專利名稱：肌生成抑制素mstn基因敲除豬的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肌生成抑制素MSTN基因敲除豬的建立，屬于動物科學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肌肉的生長受到多種因素的調(diào)控，其中肌生成抑制素起著主要的負調(diào)控作用。肌 生成抑制素(My0Statin，MSTN)或生長分化因子_8 (⑶F_8)，屬TGF-β (轉(zhuǎn)化生長因子-β) 超家族，是肌肉的主要負調(diào)控因子。敲除肌生成抑制素基因的小鼠肌纖維發(fā)生廣泛性的增 生和肥大，骨骼肌量顯著增加，平均體重超過正常小鼠的261 %，但不存在其它表型差異。而 且肌生成抑制素基因敲除小鼠肌量增加的表型可終生維持，年老的肌生成抑制素基因敲除 鼠比對照鼠肌肉量與肌力都增加。培育瘦肉率高、節(jié)糧型豬品種是國家的重大需求，瘦肉率的提高一直是遺傳育種 的重點與難點。因此，通過對肌生成抑制素的突變、缺失等遺傳修飾，結(jié)合克隆豬制備技術(shù)， 獲得肌生成抑制素基因缺失克隆豬，能在較短的時間內(nèi)培育出瘦肉率高、飼料轉(zhuǎn)化率高、繁 殖性能好、節(jié)糧型豬種。此方面的研究國內(nèi)外未見相同報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種肌生成抑制素MSTN基因敲除豬的建立，基因工程技 術(shù)構(gòu)建pSSC-Larm-Sarm質(zhì)粒。其中Larm約4. 3kb, Sarm約1. 4kb,分別是豬MSTN的同源 序列，作為同源重組序列。本發(fā)明的另一個目的在于提供將構(gòu)建的MSTN基因敲除的載體轉(zhuǎn)染至豬胎兒成纖 維細胞的方法，即在細胞水平通過細胞轉(zhuǎn)染及細胞篩選技術(shù)篩選出MSTN基因敲除的豬胎 兒成纖維細胞；并利用體核移植和胚胎移植技術(shù)制備MSTN基因敲除豬的方法；并利用PCR 的方法鑒定基因敲除豬。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的肌生成抑制素MSTN基因敲除豬的建立，MSTN基 因敲除載體是豬MSTN的同源序列，作為同源重組序列，其特征在于具體制備方法如下1、基因打靶載體的構(gòu)建以豬基因組DNA為模板，用引物P1、P2、P3、P4 (如表1)，PCR擴增1. 4kb和7. 5kb片 段。分別連接至PGEM-T載體；然后用BamH I和Hind I雙酶切重組質(zhì)粒pGEM-Sarm和通用基 因敲除載體PSSC-9載體質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳后，分別回收1. 4kb目的片段和7. 5kb的載 體片段。用T4DNA連接酶連接目的片段和載體片段，得到中間重組質(zhì)粒pSSC-Sarm。再用Sal I和Xho I分別酶切pSSC-Sarm重組質(zhì)粒和純化的同源長臂PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后， 回收8. 9kb載體片段和4. 3kb的目的片段，T4DNA連接酶連接目的片段和載體片段，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌HBlOl宿主菌，隨機挑選單菌落，經(jīng)長臂PCR鑒定初步篩選陽性克隆菌，為確保長臂 插入pSSC-Sarm載體中，利用長臂內(nèi)部擴增引物進行PCR反應(yīng)，同時對該質(zhì)粒上的短臂也進 行PCR反應(yīng)，均表現(xiàn)出陽性，表明成功構(gòu)建豬肌生成抑制素基因敲除載體pSSC-Larm-Sarm。表1引物序列
3
引物 Pl 5' -TAGCATCCGTCGACTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAG-3'，含 Sal I 酶切 位點(下劃線部分，以下同)引物 P2 5' -CATAGCCGCTCGAGTGGTGGCTAAATATGTCTGATGGG-3‘，含 Xho I 酶切位
占引物 P3 5' -GGATCCCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGCTC-3'，含 BamH I 酶切位點引物P4 5' -MGCTTACAGCCATCATGAATCCATAAGTGAATG-3'，含Hind III 酶切位點2、MSTN基因敲除豬胎兒成纖維細胞的構(gòu)建本發(fā)明將構(gòu)建MSTN基因敲除的載體線性化后，利用FuGENE HD轉(zhuǎn)染長白豬胎兒成 纖維細胞，用G418篩選7 9天后，獲得抗性細胞。對所獲的細胞在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和 翻譯水平進行鑒定，獲得了 MSTN基因敲除的豬的成纖維細胞。3、利用體細胞核移植技術(shù)構(gòu)建MSTN基因敲除豬本發(fā)明采用體細胞核移植技術(shù)，以長白豬母豬做代孕母豬，構(gòu)建MSTN基因敲除 豬，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因豬為白色。4、對MSTN基因敲除豬用PCR方法通過鑒定引物spl、sp7、sp2、sp8、spnl、spn2、 spn3、spn4進行鑒定。本發(fā)明采用PCR法驗證豬MSTN基因敲除情況。以下試驗例證明本發(fā)明的效果試驗例1基因打靶載體的鑒定1、豬myostatin基因敲除載體構(gòu)建策略圖(如圖1)2、同源長臂的PCR電泳圖譜(圖2)3、同源短臂的PCR電泳圖譜(圖3)4、pSSC-Larm-Sarm 的 PCR 鑒定(圖 4)試驗例2細胞水平的鑒定-PCR1成纖維細胞系將所構(gòu)建的載體pSSC-Larm-Sarm穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中國長白豬胎兒成纖 維細胞。2試驗過程取新生豬臍帶提取的基因組作為模板，同時設(shè)立非轉(zhuǎn)基因豬的基因組 為模板和不加模板只加水的陰性對照。3試驗結(jié)果外側(cè)引物在2100bp處出現(xiàn)特異性條帶，結(jié)果如圖5 ；內(nèi)側(cè)引物在 1553bp處出現(xiàn)特異性條帶，結(jié)果如圖6，證明MSTN基因得以敲除。試驗例3基因敲除豬的制備1細胞所構(gòu)建MSTN基因敲除的豬胎兒成纖維細胞2動物健康的長白母豬(白色)3試驗過程采用體細胞核移植技術(shù)，構(gòu)建MSTN基因敲除豬。4試驗結(jié)果2009年12月10日，耳號為0953的長白豬(白毛)懷孕116天，順利產(chǎn)下3頭表 型正常、健康的長白豬。平均體重為1.2kg。2009年12月11日，耳號為1324的長白豬(白色)懷孕115天，順利產(chǎn)下2頭健 康的白色小豬。平均體重為1.3kg。結(jié)論本發(fā)明掌握了基因敲除豬的制備技術(shù)，成功制備了 MSTN基因敲除豬
本發(fā)明的積極效果在于應(yīng)用基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以獲得高瘦肉率動物，構(gòu) 建MSTN基因敲除模型動物，為進一步研究該基因的功能具有重要意義。


圖1、豬myostatin基因敲除載體構(gòu)建策略2、同源長臂的PCR電泳圖譜圖3、同源短臂的PCR電泳圖譜圖 4、pSSC-Larm-Sarm 的 PCR 鑒定圖5、兩套引物外側(cè)PCR結(jié)果。M=MarkerIII 1 :1 號豬；2 :2 號豬；3 :3 號豬；4 :4 號豬；5 :5 號豬；非非轉(zhuǎn)基因豬；水水為模板。圖6、兩套引物內(nèi)側(cè)PCR結(jié)果。M=MarkerIII 1 :1 號豬；2 :2 號豬；3 :3 號豬；4 :4 號豬；5 :5 號豬；非非轉(zhuǎn)基因豬；水水為模板。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。實施例1引物設(shè)計與合成依據(jù)已完成的測定豬肌生成抑制素基因組序列，結(jié)合GenBank上提供的牛肌生成 抑制素基因序列(6691bp，序列號:AF320998)，利用Oligo 6.0軟件設(shè)計兩對引物。引物Pl 在上游啟動序列上，引物P2在內(nèi)含子II上游5'端，擴增同源長臂(long arm，簡稱Larm， 約4.3kb)；引物P3在外顯子III下游3'端，引物P4在肌生成抑制素基因編碼區(qū)域的3' 外端，擴增同源源短臂(Short arm，簡稱SarmJA 1. 4kb)。兩對引物在豬肌生成抑制素基因 組序列上的相對位置如表1所示，均由賽百盛生物工程公司合成。實施例2同源短臂的制備2. 1同源短臂PCR擴增以豬基因組DNA為模板，用引物P3、P4進行PCR擴增，反應(yīng)體系模板1 μ 1 (50 IOOng)，10XPCR Buffer 2. 5μ 1, dNTPs (25mM) 2 μ 1，上下游引物(IOpM)各 IyUnddH2O 至25 μ 1。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min后，加入ExTaq酶1 μ 1，94°C變性30sec，6(TC退火 30sec，72°C延伸30sec，30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。取PCR產(chǎn)物5μ 1進行瓊脂糖 凝膠電泳鑒定。2.2同源短臂的克隆將短臂PCR產(chǎn)物50μ 1經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，對特異性目的DNA條帶進行切膠回 收(用天根公司的DNA快速回收/純化試劑盒回收，方法參見說明書)。回收產(chǎn)物與pGEM^T 載體4°C下連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-Sarm。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入按常規(guī)方法制備的新鮮感受 態(tài)DH5a大腸桿菌中。2. 3陽性克隆的篩選和序列測定將轉(zhuǎn)化的受體菌涂布于含氨芐青霉素(Amp)、X-gal和IPTG的LB固體平板上， 37°C培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單菌落，接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12h。用堿裂解法小提質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶鑒定、PCR鑒定均為陽性的重組克隆菌進行核酸序列測定。實施例3同源長臂的PCR擴增由于同源長臂片段較長，難于克隆，故本實驗通過在長臂酶切位點前加保護性堿 基的方法來繞過克隆的過程。3. 1同源長臂的PCR擴增以豬基因組DNA為模板，用引物P1、P2進行長片段PCR反應(yīng)DNA模板1 yl (50 lOOng)，10XPCR Buffer 2. 5u 1, dNTPs (25mM) 2 u 1,引物(lOpM)各 liU，力口 ddH20 到 25 u 1。反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5min，加入 LA Taq 酶 1 ii 1，94°C變性 2min，64°C退火 45sec， 72°C延伸2min，30個循環(huán)，最后72°C延伸20min。取PCR產(chǎn)物5 yl進行0. 5%瓊脂糖凝膠 電泳鑒定。3. 2同源長臂的PCR產(chǎn)物的酶切將50 ill的PCR產(chǎn)物純化(用TaKaRa公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，方法參見 說明書)，之后直接進行酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，對特異性目的DNA條帶進行切膠回收 (方法同前)。即可用于下一步實驗需要。3. 3同源長短臂序列測定及分析同源短臂將重組質(zhì)粒pGEM-Sarm按ABI BigDye Terminator Kit操作說明進行測 序；同源長臂用PCR產(chǎn)物直接測序。利用生物信息學(xué)軟件WDNASIS v2.5對DNA序列測定結(jié) 果與所設(shè)計的DNA序列進行同源性分析。測序完全正確的用于片段的連接試驗。實施例4pSSC-Larm_Sarm載體的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pGEM-Sarm及pSSC_9載體分別用BamHI和Hindlll消化后，回收各目 的片段，用T4 DNA ligase連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pSSC-Sarm。經(jīng)PCR和BamHI+Hindlll酶切雙 鑒定后的陽性菌進行培養(yǎng)，提大量質(zhì)粒，用Sail和Xhol雙酶切回收約8. 9kb的片段，與經(jīng) 實施例3中3. 2處理的片段連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pSSC-Larm-Sarm，即構(gòu)建出豬肌生成抑制素基 因敲除載體，構(gòu)建過程如圖1所示。采用天根公司的大提質(zhì)粒試劑盒大提質(zhì)粒之后，用Sfil 單酶切線性化，用于細胞轉(zhuǎn)染。實施例5細胞的轉(zhuǎn)染與篩選本發(fā)明采用FuGENE HD介導(dǎo)DNA的豬胎兒成纖維細胞的轉(zhuǎn)染，操作步驟按 FuGENEHD說明書進行。轉(zhuǎn)染前一天將原代培養(yǎng)的胚胎成纖維細胞用無抗生素的培養(yǎng)液復(fù)蘇 至100mm平皿中，當(dāng)細胞達到80% 90%融合時即可進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時后，細胞 經(jīng)胰酶消化1 26傳代。轉(zhuǎn)染48小時后，加入G418選擇培養(yǎng)基(濃度為300i!g/ml)。待 有細胞單個克隆集落出現(xiàn)時，去掉培養(yǎng)液，用39°C的PBS洗2遍，將自制的玻璃細胞克隆環(huán) 套在細胞集落上，加適量的胰酶于克隆環(huán)內(nèi)，消化約1分鐘后，加入篩選培養(yǎng)基終止反應(yīng)。 用移液器小心吹打細胞后轉(zhuǎn)入24孔板擴大培養(yǎng)，待長滿以后，轉(zhuǎn)入6孔細胞培養(yǎng)板中擴大 培養(yǎng)。待細胞長滿以后，一部分細胞用于細胞鑒定，一部分細胞凍存。實施例6細胞水平的鑒定-PCR表2PCR引物設(shè)計引物名稱 引物序列spl5， -CTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCAT-3，0076
0077
0078
0079
0080 0081 0082
0083
0084
0085
0086
0087
0088
0089
0090
0091
0092
0093
0094
0095
0096
0097
0098
氺10，
0099
0100 0101 0102
0103
0104
0105
0106
0107
0108
0109
0110 0111 0112
sp7
sp2
sp8
spnl
spn2
spn3
spn4
5’ -GTTGGCTACCCGTGATATTGCTG-3’ 5’ -CCATGTCCCTGTGGCTTAGTAGAAC-3’ 5， -CCAAACTCGGATAAATGTGCCTGT-3’ 5’ -ACATCGCATCGAGCGAGCACGTACT-3’ 5’ -ATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGT-3' 5 ’ -ACCATTAGCATATGGAGTTTTAAGACCACT-3， 5， -ACAGGAGTCTCACTCTAGTAGCAGACT-3，
反應(yīng)條件如下表
1、將細胞裂解液作為初始模板進行第-表3第一輪PCR反應(yīng)體系
Cell lysis
Spl
Sp8
Ex taq dNTP (2. 5mM) 10*buffer
ddH20 94 °C (94 °C 51 °C 72 V
2ul 0. 3ul 0. 3ul
0.5ul
1.6ul 2ul
13. 3ul
Cell lysis Spnl Spn4 Ex taq dNTP (2. 5mM) 10*buffer
ddH20
5min
30s
30s
2min30s)
P4°c。c。c
4 9 5 2 9(57
-輪 PCR
2ul 0. 3ul 0. 3ul
0.5ul
1.6ul 2ul
13. 3ul 5min 30s 30s
2min30s)
35 個 cycles 12°C forever
35 個 cycles 12°C forever
2、將上一步PCR產(chǎn)物分別進行10倍和100倍稀釋作為本輪PCR的模板，標(biāo)號為 1*100，1，*10，1，*100 等。
PCR體系及條件如下 表4第二輪PCR反應(yīng)體系
1*10/1*100
Sp2
Sp7
Ex taq dNTP (2. 5mM) 10*buffer
ddH20 94 °C (94 °C 52 °C 72 V
水
0. 2/0. 5ul 0. 3ul 0. 3ul
0.3ul
1.6ul 2ul
15.3/15ul
1' *10/1' Spn2 Spn3 Ex taq dNTP (2. 5mM) 10*buffer ddH90
*100
0. 2/0. 5ul 0. 3ul 0. 3ul
0.3ul
1.6ul 2ul
15.3/15ul
5min
30s
30s
2min30s)
P4°c。cc 4 9 8 2 9(57
5min
30s
30s
lmin50s)
35 個 cycles
35 個 cycles12°C forever將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收以后，連接到PMD-18T simple上，通過轉(zhuǎn)化實驗， 獲得重組菌后，送北京天根公司測序。待序列測序完畢在NCBI上，與豬的基因組和所構(gòu)建 的載體序列進行比較分析。實施例7通過體細胞核移植獲得轉(zhuǎn)基因豬步驟分為1、豬卵母細胞的采集和成熟培養(yǎng)及去核操作從屠宰場收集豬的卵巢，置于25_37°C含有雙抗生理鹽水的保溫瓶中，在2小時內(nèi) 返回實驗室。用37°C含雙抗的生理鹽水洗滌數(shù)次，將卵巢置于37°C水浴鍋中。用帶有18 號針頭的20ml注射器抽吸卵巢上2-8mm的卵泡，在實體顯微鏡下用撿卵針挑選出細胞質(zhì)均 勻，并包裹有兩層以上致密卵丘細胞的卵丘_卵母細胞復(fù)合體(COCs)，在成熟培養(yǎng)基中成 熟以后，采用盲吸的方法去除卵丘細胞，準(zhǔn)備核移植。2、供體細胞的制備將所構(gòu)建的條件性表達綠色熒光蛋白的豬胚胎成纖維細胞從液氮罐中取出，迅速 進行復(fù)蘇。復(fù)蘇后的細胞完全匯合后用于核移植操作。在進行核移植操作前，將供體細胞 從培養(yǎng)箱中取出，進行消化吹打制成細胞懸液。將細胞懸液分裝到1. 5ml的離心管中，用含 10%血清的TL-HEPES洗一遍，然后250g離心10分鐘，重選在0. 5ml的DPBS中，備用。放 入4°C冰箱內(nèi)備用。進行核移植操作前20min將細胞從冰箱中取出放入38. 5°C培養(yǎng)箱中溫 熱。用時用移液槍吸取離心管底部10ul的細胞懸液加入已經(jīng)做好的操作滴內(nèi)，覆蓋上石蠟 油。3、卵母細胞的注核操作在顯微操作臺上的培養(yǎng)皿中的中間的滴內(nèi)放去核的卵母細胞，每次放10-15個， 另外幾個放入供體細胞。首先用內(nèi)徑為10-15i!m的注核針吸取小而圓的供體細胞，然后移 動操作臺使卵母細胞處在視野下面，用固定針固定卵母細胞，用注核針撥動卵母細胞，找到 去核時在透明帶留下的針口，將注射針插入到透明帶下，將供體細胞注入卵母細胞的卵周 隙內(nèi)，構(gòu)成一個卵_供體細胞復(fù)合體，而后緩慢抽出注核針，并對透明帶進行整理，使體細 胞與卵母細胞膜相互接觸，便于隨后重組胚的融合。4、融合將操作完畢的重構(gòu)復(fù)合體移入融合液，洗滌三次，然后移入融合槽中，使去核卵 母細胞和供體細胞的接觸面與電流方向垂直，然后進行電擊。激活后的復(fù)合體迅速移入 NCSU-23培養(yǎng)液中洗滌3-5次。然后放置入培養(yǎng)箱中，38. 5°C,5%C02,100%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5、激活和胚胎培養(yǎng)卵一供體細胞復(fù)合體在 15 yM calcium ionomycin (Calbiochem, San Diego, CA) 中孵育20分鐘，然后放入含1. 9mM 6- 二甲基氨基嘌呤(DMAP)的CR2培養(yǎng)基中孵育3_4小 時，然后在含有TL-HEPES的35mm的培養(yǎng)皿中洗一遍之后，在含有放置含有3mg/ml BSA的 CR2的培養(yǎng)基中孵育48小時，孵育過后，轉(zhuǎn)移到含0. 4% BSA的NCSU23的培養(yǎng)集中繼續(xù)孵 育24小時，之后培養(yǎng)，采用含10%的NCSU23的培養(yǎng)基培養(yǎng)。6、胚胎移植
選擇發(fā)情合適的母豬，進行麻醉以后。用清水清洗手術(shù)部位及四周，消毒后蓋上創(chuàng) 巾布并暴露手術(shù)部位，用手探入腹腔，尋找到子宮和卵巢，固定輸卵管，將裝有胚胎的外徑 為2 3mm的玻璃管慢慢從輸卵管口插入，經(jīng)過1 2個彎曲之后小心將胚胎吹入輸卵管 內(nèi)，并慢慢撤出玻璃管，我們在移植過程中只對一側(cè)輸卵管進行胚胎移植。將輸卵管傘重新 包住卵巢，回復(fù)子宮和輸卵管到腹腔，并撒入抗生素抗菌消炎。常規(guī)縫合腹腔，術(shù)后將受體 母豬單獨隔離，連續(xù)4天使用抗生素消炎。每天仔細觀察記錄受體豬的生理情況，做好發(fā)情 觀察。實施例8克隆豬的鑒定-PCR鑒定提取臍帶的基因組，將臍帶剪下以后，用含雙抗的PBS清洗數(shù)遍，洗去血污及贓 物。然后利用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(離心 柱型)目錄號DP304提取基因組。所提取的基因組用于PCR反應(yīng)，以非轉(zhuǎn)基因豬的基因組 和水為陰性對照。
9
權(quán)利要求
肌生成抑制素MSTN基因敲除豬的建立，MSTN基因敲除載體是豬MSTN的同源序列，作為同源重組序列，其特征在于具體制備方法如下(1)、基因打靶載體的構(gòu)建以豬基因組DNA為模板，用引物P15′ TAGCATCCGTCGACTATAAAAGATTCACTGGTGTGGCAAG 3′、P25′ CATAGCCGCTCGAGTGGTGGCTAAATATGTCTGATGGG 3′、P35′ GGATCCCCAAAAGATATAAGGCCAATTACTGCTC 3′、P45′ AAGCTTACAGCCATCATGAATCCATAAGTGAATG 3′，PCR擴增1.4kb和7.5kb片段；分別連接至pGEM T載體；然后用BamH I和Hind I雙酶切重組質(zhì)粒pGEM Sarm和通用基因敲除載體pSSC 9載體質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳后，分別回收1.4kb目的片段和7.5kb的載體片段；用T4DNA連接酶連接目的片段和載體片段，得到中間重組質(zhì)粒pSSC Sarm；再用Sal I和Xho I分別酶切pSSC Sarm重組質(zhì)粒和純化的同源長臂PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后，回收8.9kb載體片段和4.3kb的目的片段，T4 DNA連接酶連接目的片段和載體片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101宿主菌，隨機挑選單菌落，經(jīng)長臂PCR鑒定初步篩選陽性克隆菌，為確保長臂插入pSSC Sarm載體中，利用長臂內(nèi)部擴增引物進行PCR反應(yīng)，同時對該質(zhì)粒上的短臂也進行PCR反應(yīng)，均表現(xiàn)出陽性，表明成功構(gòu)建豬肌生成抑制素基因敲除載體pSSC Larm Sarm。(2)、MSTN基因敲除豬胎兒成纖維細胞的構(gòu)建將構(gòu)建MSTN基因敲除的載體線性化后，利用FuGENE HD轉(zhuǎn)染長白豬胎兒成纖維細胞，用G418篩選7～9天后，獲得抗性細胞；對所獲的細胞在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平進行鑒定，獲得了MSTN基因敲除的豬的成纖維細胞；(3)、利用體細胞核移植技術(shù)構(gòu)建MSTN基因敲除豬采用體細胞核移植技術(shù)，以長白豬母豬做代孕母豬，構(gòu)建MSTN基因敲除豬，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因豬為白色。(4)、對MSTN基因敲除豬用PCR方法通過鑒定引物sp1、sp7、sp2、sp8、spn1、spn2、spn3、spn4進行鑒定；引物名 引物序列稱sp1 5’ CTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCAT 3’sp7 5’ GTTGGCTACCCGTGATATTGCTG 3’sp2 5’ CCATGTCCCTGTGGCTTAGTAGAAC 3’sp8 5’ CCAAACTCGGATAAATGTGCCTGT 3’spn15’ ACATCGCATCGAGCGAGCACGTACT 3’spn25’ ATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGT 3’spn35’ ACCATTAGCATATGGAGTTTTAAGACCACT 3’spn45’ ACAGGAGTCTCACTCTAGTAGCAGACT 3’
2.一種肌生成抑制素MSTN基因敲除豬的基因打靶載體序列SEQ ID NO. 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因打靶載體序列，其特征在于所述的基因打靶序列中用 5% -100%序列進行同源重組制備肌生成抑制素基因敲除豬。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肌生成抑制素MSTN基因敲除豬的建立，其特征在于具體制備方法如下1、基因打靶載體的構(gòu)建；2、MSTN基因敲除的豬胎兒成纖維細胞的構(gòu)建；3、利用體細胞核移植技術(shù)構(gòu)建MSTN基因敲除豬；4、對MSTN基因敲除豬的鑒定其應(yīng)用基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以獲得高瘦肉率動物，構(gòu)建MSTN基因敲除模型動物，為進一步研究該基因的功能具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK101892264SQ201010185038
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者周楊, 周焱, 朱建國, 李占軍, 歐陽松應(yīng), 歐陽紅生, 段新平, 賴良學(xué), 趙增明, 逄大欣, 陳穎 申請人:吉林大學(xué)