專利名稱：：一種檢測(cè)大腸桿菌的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測(cè)大腸桿菌DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：對(duì)基因(DNA)及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)，對(duì)于疾病的早期診斷和治療以及在在衛(wèi)生防疫、環(huán)境監(jiān)測(cè)、檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域都具有十分重要的意義。以往在這方面較為準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法有熒光標(biāo)記法、放射性標(biāo)記等方法，這些方法都需要復(fù)雜的操作和特殊的設(shè)備，應(yīng)用范圍很窄。1993年P(guān)E公司的Dr.KaryB.Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)，簡(jiǎn)稱PCR。隨后PCR技術(shù)大規(guī)模的應(yīng)用于生物科研和臨床治療中，對(duì)DNA的檢測(cè)進(jìn)入了新的時(shí)代，Dr.Mullis為此還獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、操作較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但由于其反應(yīng)進(jìn)行和產(chǎn)品DNA的檢測(cè)需要特殊的儀器，PCR技術(shù)的使用一直被限定在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院里。2001年日本榮研化學(xué)株式會(huì)社研制出了一種新型DNA擴(kuò)增方式，環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)DNA的高效快速擴(kuò)增，該方法反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，DNA擴(kuò)增效率高，因此在核酸檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。但是對(duì)LAMP擴(kuò)增制備的DNA產(chǎn)物使用常規(guī)的檢測(cè)方法，如電泳法，熒光染料法等，均無法排除LAMP擴(kuò)增所帶來的假陽性問題，而且需要特殊的儀器，因此限制了LAMP技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。大腸細(xì)菌(E.coli)為埃希氏菌屬(Escherichia)代表菌。一般多不致病，為人和動(dòng)物腸道中的常居菌，在一定條件下可引起腸道外感染。某些血清型菌株的致病性強(qiáng)，引起腹瀉，統(tǒng)稱致病性大腸桿菌。該菌對(duì)熱的抵抗力較其他腸道桿菌強(qiáng)，55°C經(jīng)60分鐘或60°C加熱15分鐘仍有部分細(xì)菌存活。在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，在溫度較低的糞便中存活更久。對(duì)磺胺類、鏈霉素、氯霉素等敏感，但易耐藥。目前針對(duì)大腸桿菌缺乏簡(jiǎn)單、快速、便于使用和成本低廉的檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測(cè)大腸桿菌DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測(cè)的靈敏度，是一種操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、成本低廉、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng)用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)、檢驗(yàn)檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的大腸桿菌檢測(cè)。本發(fā)明試劑盒包括兩部分1.標(biāo)記有可以識(shí)別大腸桿菌DNA特定序列的分子探針的納米金顆粒；2.可以擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。3該試劑盒的工作原理為1.納米金顆粒標(biāo)記有能識(shí)別大腸桿菌DNA特定序列的分子探針，分子探針被固定在納米金顆粒的表面。2.待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌DNA分子或大腸桿菌RNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)大量復(fù)制或先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程后大量復(fù)制，大腸桿菌DNA的目標(biāo)片段被放大109倍，產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物DNA具有多重重復(fù)序列。3.混合納米金顆粒和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系，大腸桿菌經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA與納米金顆粒上能識(shí)別大腸桿菌DNA特定序列的分子探針雜交。4.納米金顆粒沿環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體(如附圖所示)，進(jìn)而引發(fā)納米金顆粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據(jù)顏色變化可以判斷待測(cè)樣品是否具有大腸桿菌DNA或RNA。四標(biāo)記有分子探針的納米金顆粒與大腸桿菌DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA雜交示意圖，納米金顆粒沿環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體。五具體實(shí)施例方式本發(fā)明試劑盒包括2管溶液，一管中是標(biāo)記有可以識(shí)別大腸桿菌DNA特定序列的分子探針的納米金顆粒溶液50yl，一管中是250yl可以擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。納米金顆粒溶液中含有直徑為20nm的納米金顆粒，濃度為1.2nM，納米金顆粒表面標(biāo)記有巰基修飾的DNA探針。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系成分如下0.2iiMF3禾口B3弓丨物，1.6iiMFIP和BIP引物，0.8iiMLoopF和LoopB引物，0.4Mbetaine(Sigma-Aldrich,St.Louis,M0),lOmMMgS04,1.4mMdNTPs,1XThermoPolreactionbuffer(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA),80UBstDNApolymerase(NewEnglandBiolabs),6.25UAMV(Invitrogen,Carlsbad,CA)。巰基修飾的DNA探針序列5'-TGTAACGAAAGCCTGGAAAAAAAA-SH-3‘引物序列大腸桿菌的F3引物5‘-GCCATCTCCTGATGACGG-3‘大腸桿菌的B3引物5‘-ATTTACCGCAGCCAGACG-3‘大腸桿菌的BIP引物5‘-CTGGGGCGAGGTCGTGGTATTCCGAACAAACACCACGAATT-3‘大腸桿菌的FIP引物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>操作過程如下1.向裝有環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系的管中加入10iU提取的核酸或者血液樣品。2.將裝有混合物的管放入60°C的水浴中30分鐘。3.再向步驟2中的管中加入納米金顆粒溶液，此時(shí)混合后的溶液為紅色。4.60°C水浴反應(yīng)15分鐘。5.觀察反應(yīng)后管中溶液的顏色，溶液保持紅色不變則不含有大腸桿菌感染特異性的RNA或大腸桿菌DNA；如果溶液變?yōu)闇\紫色，則判定樣本中含有大腸桿菌染特異性的RNA或大腸桿菌DNA。權(quán)利要求一種用納米金顆粒檢測(cè)大腸桿菌DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下部分(1)標(biāo)記有可以識(shí)別大腸桿菌DNA特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。2.根據(jù)權(quán)利要求1，該試劑盒的工作原理為(1)用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌RNA；(2)納米金顆粒探針與環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交；(3)雜交引發(fā)納米金顆粒聚集，導(dǎo)致納米金顆粒聚集處顏色改變，以此判斷待檢測(cè)樣品是否含有大腸桿菌DNA或RNA3.根據(jù)權(quán)利要求1，納米金顆粒探針包括兩個(gè)部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識(shí)別大腸桿菌DNA的特定序列。4.根據(jù)權(quán)利要求2，待檢測(cè)樣品中環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增對(duì)象可以大腸桿菌DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。5.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在相同反應(yīng)條件下、相同反應(yīng)容器中同時(shí)進(jìn)行。6.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以發(fā)生在溶液中或者固體表面。7.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針與環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交引發(fā)溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計(jì)等光學(xué)儀器檢測(cè)。8.根據(jù)權(quán)利要求3，分子探針是指可以識(shí)別環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA,PNA，蛋白質(zhì)，化學(xué)分子。9.根據(jù)權(quán)利要求4，相同反應(yīng)條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應(yīng)時(shí)間等。全文摘要本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測(cè)大腸桿菌DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測(cè)的靈敏度，是一種操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng)用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)、檢驗(yàn)檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的大腸桿菌檢測(cè)。本發(fā)明試劑盒包括兩部分(1)標(biāo)記有可以識(shí)別大腸桿菌特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的大腸桿菌RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。文檔編號(hào)C12R1/19GK101812531SQ201010164049公開日2010年8月25日申請(qǐng)日期2010年5月6日優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日發(fā)明者孫國(guó)明申請(qǐng)人:天津朝海科技有限公司