專利名稱：一種枯草芽孢桿菌脂肪酶及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子酶 學與生物技術，具體涉及一種高活力脂肪酶的編碼基因，同時 涉及該突變基因編碼的脂肪酶蛋白的制備方法。高酶活脂肪酶突變株蛋白可以廣泛應用于 食品、能源、化工和醫藥等行業。
背景技術：
脂肪酶(Lipase，Ε. C. 3. 1. 1. 3)，全稱為三酰基甘油酰基水解酶 (triacylglycerolacylhydrolase)，它屬于α/β折疊酶家族，是一種絲氨酸水解酶。脂肪 酶的催化遵循絲氨酸水解酶的反應機制，能夠在油水界面上將甘油三酯完全水解成脂肪酸 和甘油，因而脂肪酶能夠催化脂水解、脂合成和脂交換等多種反應，被應用于油脂處理、洗 滌齊U、食品加工、精細化工、制藥、造紙等多種行業。脂肪酶在動植物的各種組織及微生物中普遍存在，是生物體內脂代謝不可缺少的 重要水解酶。人們于1834年首先在動物胰臟發現脂肪酶的活性，至今已有近二百年的歷 史。1871年報道了植物種子脂肪酶，而上世紀初人們從微生物中也發現了脂肪酶。由于微 生物脂肪酶種類多，具有比動植物脂肪酶更廣的反應PH值、反應溫度以及對底物的反應專 一性，又便于進行工業化生產和獲得高純度的酶制劑，再加上微生物脂肪酶在理論研究和 實際應用中都非常重要，因此它們在研究和應用上的進展相當迅速。產生脂肪酶的微生物 種類很多，如黑曲霉、白地霉、毛霉、熒光假單胞菌等，它們所產生的脂肪酶相繼獲得結晶。 其它如無根根霉、圓柱形假絲酵母、耶爾氏球擬酵母、粘質色桿菌等來源的脂肪酶也相繼得 到高度提純，并對它們的理化性質開展了進一步的研究。盡管產脂肪酶微生物容易發現，但尋找適合于工業規模生產的脂肪酶產生菌及其 發酵條件卻非常困難。在通過傳統誘變育種以及優化發酵條件提高脂肪酶產量方面已經開 展了大量的工作，并使得許多脂肪酶實現了工業化生產。近年來隨著基因操作技術的深入 發展和應用，人們能夠越來越多的通過直接對酶基因的改造，獲得更適合于生產實踐需求 的脂肪酶制劑。在眾多的脂肪酶中，枯草桿菌脂肪酶Lip A作為一種細菌來源的脂肪酶，具 備許多優良的性質，如分子量小，催化活力高，底物范圍廣，是一種嗜堿性脂肪酶等，因此其 具有較好的食品工業及化學工業等方面的應用潛力。但是，由于枯草桿菌脂肪酶高濃度時 容易聚集，給其純化和應用帶來很大困難，所以通過改造Lip Α，得到高酶活突變株，使其在 低濃度范圍就具有高催化活性，具有重大意義。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種高酶活脂肪酶突變株蛋白的編碼基因 LipA(I12V/L140F/D144E)，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列以及所述的序列編碼的突 變酶，該突變酶具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。通過重疊PCR引入突變，連接于表 達載體，獲得高活力脂肪酶產生菌(Escherichia coli)BL21/pET28a_/Lip A ^0-H1 (112V/ L140F/D144E)，生產高活力突變體脂肪酶。該突變酶的酶活是野生型的三倍。
本發明的另一個目的是在于提供了一種枯草芽孢桿菌脂肪酶的制備方法，該方法 是構建大腸桿菌表達系統，利用親和層析方法純化高酶活脂肪酶突變株蛋白。該方法簡便， 成本低廉。本發明的再一個目的是在于提供了一種枯草芽孢桿菌脂肪酶在洗滌劑工業中的 應用。該突變體蛋白對不同碳鏈長度的底物的催化活性是野生型的3倍以上，往洗滌劑 中添加時在保證相同催化功效的前提下，與野生型酶制劑相比可以有效減少酶制劑的使用 量，從而避免脂肪酶高濃度應用容易發生聚集而降低催化效率，提高洗滌劑的去污能力。為了實現上述任務，本發明采用以下技術措施本發明的第一個目的是提供一種核苷酸序列，該序列編碼一種高酶活脂肪酶突變株蛋白，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，其特征是在于野生型脂肪酶結構基因上具有 34位的A突變為G (I12V)，420位的A突變為T (L140F)，432位的T突變為G (D144E)的點突變。一種高酶活脂肪酶突變株蛋白的制備方法，其步驟是1.突變脂肪酶LipA(I12V/L140F/D144E)突變點的引入(1)設計誘變引物，采用重疊PCR法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因上 34位的A突變為G(I12V)，420位的A突變為T (L140F)，432位的T突變為G(D144E)；(2)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶BamHI和Hind III進行酶 切，與經過相同酶切的質粒pET28a(+)(購自Novagen公司)片段連接后，轉化大腸桿菌 BL21(DE3)(購自Novagen公司)感受態細胞，獲得的酶在大腸桿菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip Af10-H1 (I12V/L140F/D144E)中的表達；2.鑒定重組質粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)用酶切、PCR方法對重組質 粒進行鑒定，并測序檢驗，一種分離的蛋白質(一種高活性脂肪酶的編碼基因)，其編碼基 因為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，本發明所述的編碼高酶活脂肪酶突變株蛋白的基因Lip A(I12V/L140F/D144E), 具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，有以下特征1.本發明所用的脂肪酶野生型基因來自枯草芽孢桿菌，結構基因長度為546bp。2.具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，與野生型相比在此結構基因上具有三 處點突變，即34位的A突變為G(I12V)，420位的A突變為T(L140F)，432位的T突變為 G(D144E)。3.基因Lip A(I12V/L140F/D144E)編碼的脂肪酶蛋白對不同碳鏈長度的底物 (C4-C16)的催化活性是野生型的3倍以上，并與野生型酶具有相似的熱穩定性。本發明的高酶活脂肪酶突變株蛋白可用如下方法生產。該方法包括以下具體的 操作按照常規實驗條件，如《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003， 北京科學出版社中所述的條件進行。1.突變脂肪酶Lip A(I12V/L140F/D144E)突變點的引入(1)設計誘變引物，采用重疊PCR法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因上 34位的A突變為G (I12V)，420位的A突變為T (L140F)，432 位的 T 突變為 G(D144E)；(2)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶BamHI和Hind III進行酶切，與經過相同酶切的質粒pET28a(+)片段連接后，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，獲得 大腸桿菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET28a_/Lip A ^0-H1 (112V/L140F/D144E)；2.鑒定重組質粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)用酶切、PCR方法對重組質 粒進行鑒定，并測序檢驗，由此得到具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3.將大腸桿菌 BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)單克隆子轉到 5ml 含有卡 那霉素的液體LB培養基中培養過夜，次日取過夜培養物2.5ml以(ν/ν)的接種量轉接 到250ml的液體培養基中在37°C的條件下振蕩培養至0D600為0. 6，加入IPTG至終濃度為 0. 4mM，控制溫度在18°C進行突變蛋白的誘導表達；4.將誘導培養的菌體以SOOOrpm在4°C冷凍離心機中離心，棄掉上清，收集菌體。 以Mili-Q級水、平衡緩沖液分別洗滌菌體一次，洗去菌體上殘留的培養基。將250ml的菌體 以25ml的平衡緩沖液重懸，以超聲波處理菌液30min，至菌液澄清。在4°C冷凍離心機中， IOOOOrpm下離心菌液30min，取上清，棄雜質。將上清經0. 45 μ m的濾膜過濾，即得粗酶液；5. LipA(I12V/L140F/D144E)突變體蛋白的純化采用金屬螯合的親和層析法，粗酶 液經過親和純化，即可得到具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的高酶活脂肪酶突變株蛋 白；6.采用SDS-PAGE方法檢測突變蛋白的純度；7.將脂肪酶底物融入異丙醇中配成25mM的母液，稀釋酶液至10μ g/ml。反應在 pH8. 0的磷酸緩沖液(部分長鏈底物需加0. 1% (ν/ν)阿拉伯膠作乳化劑)中進行，底物終 濃度為0. 5mM，反應溫度為37°C，200ul體系中含5μ 1稀釋酶液。用酶標儀監測0D405在 Imin內的變化，檢驗突變脂肪酶的活性。注以上提到的LB培養基配方如下LB液體培養基(w/w)胰蛋白胨，0. 5% (w/w)酵母抽提物，(W/W)NaCl，用 蒸餾水配置，調節pH至7. 0，在1. 034X105Pa高壓下蒸氣滅菌20分鐘。LB固體培養基在上述LB液體培養基的基礎上再加1. 5-2. 0% (w/w)瓊脂。發酵產酶培養基在LB培養基中加卡那霉素至終濃度為0. 4mM即可。本發明獲得的一種枯草芽孢桿菌脂肪酶在食品、能源、化工和醫藥等行業有著廣 泛的應用前景。在食品工業中脂肪酶可以用于油脂改性、乳酪的熟化和后期風味的強化等； 在化工工業中脂肪酶可以用于絹紡、皮毛、皮革、明膠等的脫脂、添加到洗滌劑中增加洗滌 劑的去污能力等；在醫藥行業中脂肪酶可作為幫助消化、降低血脂、治療局部炎癥的藥物、 作為臨床診斷脂血病、胰腺炎等疾病的依據及進行消旋體藥物的生物法手性拆分等。脂肪 酶在洗衣粉中的應用過程如下
在洗衣粉中加入5_500U/g的脂肪酶，脂肪酶能催化分解衣物油污成甘油二脂、甘 油單脂及脂肪酸等較易溶于水的物質，從而顯著提高洗衣粉的洗滌效果，尤其是去除黃斑 的效果。在洗衣粉添加脂肪酶的優勢是能有效提高洗衣粉的去污能力，并降低直鏈烷基苯 磺酸鹽、脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鹽、烷基磺酸鹽等表面活性劑和三聚磷酸鈉 的用量，減少去污劑對環境的污染。本發明所述的高酶活脂肪酶突變株蛋白的優勢之一在 于其酶活是野生型的3倍以上，可以有效減少酶制劑的使用量，從而降低含酶洗衣粉的成 本。優勢之二在于低劑量的酶制劑應用可以避免脂肪酶高濃度應用容易發生聚集而降低催 化效率，保證洗滌劑的油脂去污能力。
所述的大腸桿菌表達載體pET28a(+)和大腸桿菌菌株BL21 (DE3)均購自Novagen 公司。所述重組質粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)為本發明所構建。所述的重組大 腸桿菌菌株BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)是具有質粒pET28a_Lip A(I12V/L140F/ D144E)的大腸桿菌菌株，保藏編號CCTCC NO :M2010058，保藏單位中國典型培養物保藏 中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2010年3月15日，分類命名大腸桿菌 (Escherichiacoli)BL21/pET28a-/Lip A (I12V/L140F/D144E)。所述的編碼基因 Lip A(I12V/L140F/D144E)是具有SEQUENCE NO. 1的核苷酸序列的高酶活脂肪酶突變株蛋白編 碼基因。所述的蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)是具有SEQUENCE NO. 2的氨基酸序列的高 酶活脂肪酶突變株蛋白。一種分離的蛋白質，其序列為SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序列。本發明的優點和效果本發明中提供的脂肪酶突變株的核苷酸序列和蛋白質序列是一種脂肪酶高酶活 突變株的基因和蛋白質序列，未見報道。本株脂肪酶突變株蛋白對不同碳鏈長度的底物的 催化活性酶活是野生型酶活的3倍以上，同時45°C以下具有良好的熱穩定性，符合實際應 用的要求。而脂肪酶在食品、化工和醫藥等領域有著廣泛的應用，因此，獲得高酶活的脂肪 酶，具有很高的實用價值。特 別是脂肪酶高濃度應用時容易聚集，影響催化效率。而該高酶 活突變株可以在低濃度范圍提供高催化活性，即達到相同催化效力，酶的添加量僅為野生 型的三分之一，有效避免高濃度應用酶發生聚集的問題。


圖1為一種重組質粒的構建示意圖(1)用PCR方法擴增出Lip A基因；(2)設計誘變引物，采用PCR定點突變法依次在脂肪酶基因上把野生型Lip A基因 上34位的A突變為G(I12V)，420位的A突變為T(LHOF)，432位的T突變為G(D144E)；(3)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶BamHI和Hind III進行酶切， 與經過相同酶切的質粒pET28a(+)片段連接后，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，獲得 獲得重組質粒 pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)；圖2 為一種重組表達質粒 pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)的 PCR 鑒定(a)和 酶切鑒定(b)結果示意圖(1%瓊脂糖凝膠電泳)。如圖2(b)所示，以上下游引物擴增出的條帶大小為546bp，與LipA結構基因大小一致。表達載體pET28a(+)大小為5369bp，插入的Lip A結構基因大小為546bp，將重 組表達質粒pET28a-LipA(I12V/L140F/D144E)用BamHI和Hind III雙酶切，電泳結果如 圖2(b)中所示，得到大小分別約為5360和550bp的兩個片段，與推測值一致。以上結果 證明高酶活脂肪酶突變株蛋白編碼基因Lip A(I12V/L140F/D144E)已克隆到表達載體 pET28a (+)，重組表達質粒 pET28a-LipA (I12V/L140F/D144E)構建成功。圖3為一種純化后的重組大腸桿菌菌株(Escherichia coli) BL21/pET28a_/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)誘導表達產生的高酶活脂肪酶突變株蛋白示意圖(10% SDS-聚 丙烯酰胺凝膠電泳檢測)脂肪酶分子量約為21kDa，與結果相符。
圖4為一種突變酶與野生型的熱穩定性比較將野生型和突變株酶液分別置于45°C和50°C下，每隔十分鐘取樣測定剩余酶活， 評價了酶的熱穩定性。如圖4(a)所示，在45°C中水浴中水浴保存1小時內，野生型和突變 株酶活都沒有明顯損失。50°C中水浴保存20分鐘后，突變株Lip A(I12V/L140F/D144E)的 酶活開始下降，1小時后其剩余酶活為原來的60%左右；野生型在50°C水浴30分鐘后，酶 活也開始下降，但下降幅度較小，1小時后野生型仍可保留80%以上的活性，見圖4(b)。總 體而言，高酶活脂肪酶突變株蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)具有良好的熱穩定性，能夠滿 足實際應用的需要。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。實施例中的實驗方法，均按常規 條件進行，具體參考《分子克隆實驗指南》(作者J.薩姆布魯克等，第三版，2003年，科學出 版社)中所述實驗方法。實施例1.高酶活脂肪酶突變株蛋白的獲得圖1顯示了重組突變脂肪酶基因的構建原理和過程。天然的脂肪酶為單體蛋白， 含181個氨基酸，基因長為546bp。一種高酶活脂肪酶突變株蛋白的制備方法，其步驟是1.突變酶Lip A(I12V/L140F/D144E)編碼基因中突變點的引入(1)設計誘變引物，采用重疊PCR法在Lip A基因上依次把野生型Lip A基因上 34位的A突變為G(I12V)，420位的A突變為T(L140F)，432位的T突變為G(D144E)。設計脂肪酶定點突變所需引物序列上游引物5‘ -ATTAGGATCCGCTGAACACAATCCAGTCGTTATGG-3 ‘下游引物5‘ -TATA AAGCTTTTAATTCGTATTCTGGCCCCCG-3 ‘定點突變引物12V-1 5'-ATGCCCCTCCAACACCGTGAAC-3
12V-2 5'-GTTATGGTTCACGGTGTTGGAG-3
140F-15'-CTAATCTTGAAAAGTAATTC-3‘
140F-25'-GTCATGAATTACTTTTCAAG-3‘
144E-15'-CGTTTCTAGCACCCTCTAATC-3
144E-25'-TTCAAGATTAGAGGGTGCTAG-3以野生型脂肪酶基因片段為模板，用上游引物與引物12V-1為PCR引物，擴增出約 56bp 的基因片段。PCR 循環條件:94°C 5min ；94°C 30sec，52°C 40sec，72°C 40sec，30 個循 環；72°C 5min。PCR擴增產物經1. 8% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。另外，此56bp的 基因片段也可通過核苷酸片段的合成來直接獲得。用下游引物與引物12V-2作為PCR反應的引物，以野生型脂肪酶基因片段為模板， 擴增出 520bp 的基因片段。PCR循環條件:94°C 5min ；94°C 30sec，52°C 40sec，72°C 60sec, 30個循環；72°C 5min。PCR擴增產物經1. 2% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。將以上得到的兩種PCR產物混合，加入上、下游引物再次進行PCR，PCR反應條件 為94°C 5min ；94°C 30sec,50°C 60sec，72°C 60sec，30 個循環；72°C lOmin。PCR 擴增產物經1.2% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點I12V的脂肪酶基因片段。以突變體I12V脂肪酶基因片段為模板，分別以上游引物與引物140F-1作為一對 PCR引物，下游引物與引物140F-2作為一對PCR引物，通過兩次PCR操作，分別獲得大小約 為430bp和130bp的PCR產物。然后將兩種PCR產物混合，加入上、下游引物再次進行PCR， 獲得含有突變位點I12V和L140F的脂肪酶基因片段Lip A(I12V/L140F)。以突變體Lip A(I12V/L140F)為模板，分別以上游引物與引物144E-1作為一對 PCR引物，下游引物與引物144E-2作為一對PCR引物，通過兩次PCR操作，分別獲得大小約 為440bp和120bp的PCR產物。然后將兩種PCR產物混合，加入上、下游引物再次進行PCR， 獲得含有突變位點I12V、L140F和D144E的脂肪酶基因片段Lip A(I12V/L140F/D144E)。(2)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶BamHI和Hind III進行酶切， 用T4連接酶與經過相同酶切的質粒pET28a(+)片段連接，16°C連接過夜后連接產物轉化大 腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，用卡那霉素-LB平板篩選得到陽性菌落，經過鑒定(見下一 步驟)，命名為大腸桿菌菌株 BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)；2.質粒 pET28a_Lip A(I12V/L140F/D144E)的鑒定用質粒抽提試劑盒從陽性菌落BL21 (DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)培養物中分 別提取質粒pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)，分別采用酶切和PCR方法對重組質粒進行 鑒定。以上下游引物進行PCR，擴增出的條帶大小約為546bp，如圖2(a)，與預期大小相符。 與Lip A結構基因大小一致。用BamHI和Hind III雙酶切，電泳結果如圖2(b)中所示，得到大小分別約為5360 和550bp的兩個片段，與實驗結果基本一致。質粒上Lip A(I12V/L140F/D144E)基因的序列測定由英俊(invitrogen)生物技 術有限公司進行。測序引物是利用質粒pET28a(+)上的通用引物，測序結果表明獲得的Lip A(I12V/L140F/D144E)基因序列與預期設計完全一致，由此得到具有SEQ ID NO. 1所示序列 的高酶活脂肪酶突變株蛋白編碼基因Lip A(I12V/L140F/D144E)。一種分離的蛋白質，其編 碼基因為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。Lip A(I12V/L140F/D144E)基因全長546nt，編 碼181個氨基酸的蛋白。將產生的質粒命名為(Escherichia coli)BL21/pET28a_/Lip A 40-氏(112乂/114(^/1)144￡)。4.重組質粒 pET28a_Lip A(I12V/L140F/D144E)的提取將BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)接種到 LB 培養基，37°C過夜培養，用質 粒抽提試劑盒提取質 pET28a-Lip A(I12V/L140F/D144E)。4.突變體蛋白 Lip A(I12V/L140F/D144E)的誘導表達；將大腸桿菌BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)單克隆子轉到5ml含有卡那 霉素的液體LB培養基中培養過夜，次日取過夜培養物2.5ml以(v/v)的接種量轉接到 250ml的液體培養基中在37°C的條件下振蕩培養至0D600為0. 6，加入IPTG至終濃度為 0. 4mM，控制溫度在18°C進行突變蛋白的誘導表達5.突變體蛋白 LipA(I12V/L140F/D144E)酶液的提取；將誘導培養的菌體以SOOOrpm在4°C冷凍離心機中離心，棄掉上清，收集菌體。以 Mili-Q級水、平衡緩沖液分別洗滌菌體一次，洗去菌體上殘留的培養基。將250ml的菌體 以25ml的平衡緩沖液重懸，以超聲波處理菌液30min，至菌液澄清。在4°C冷凍離心機中，lOOOOrpm下離心菌液30min，取上清，棄雜質。將上清經0. 45 y m的濾膜過濾，即得粗酶液；6.突變體蛋白 Lip A(I12V/L140F/D144E)的純化；采用金屬螯合的親和層析法，具體采用GE公司的預裝柱His Trap FF 1ml，在 ATKA系統上進行。粗酶液經過親和純化，即可得到具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的 高酶活脂肪酶突變株蛋白。一種分離的蛋白質，其序列為SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序 列。實施例2 突變體蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)的活性檢測及其他酶學性質分析。將不同碳鏈長度的各種底物融入異丙醇中配成25mM的母液。將酶液用反應緩沖 液稀釋成10 U g/ml。反應在pH8. 0的磷酸緩沖液(部分長鏈底物需加0. 1 % (v/v)阿拉 伯膠作乳化劑)中進行，反應溫度為37°C，200ul體系中含5iU稀釋酶液，底物終濃度為 0. 5mM，利用酶標儀監測0D405在lmin內的變化。酶活單位定義為在37°C下，每分鐘產生 1 U mol對硝基苯酚所需要的酶量。 熱穩定性分析催化活性提高的突變體有時會伴隨熱穩定性的降低，將野生型和突變株酶液分別 置于45°C和50°C下，每隔十分鐘取樣測定剩余酶活，評價了酶的熱穩定性。如圖4 (a)所示， 在45°C中水浴中水浴保存1小時內，野生型和突變株酶活都沒有明顯損失。50°C中水浴保 存20分鐘后，突變株Lip A(I12V/L140F/D144E)的酶活開始下降，1小時后其剩余酶活為 原來的60%左右；野生型在50°C水浴30分鐘后，酶活也開始下降，但下降幅度較小，1小時 后野生型仍可保留80%以上的活性，見圖4(b)。總體而言，高酶活脂肪酶突變株蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)具有良好的熱穩定性，能夠滿足實際應用的需要。實施例3 一種枯草芽孢桿菌脂肪酶在洗滌劑中的應用。將突變體蛋白Lip A(I12V/L140F/D144E)以5_500U/g的脂肪酶劑量添加到洗衣 粉中，該蛋白能催化分解衣物油污成甘油二脂、甘油單脂及脂肪酸等較易溶于水的物質，從 而顯著提高洗衣粉的洗滌效果，尤其是去除黃斑的效果。在洗衣粉添加脂肪酶的優勢是能 有效提高洗衣粉的去污能力，并降低直鏈烷基苯磺酸鹽、脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇聚氧乙烯醚 硫酸鹽、烷基磺酸鹽等表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量，減少去污劑對環境的污染。本發明 所述的高酶活脂肪酶突變株蛋白的優勢之一在于其酶活是野生型的3倍以上，可以有效減 少酶制劑的使用量，從而降低含酶洗衣粉的成本。優勢之二在于低劑量的酶制劑應用可以 避免脂肪酶高濃度應用容易發生聚集而降低催化效率，保證洗滌劑的油脂去污能力。
權利要求
一種枯草芽孢桿菌脂肪酶，其特征在于該酶在大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)中表達，CCTCC NOM2010058。
2.一種分離的蛋白質，其編碼基因為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.一種分離的蛋白質，其序列為SEQUENCE NO. 2所示的氨基酸序列。
4.權利要求1所述的一種枯草芽孢桿菌脂肪酶在洗滌劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種枯草芽孢桿菌脂肪酶及制備方法和應用，一種枯草芽孢桿菌脂肪酶，大腸桿菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-/Lip A f10-H1(I12V/L140F/D144E)，CCTCC NOM2010058。這種高活力脂肪酶突變體的編碼基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其編碼的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步驟是第一是通過PCR擴增出枯草芽孢桿菌脂肪酶Lip A結構基因；第二是設計3對誘變引物，通過重疊PCR將突變引入脂肪酶Lip A基因；第三獲得高活力脂肪酶產生菌BL21(DE3)/Lip A(I12V/L140F/D144E)；第四是在大腸桿菌中誘導表達目的蛋白；第五是純化蛋白。一種枯草芽孢桿菌脂肪酶在洗滌劑工業中的應用。本發明方法易行，成本低廉，高酶活脂肪酶突變株蛋白在食品、能源、化工和醫藥等行業具有重要應用價值。
文檔編號C12N9/20GK101857856SQ201010187108
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月25日 優先權日2010年5月25日
發明者危宏平, 周亞鳳, 崔宗強, 張先恩, 張治平, 王曉英, 王殿冰 申請人:中國科學院武漢病毒研究所