專利名稱：表達豬源Cre重組酶載體pCEP4-Cre的構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種表達豬源Cre重組酶載體pCEP4_Cre的構建，是利用基因工程技 術，建立了能夠在細胞內表達Cre重組酶的質粒，用于在細胞內表達Cre重組酶并監測LoxP 元件的活性，為建立Cre-LoxP重組酶系統模型提供了監測工具，同時提供了相應的制備方 法，屬于動物驗證學領域。
背景技術：
Cre-LoxP重組酶系統在新型基因打靶中獲得廣泛應用，是條件性基因打靶、誘導 性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術核心，建立人類疾病動物模型一般需要Cre 重組酶以特定的模式表達，例如使用組織特異性啟動子。要在細胞內監測Cre-LoxP重組酶 系統的活性，需要建立能夠在細胞內有效表達Cre重組酶的載體，目前人們使用的Cre重組 酶載體多為病毒，但使用病毒載體多不具有安全性和簡便性。

發明內容
本發明的目的在于提供一種表達豬源Cre重組酶載體pCEP4_Cre的序列SEQ IDN0 1 ；本發明的另一目的在于提供一種表達豬源Cre重組酶載體pCEP4-Cre的構建，用 于鑒定具有LoxP元件的載體，可以很好的在豬細胞內表達Cre重組酶活性，起到對條件性 表達綠色熒光蛋白載體的監測作用，避免了用病毒載體作為鑒定Cre-LoxP重組酶系統的 弊端，并且pCEP4-Cre質粒可以在藥物篩選(潮霉素B)的壓力下以獨立于細胞染色體外的 游離形式存在于細胞內，避免了對基因組的插入而引起的突變。本發明技術方案是這樣實現的一種表達豬源Cre重組酶載體pCEP4-Cre的構 建，其特征在于首先采用基因工程的方法構建pCEP4-Cre質粒，并用載體pCEP4-Cre與載 體pEF-stop-eGFP共轉染進入細胞，在表達Cre重組酶的情況下，將轉入到細胞中的載體 pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的終止子刪除，使后接的報告基因eGFP得以表達，從而用于 剪切條件性表達綠色熒光蛋白載體中的LoxP元件；具體制備方法如下將LoxP錨定neo和一個終止序列基因，后接EF1 a啟動子啟動的綠色熒光蛋白基 因，當與pCEP4-Cre質粒轉入細胞后，Cre重組酶表達，將Loxp卯定的終止子刪除，使綠色 熒光蛋白表達；lpCEP4-Cre 載體構建1、1用于構建載體的Cre制備根據Genpank上Cre基因的序列及豬密碼子偏愛性設計引物，用重疊延伸PCR將 Cre基因拼接出來。將PCR得到的Cre片段的5'端引入到p⑶NA3. 1上的Hindlll酶切位 點，Cre片段的3'端引入到pCDNA3. 1上的EcoRI酶切位點。1、2 載體 pCEP4_Cre 的制備分別用Hindlll和Xhol雙酶切載體pCEP4和pCDNA3. 1-Cre,得到的Cre片段的
35'端引入到pCEP4上的HindIII酶切位點，Cre片段的3'端引入到pCEP4上的XhoI酶切 位點，并委托北京天根公司進行測序，測序完全正確。2、pEF-stop-eGFP 載體構建將已有質粒pGKneotpAlox2中兩Ioxp位點間的序列切下連接到pEF_GFP質粒中 eGFP的啟動子EFl α后。所述的LoxP元件是在細胞水平通過細胞轉染及熒光顯微觀察可以特異性檢測條 件性表達綠色熒光蛋白載體中的LoxP元件。通過以下試驗例證明本發明的效果試驗例lpCEP4_Cre、pEF-stop-eGFP載體瞬時轉染豬胚胎成纖維細胞的檢 測一熒光檢測1成纖維細胞系將所構建的載體pCEP4_Cre和pEF-stop-eGFP瞬時轉染中國長 白豬胚胎成纖維細胞。2試驗過程培養細胞至70 80%左右進行轉染，將1號孔細胞瞬時轉染 pEF-stop-eGFP質粒做為陰性對照、2號孔細胞瞬時共轉染pCEP4_Cre和pEF-stop-eGFP、 質粒、3號孔細胞瞬時轉染pEF-GFP質粒做為陽性對照、4號孔細胞作為空白對照。并用含 10% FBS血清的培養基培養。5% C02培養箱中培養24H、48H時，在熒光共聚焦顯微鏡下觀 察綠色熒光蛋白的表達情況。3試驗結果單獨轉染pEF-stop-eGFP質粒的陰性對照細胞不表達綠色熒光蛋 白，共轉染pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP質粒的細胞中Cre重組酶切除Loxp卯定的終止子 以后，綠色熒光蛋白表達。結果如下見圖ICre重組酶切除stop序列以后，綠色熒光蛋白的表達情況。 試驗例2pCEP4_Cre、pEF-stop-eGFP載體瞬時轉染豬胚胎成纖維細胞的檢 測-—RT-PCR檢測1成纖維細胞系將所構建的載體pCEP4_Cre和pEF-stop-eGFP瞬時轉染中國長 白豬胚胎成纖維細胞。2試驗過程分別取轉染48H后的細胞RNA做為模板，利用綠色熒光蛋白的引物進 行RT-PCR鑒定，同時設立不加模板只加水的空白對照；以轉染pEF-GFP載體的細胞提取總 RNA作為模板，利用綠色熒光蛋白引物所擴序列作為陽性對照；轉染pEF-stop-eGFP載體的 細胞提取總的RNA，利用綠色熒光蛋白引物所擴序列作為陰性對照。3試驗結果pCEP4_Cre、pEF-stop-eGFP載體瞬時共轉染的細胞、Cre重組酶切除 stop序列以后，RT-PCR檢測綠色熒光蛋白的表達，而瞬時轉染pEF-stop-eGFP載體的細胞 提取總的RNA，進行RT-PCR實驗無綠色熒光蛋白的表達，進一步確定綠色熒光蛋白的表達 情況。結果表明，pCEP4-Cre、pEF-stop-eGFP載體瞬時共轉染的細胞RNA為模板經PCR在 804bp處出現特異性條帶，證明綠色熒光蛋白基因得以轉錄。結果如圖2。M, MarkerIII 1、細胞克隆2、細胞克隆3、陽性對照4、陰性對照5、空白對照本發明的積極效果在于應用基因工程技術構建了一個表達Cre重組酶的質粒，并 且重組質粒pCEP4-Cre可以在藥物壓力下獨立于細胞染色體外存在，并在撤去藥物壓力后以每代10%的速率丟失；可有效的防止細胞基因組因插入外源基因而導致的基因突變；其 使用的簡便性和安全性可被廣泛的應用，為人類Cre重組酶系統的檢測發展起到積極的推 動作用。


圖ICre重組酶切除stop序列以后，綠色熒光蛋白的表達情況；A、C為豬胚胎成纖維細胞瞬時共轉染pCEP4_Cre和pEF-stop-eGFP后24H、48H熒 光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況。B、D分別A、C為細胞對照 圖2RT-PCR分析綠色熒光蛋白的表達；M :ladder、l，2、以細胞的RNA為模板的RT-PCR產物3、陽性對照4、陰性對照5、空白對照圖3pCEP4_Cre載體構建具體實施例方式下面結合附圖和實施例旨在對本發明做進一步描述，而不是以任何方式限制本發 明；在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實 現的任何改動或改變都將落入本發明的待批權利要求范圍之內。實施例lpCEP4_Cre載體的構建根據Genpank上Cre基因的序列及豬密碼子偏愛性設計引物，用重疊延伸PCR將 Cre基因拼接出來將PCR得到的Cre片段的5'端引入到pCDNA3. 1上的HindIII酶切位點，Cre片 段的3'端引入到pCDNA3. 1上的EcoRI酶切位點分別用HindIII和XhoI雙酶切載體pCEP4和pCDNA3. l_Cre，得到的Cre片段連接 線性的pCEPMinvitrogen公司)，并委托北京天根公司進行測序，測序完全正確的用于片 段的連接試驗，采用天根公司的大提質粒試劑盒大提質粒之后，用于細胞轉染。實施例2pEF-stop_eGFP載體的構建將pGKne0tpAl0X2中含有Ioxp的片段在其兩端酶切后，連入pEF_GFP載體，經酶 切鑒定和測序以后，采用天根公司的大提質粒試劑盒大提質粒之后，用于細胞轉染。實施例3細胞的轉染本發明采用脂質體介導DNA的胚胎成纖維細胞的轉染，操作步驟。按 FuGENEHD(Invitrogen)說明書進行。轉染前一天將原代培養的胚胎成纖維細胞用無抗生素 的培養液復蘇至4個60mm平皿中，當細胞達到70 80%匯合時即可進行細胞轉染。實施例4細胞水平鑒定_熒光觀察為了驗證所構建的載體是否可以有效的發揮Cre重組酶的活性，將轉染的細胞培 養24H、48H時使用熒光顯微鏡觀察。實施例5細胞水平鑒定-RT-PCR轉染后48H所獲得的細胞，提取細胞總的RNA進行RT-PCR反應，進一步鑒定綠色 熒光蛋白的表達。提取RNA和RT-PCR反應均采用Bioer Technology的Simply P總RNA 提取試劑盒提取試劑盒和一步法RT-PCR反應試劑盒。具體操作步驟參照說明書。RT-PCR
5反應的引物為綠色熒光蛋白的上游和下游引物El. 5' -GGC GCG CCC GCC ACC ATG GTG AGC AAG ；E2. 5' -GGC GCG CCT TAT CTA GAT CCG GTG GAT.以瞬時轉染pEF-stop-eGFP載體的細胞總RNA為模板，利用綠色熒光蛋白引物所 擴序列作為陰性對照，同時設立不加模板只加水的空白對照，以瞬時轉染pEF-GFP載體的 細胞總RNA為模板，利用綠色熒光蛋白引物所擴序列作為陽性對照。
權利要求
一種表達豬源Cre重組酶載體pCEP4 Cre的序列SEO ID NO1。
2.一種表達豬源Cre重組酶載體pCEP4-Cre的構建，其特征在于首先采用基因工程 的方法構建pCEP4-Cre質粒，并用載體pCEP4_Cre與載體pEF-stop-eGFP共轉染進入細胞， 在表達Cre重組酶的情況下，將轉入到細胞中的載體pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的終止 子刪除，使后接的報告基因eGFP得以表達，從而用于剪切條件性表達綠色熒光蛋白載體中 的LoxP元件；具體制備方法如下將LoxP錨定neo和一個終止序列基因，后接EFl α啟動子啟動的綠色熒光蛋白基因， 當與pCEP4-Cre質粒轉入細胞后，Cre重組酶表達，將Loxp卯定的終止子刪除，使綠色熒光 蛋白表達；
3.根據權利要求2所述的一種表達豬源Cre重組酶載體pCEP4-Cre的構建，其特征在 于pCEP4-Cre載體在動物細胞中，能夠游離于細胞染色體外，不整和到細胞基因組中，同時 該載體表達的Cre重組酶能夠切除動物細胞的基因組中或基因組外的Ioxp元件。
全文摘要
本發明涉及一種表達豬源Cre重組酶載體pCEP4-Cre的構建，其特征在于首先采用基因工程的方法構建pCEP4-Cre質粒，并用載體pCEP4-Cre與載體pEF-stop-eGFP共轉染進入細胞，在表達Cre重組酶的情況下，將轉入到細胞中的載體pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的終止子刪除，使后接的報告基因eGFP得以表達，從而用于剪切條件性表達綠色熒光蛋白載體中的LoxP元件；其應用基因工程技術構建了一個表達Cre重組酶的質粒，并且重組質粒pCEP4-Cre可以在藥物壓力下獨立于細胞染色體外存在，并在撤去藥物壓力后以每代10％的速率丟失；可有效的防止細胞基因組因插入外源基因而導致的基因突變；其使用的簡便性和安全性可被廣泛的應用，為人類Cre重組酶系統的檢測發展起到積極的推動作用。
文檔編號C12N15/63GK101892257SQ20101018508
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月28日 優先權日2010年5月28日
發明者周楊, 張明軍, 朱建國, 李莉, 歐陽紅生, 段新平, 毛丹, 王鐵東, 聶代邦, 逄大欣 申請人:吉林大學