專利名稱：：青杄轉錄因子PwHAP5及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及青桿轉錄因子PwHAP5及其編碼基因與應用。
背景技術：
：農作物的生產受到鹽堿、干旱等非生物脅迫的影響非常嚴重。全世界約有20%的耕地和50%的灌溉田受到不同程度的鹽害威脅，并有逐年增加的趨勢。我國鹽漬土地面積約為1.4億畝，占耕地總面積的近7%，此外還有鹽漬荒地2億多畝。全世界干旱和半干旱地區總面積占陸地總面積的34.9%；我國干旱、半干旱耕地面積占總面積的51%。通過轉基因提高作物的耐鹽抗旱能力是一條行之有效的辦法。因此，尋找與鹽、干旱脅迫有關的基因并研究其具體功能，以及調控途徑具有重要的理論和實踐意義。早期的耐鹽基因工程主要集中在清除自由基和增加滲透調節物質兩個方面，并且主要通過轉化單個或多個功能基因來提高轉基因植株的耐鹽能力，雖然轉基因植株的耐鹽能力有所提高，但效果不太明顯。最近，定位在細胞核內的許多調節鹽脅迫下功能基因表達的轉錄因子從許多植物中分離出來。研究結果表明通過這些轉錄因子調節后期的許多功能基因的表達，可以大大提高轉基因植株的耐鹽性，從而很大程度上促進了耐鹽基因工程方面的研究工作并取得突破性進展。HAP作為轉錄因子以其DNA結合域與一些基因啟動子區的CCAAT序列結合來調節轉錄活性。目前對HAP的轉錄調控機制的研究主要是在哺乳動物中進行的，在植物中知之甚少。研究表明HAP類轉錄因子可參與植物的多種生長發育及生理生化過程，目前還未見對于其在種子萌發過程中抗鹽耐旱方面的報道。
發明內容本發明的目的在于提供一種與植物種子萌發的蛋白。本發明提供的蛋白，與植物種子萌發相關，名稱為PwHAP5，來源于青桿(PiceawilsoniiMast·)，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物種子萌發相關的由1)衍生的蛋白質。為了使1)中的PwHAP5便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1.標簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述2)中的PwHAP5可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述2)中的PwHAP5的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。上述與植物種子萌發相關的蛋白的編碼基因(命名為PwHAP5)也屬于本發明的保護范圍之內。上述PwHAP5基因具體可為如下1)_4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；3)在嚴格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。序列1中有606個核苷酸，可編碼序列表中序列2所述的蛋白。上述嚴格條件可為用0.IXSSPE(或0.1XSSC)，0.SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65°C下雜交并洗膜。擴增上述PwHAP5基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。含有上述PwHAP5基因的表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。含有上述PwHAP5基因的重組載體也屬于本發明的保護范圍。可用現有的植物表達載體構建含有PwHAP5基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。使用PwHAP5基因構建重組表達載體時，可在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、泛素(Ubiquitin)基因啟動子(pUbi)等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此夕卜，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入在植物中表達可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。所述重組載體具體可為在pBI121的多克隆位點間插入上述PwHAP5基因得到的重組表達載體。本發明的另一目的在于提供一種培育轉基因植物的方法。本發明提供的培育轉基因植物的方法是將PwHAP5基因轉入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物的種子在逆境下的萌發率高于所述目的植物。上述的PwHAP5基因可通過上述的重組表達載體導入目的植物中的。攜帶有本發明的PwHAP5基因的植物表達載體可通過Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化到植物細胞或組織中。進一步，上述逆境是高鹽環境或干旱環境。上述高鹽環境具體可以是75mM、100mM、150mM或200mM的Nacl水溶液引起的環境。上述干旱環境具體可以是100mM、200mM、300mM或400mM的甘露醇水溶液模擬得到的干旱環境。上述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，優選是擬南芥。實驗證明本發明獲得的轉基因擬南芥的種子在培養基中Nacl濃度為75mM、100mM、150mM和200mM時的萌發率顯著高于野生型對照和空載體對照的種子萌發率。并且本發明獲得的轉基因擬南芥的種子在培養基中甘露醇濃度為100mM、200mM、300mM和400mM時的的萌發率顯著高于野生型對照和空載體對照的種子萌發率。圖1為PwHAP5基因在青桿各組織中的表達情況。圖2為轉基因擬南芥分子檢測結果。圖3野生型擬南芥和轉入PwHAP5基因的擬南芥種子在IOOmM的NaCl處理下萌發7天的觀測結果。圖4為野生型擬南芥和轉入PwHAP5基因的擬南芥種子在不同濃度NaCl處理下萌發率測定結果。圖5為野生型擬南芥和轉入PwHAP5基因的擬南芥種子在不同濃度甘露醇處理下萌發率測定結果。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、轉錄因子PwHAP5及其編碼基因的發現1、青桿花粉的處理于青桿(ZhangLY,LinJX,etal.PlantScience,2007，1721210-1217.)(PiceawilsoniiMast.，采自北京中科院植物所)花序開放的晴天上午，用消毒過的鑷子，取下黃色的花粉塊，放在白色潔凈的紙上，然后放入消毒過的干燥玻璃瓶內，置于室內陰干，再分裝于干燥的玻璃瓶內，密封，置于-20°C冰箱里貯藏備用。將貯存于_20°C冰箱的花粉轉移至4V復蘇12小時，之后再轉移到室溫繼續復蘇2小時。將復蘇后的花粉置于液體培養基中，在室溫(25士1°C)下萌發。培養基的成分包括12%蔗糖，0.03%硝酸鈣或0.1%硝酸鈣，0.01%硼酸，5mM檸檬酸-磷酸緩沖液，pH5.8。在青桿花粉培養24小時時取樣。2、總RNA的提取采用RNAeasyplantminikit(Qiagen公司產品)提取總RNA。3、使用SMARTcDNALibraryConstructionKit構建青桿花粉對照cDNA文庫以及Ca2+誘導cDNA文庫。4.使用反相Northern差異篩選法篩選有表達差異的cDNA片斷。5.將攜帶有表達差異的cDNA片斷的pTriplEx2載體轉入大腸桿菌BM25.8。6.序列測定本工作在上海生工生物工程技術服務有限公司進行。獲得一606bp的cDNA片斷(命名為PwHAP5)，核苷酸序列如序列表中序列1所示，其編碼的氨基酸序列如序列表中序列2所示。7.同源檢索利用BLAST軟件將分離出的序列與基因銀行(Genbank)中的序列進行比較，確定它屬于青桿HAP類轉錄因子基因。實施例2、通過半定量RT-PCR分析PwHAP5基因的組織表達情況分別提取青桿花粉、針葉、樹皮和根組織的RNA，反轉錄合成cDNA；然后分別以上述各組織的cDNA為模板，以5，-ATCAGCAGCAGCCCACAA-3’和5’-GGTAACCAGATGAGGGAG-3，為引物進行PCR擴增，檢測PwHAP5基因在青桿不同組織中的表達情況。同時以EFl-α基因作為內參，擴增EFl-α基因的5，引物為:5，-AACTGGAGAAGGAACCCAAG-3，，3，引物為5’-AACGACCCAATGGAGGATAC-3’。PCR反應條件先94°C預變性5min；然后94°C10sec，56°C10sec，72°C20sec,共28個循環；再72°C延伸5min。PwHAP5基因在各組織中的表達情況如圖1所示。結果表明，PwHAP5在所有組織中均有表達，根中表達量較低，針葉中表達量最高。實施例3、轉基因擬南芥的獲得及其檢測一、重組表達載體的構建1、PwHAP5基因的獲得制備下述引物對引物1:5‘-ATGGATCAGCAGCAGCCCA-3，；引物2:5‘-TCAACTGCTGCCATGAGGAGG-3，。(PiceawilsoniiMast.，)(ZhangLY,LinJX,etal.PlantScience,2007，172:1210-1217·)(記載過該材料的非專利文獻是ZhangLY，HaoHQ,LinJX.ThelocalizationofRacGTPaseinPiceawillsoniipollentubesimpliesrolesintubegrowthandthemovementofthetubenucleusandspermcells.PlantScience,2007,172:1210-1217，公眾可從北京林業大學獲得)的cDNA為模板，用上述引物1和2進行PCR擴增，測序表明擴增產物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，序列1中有606個核苷酸，可編碼序列表中序列2所述的蛋白。將序列2所示的蛋白命名為PwHAP5，將編碼序列2所示蛋白的基因命名為PwHAP5。2、重組表達載體的獲得將PwHAP5基因與pMD18_T載體相連接，操作步驟按照Takara公司產品pMD18-TVectorsystem的說明書進行；將與pMD18_T載體相連后的連接產物用限制性內切酶BamHI和SalI進行雙酶切，得到含有上述PwHAP5基因的DNA片段(該DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示)，酶切產物與經相同酶切的質粒PBI121(購自Clontech公司)相連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，并涂布在含有5-溴-4-氯_3_吲哚-β-D-半乳糖苷、X-gal和lOOug/ml氨芐青霉素的LB平板上培養過夜。挑取白色單菌落，在LB液體培養基中培養過夜并進行菌落PCR鑒定；同時堿法提取質粒DNA進行序列測定。測序結果表明，PwHAP5基因已正確連接到質粒PBI121上，將得到的重組表達載體命名為PBI121-PwHAP5。二、轉基因擬南芥的獲得用上述步驟一構建的重組表達載體PBI121_PwHAP5轉化農桿菌GV3101(記載過該材料的非專利文獻程振東，衛志明，許智宏。根癌農桿菌對甘藍型油菜的轉化及轉基因植株的再生。植物學報，1994，36(9):657-663，公眾可從北京林業大學獲得)的感受態細胞，挑取轉入重組表達載體PBI121-PwHAP5的農桿菌的單克隆接種于含50mg/L卡那霉素的LB液體培養基中，28°C振蕩培養兩天。將發酵液3000rpm/min離心5分鐘，所得農桿菌沉淀用含5%蔗糖和0.03%SilwetL-77的侵染液懸浮。采用沾花浸染法轉化哥倫比亞生態型野生型擬南芥(Col-O)(可以購自美國擬南芥生物資源中心，ABRC)，收獲該當代轉基因擬南芥植株所接的種子(T1代)，在含有50mg/LKan(卡那霉素)的MS培養基篩選萌發的種子。將在上述培養基上萌發的T1代幼苗移到培養土中，收獲種子(1~2代)，然后經相同的篩選過程得到純合的T3代轉pBI121-PwHAP5的轉基因擬南芥種子。最后將T3代轉基因擬南芥種子直接播種到培養土中，長出的T3代轉基因擬南芥植株在長日照條件下生長兩周左右開花。T3代植物分子檢測的引物如下引物1:5‘-ATGGATCAGCAGCAGCCCA-3，；引物2:5‘-TCAACTGCTGCCATGAGGAGG-3，。結果如圖2(1-6表示不同轉基因株系；-表示陰性對照；+表示陽性對照)所示，不同轉基因株系的目的基因的表達量顯著高于陰性對照(陰性對照是野生型對照及下述的空載體對照)。三、種子萌發試驗本實驗設置以下兩個對照野生型對照為轉入任何質粒的野生型擬南芥(Col-O)；空載體對照按照獲得T3代轉入重組表達載體pBI121-PwHAP5的轉基因擬南芥的方法，將空載體PBI121轉入野生型擬南芥中，然后進行繼代培養得到T3代轉pBI121的轉基因擬南芥。1、高鹽條件下的種子萌發實驗取野生型擬南芥、空載體對照和上述T3代轉入重組表達載體PBI121_PwHAP5的轉基因擬南芥的種子，在MS培養基上進行種子萌發實驗，其中培養基中含不同Nacl濃度(分別是75mM、100mM、150mM和200mM)，實驗條件是光周期為16小時光照，8小時黑暗；光強為300-400umol/M2/S；光照條件下的溫度為22_24°C，相對濕度為70-90%；黑暗條件下的溫度為18-20°C，相對濕度大于90%。在第7天統計種子萌發率，實驗重復3次，測定結果如圖3和圖4所示(WT表示野生型擬南芥，T表示轉入重組表達載體PBI121-PwHAP5的轉基因擬南芥；空載體對照和野生型對照的表型一致，故圖中未顯示空載體對照)，T3代轉入重組表達載體PBI121-PwHAP5的轉基因擬南芥的種子在培養基中Nacl濃度為75mM、100mM、150mM和200mM時的萌發率顯著高于野生型對照和空載體對照的種子萌發率。2、甘露醇模擬干旱脅迫條件下的種子萌發實驗取野生型擬南芥、空載體對照和上述T3代轉入重組表達載體PBI121_PwHAP5的轉基因擬南芥的種子，在MS培養基上進行種子萌發實驗，其中培養基中含不同甘露醇濃度(分別是0、100mM、200mM、300mM和400mM)，實驗條件是光周期為16小時光照，8小時黑暗；光強為300-400umOl/M2/S；光照條件下的溫度為22_24°C，相對濕度為70-90%；黑暗條件下的溫度為18-20°C，相對濕度大于90%。在第7天統計種子萌發率，實驗重復3次，測定結果如圖5所示(WT表示野生型擬南芥，T表示轉入重組表達載體PBI121-PwHAP5的轉基因擬南芥；空載體對照和野生型對照的表型一致，故圖中未顯示空載體對照)，T3代轉入重組表達載體PBI121-PwHAP5的轉基因擬南芥的種子在甘露醇濃度為100mM、200mM、300mM和400mM時的的萌發率顯著高于野生型對照和空載體對照的種子萌發率。權利要求一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物種子萌發相關的由1)衍生的蛋白質。2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下1)_4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1；2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；3)在嚴格條件下與1)或2)的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的基因。4.含有權利要求2或3所述基因的表達盒、轉基因細胞系或重組菌。5.含有權利要求2或3所述基因的重組載體。6.根據權利要求5所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在PBI121的多克隆位點間插入權利要求2或3所述基因得到的重組表達載體。7.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求2或3所述的編碼基因轉入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物的種子在逆境下的萌發率高于所述目的植物。8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述的編碼基因是通過權利要求4或5所述的重組表達載體導入目的植物中的。9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述逆境是高鹽或干旱環境。10.根據權利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，優選是擬南芥。全文摘要本發明公開了一種青杄轉錄因子PwHAP5及其編碼基因與應用。所述PwHAP5是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物種子萌發相關的由1)衍生的蛋白質。將PwHAP5蛋白的編碼基因導入擬南芥中后，轉基因擬南芥的種子在高鹽或干旱環境下的萌發率顯著高于野生型擬南芥。文檔編號C12N1/19GK101824080SQ20101016858公開日2010年9月8日申請日期2010年5月4日優先權日2010年5月4日發明者于彥麗,張凌云,李彥澤,鄭成超申請人:北京林業大學