3’ (SEQ ID No. 8)(iv)人乳頭瘤病毒專用裂解液，其成分為20mmol/TriS.HCL pH8. 0,0.5 % Triton-X-100,10% chelex-100 ；(v)PCR反應(yīng)液；(vi)顯色試劑。
5.如權(quán)利要求4所述的用于檢測人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述檢測用引 物序列的5’和3’端均帶有生物素標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求4所述的用于檢測人乳頭瘤病毒的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng) 液包括2X PCR Mix,20mM Tris-HCl (pH8. 9), 50mM KCl,3mM MgCl2,0. 4mM dNTPs, ImM DTT, 10% glycerol, 0. 16% NP-40,0. ImM Tween-20, 50U/mlTaq DNA polymerase。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測人乳頭瘤病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的人乳頭瘤病毒檢測探針，所述檢測探針包括SEQ ID No.9-37的核苷酸序列；本發(fā)明的27種HPV亞型特異性探針，對應(yīng)包括了22種高危及中危型HPV，5種低危型HPV和2種高危型HPV整合(HPV16/HPV18)。本發(fā)明還公開了一種快速、高通量的檢測樣本中HPV各亞型的檢測試劑盒，包括基因芯片，固定于其上的檢測探針為SEQ ID No.9-37的核苷酸序列；檢測用引物序列，用于擴(kuò)增臨床樣本中的人乳頭瘤病毒DNA序列；用于擴(kuò)增臨床樣本中的人GAPDH基因；人乳頭瘤病毒專用裂解液；PCR反應(yīng)液和顯色試劑。本發(fā)明的HPV檢測對于HPV的臨床診斷和宮頸癌的早期預(yù)防、診斷、治療和術(shù)后跟蹤有重大意義。
文檔編號C12Q1/70GK101818213SQ20101015198
公開日2010年9月1日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者方國偉, 石慧, 董正偉, 郭興中, 郭堯 申請人:濟(jì)南艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司