專利名稱：奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建方法
技術領域：
本發明涉及泌乳模型的體外構建方法。
背景技術：
乳腺是乳汁合成和分泌的場所。以前在體外研究乳腺的泌乳功能與調控，多是采 用在二維平臺上培養的乳腺上皮細胞作為研究載體。但研究表明，乳腺上皮細胞一但被分 離出來放到二維(平面)條件去培養，很快就會失去組織特異性功能。在乳腺上皮細胞二維 培養的時候，催乳素雖然可以激活STAT5 (信號轉導和轉錄激活因子5)，但是這種STAT5的 激活是瞬時的，不能誘導乳蛋白基因的表達。而乳腺腺泡作為最小的泌乳功能單位則不同， 腺泡結構不但可以使催乳素受體在腺泡上皮細胞基底側表達，而且可持續激活STAT5。這種 利用組成性激活STAT5的結構表明腺泡狀結構對乳腺細胞內染色體重組和酪蛋白轉錄 是必需的。因此，體外培養的乳腺腺泡將逐漸取代乳腺上皮細胞，成為體外研究乳腺泌乳功 能調控的新平臺。對乳腺腺泡模型的研究國際上最早是以小鼠為研究對象。1994年，Hurley等將妊 娠中期的小鼠乳腺上皮細胞在含有EHS (Engelbreth-Holm-Swarm)基質的培養基中培養， 乳腺細胞團形成帶有空腔的腺泡樣結構，細胞之間連接緊密。形成腺泡結構的乳腺上皮細 胞具有分泌極性，可以向腺泡腔中分泌酪蛋白和乳鐵傳遞蛋白。1995年，Blatchford等將 35S標記的亮氨酸添加到培養基中，應用體外培養的小鼠乳腺腺泡模型研究乳蛋白的分泌方 式發現，乳腺上皮細胞存在頂漿分泌和基底側分泌兩種方式。1998年，Blatchford等又用 小鼠乳腺腺泡模型研究泌乳反饋抑制因子(feedbackinhibitoroflactation，FIL)的特性， 發現在這個模型中FIL不能抑制乳蛋白分泌，這是因為腺泡模型中緊密的胞間連接阻止了 FIL與腺泡腔側乳腺腺泡上皮細胞表面FIL受體的相互作用。1999年，Blatchford等證實 EHS基質上乳腺腺泡模型的形成是由于位于細胞團中心的細胞選擇性凋亡所致。在腺泡形 成的過程中，與乳腺細胞凋亡相關的胰島素樣生長因子結合蛋白5 (IGFBP5)表達升高。以 小鼠乳腺腺泡模型為基礎，2004年，Dontu等在體外成功構建了人類乳腺腺泡模型并以此 研究Notch信號促進乳腺細胞增殖的作用。2006年，Liu等也用培養的人類乳腺腺泡模型 研究Hedgehog信號促進乳腺細胞自我更新的作用。同年Sharp等體外培養了海熊的乳腺 腺泡模型。目前，國內外均沒有利用妊娠期奶牛乳腺上皮細胞構建腺泡模型的報道，而在畜 牧業生產和科學研究中，奶牛作為最主要的產奶經濟動物，奶牛的產奶量和泌乳機能研究 是相當重要的研究領域，利用已知的小鼠、人等物種的乳腺腺泡來研究奶牛的泌乳功能是 不可行的；其原因是物種間的種屬差異造成基因組結構、生理機能的不同；另外小鼠和人 類乳腺腺泡體外構建采用了較厚的基質成份，且所用的細胞為轉染了逆轉錄病毒的細胞; 這種轉染后的細胞改變了細胞自身的生長特性，雖然也可以在體外發育成乳腺腺泡模型結 構，但是由于構成腺泡模型的細胞自身已經不同于機體內真實的狀態，因此此模型結構也 就失去了乳腺泌乳的真實性，如單純的采用此種方法構建奶牛乳腺腺泡泌乳模型也必然存在模擬體內環境真實性降低的問題。以往在體外研究奶牛乳腺的泌乳功能時均以乳腺上皮細胞為研究載體，但是乳腺 上皮細胞一旦從乳腺組織中分離出來，進行常規的細胞培養，隨著傳代次數的增加，其組織 特異性功能逐漸消失，大大降低了細胞實驗模擬體內環境的真實性。

發明內容
本發明目的是為了解決現有體外研究奶牛乳腺的泌乳功能時均以乳腺上皮細胞 為研究載體，存在模擬體內環境真實性低的問題，而提供奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構
建方法。奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建方法按以下步驟實現一、將基質 (Growthfactor-reducedMatrigel )在4°C條件下融解，然后鋪在4°C預冷的細胞培養板 上，每孔基質厚度為0. 5mm，再置于37°C細胞培養箱中30 60min，得到基質凝膠的細胞培 養板；二、采用質量濃度為0. 25%的胰酶和質量濃度為0. 02%的EDTA消化原代培養的妊娠 4個月的奶牛乳腺上皮細胞5min，然后以1500r/min離心5min，收集細胞；三、將收集到的 細胞懸浮于4ml的分析培養基中，制得細胞懸液，然后用分析培養基將細胞懸液稀釋到密 度為1 X 104 ；四、向基質凝膠的細胞培養板中加入2ml密度為1 X 104的細胞懸液，置于培養 箱中，在溫度為37°C，C02的體積濃度為5%的條件下培養15日，即完成奶牛乳腺腺泡泌乳 模型的體外構建；其中步驟三中分析培養基由98ml的DMEM/F12基礎培養基、2ml的胎牛血 清、lOiU濃度為50mg/ml的牛胰島素、20 yl濃度為15. 15mg/ml的催乳素、60 yl濃度為 5mg/ml的氫化可的松和100 ill的10X雙抗組成，經0. 22 y m濾膜過濾后，在4°C下儲存。本發明構建的奶牛乳腺腺泡泌乳模型是最小的泌乳功能單位，其三維極性結構使 腺泡具有完整的乳汁合成和分泌能力，保證了其與體內腺泡在結構和功能上的一致性，這 種三維腺泡結構能真實地模擬體內情況，以此模型為載體開展研究，大大增加了實驗結果 的直觀性、準確性和科學性。本發明構建奶牛乳腺腺泡模型所需的基質厚度僅為0. 5mm，所采用的細胞為妊娠 4個月的原代培養的奶牛乳腺上皮細胞；這種原代培養的奶牛乳腺上皮細胞與奶牛乳腺組 織內細胞的生理狀態一致，且具有很好的增殖特性，因此，以此細胞為基礎構建出的奶牛乳 腺腺泡模型與反芻動物體內的乳腺腺泡具有一致的泌乳功能與生物學特性，模擬體內環境 的真實性高。本發明構建的奶牛乳腺腺泡泌乳模型具有許多與體內環境下腺泡相同的功能與 特性；該腺泡模型是奶牛乳腺內乳汁合成和分泌的最小結構與功能單位，其人工構建過程， 是體外模擬血乳屏障的仿真過程；本發明構建的奶牛乳腺腺泡泌乳模型，不但可以為體外 深入研究乳腺的泌乳機能提供簡化并有效研究平臺，深入研究乳腺中乳蛋白、乳糖及乳脂 的合成與分泌的生理生化過程，探討多產奶和產好奶的規律和機理，而且可以為營養調控 和生物調控牛乳的乳產量和乳品質提供新的研究手段，也可以為乳腺生物反應器的研制提 供新的實驗基礎和新的思路。


圖1為具體實施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡從中
4間至底端逐層掃描第一層的掃描圖；圖2為具體實施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型 的激光共聚焦顯微鏡從中間至底端逐層掃描圖的第二層；圖3為具體實施方式
一中所得奶 牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡從中間至底端逐層掃描圖的第三層；圖4為具體 實施方式一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡從中間至底端逐層掃描圖 的第四層；圖5為具體實施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡從中 間至底端逐層掃描圖的第五層；圖6為具體實施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激 光共聚焦顯微鏡從中間至底端逐層掃描圖的第六層；圖7為具體實施方式
一中所得奶牛乳 腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡從中間至底端逐層掃描圖的第七層；圖8為具體實施 方式一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡從中間至底端逐層掃描圖的第 八層；圖9為具體實施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡從中間至 底端逐層掃描圖的第九層；圖10為具體實施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光 共聚焦顯微鏡從中間至底端逐層掃描圖的第十層；圖11為具體實施方式
一中所得奶牛乳 腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡從中間至底端逐層掃描圖的第十一層；圖12為具體 實施方式一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡從中間至底端逐層掃描圖 的第十二層；圖13為具體實施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦顯微鏡 從中間至底端逐層掃描圖的第十三層；圖14為具體實施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳 模型中細胞核排列的激光共聚焦顯微圖；圖15為具體實施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌 乳模型中酪蛋白表達與分泌的激光共聚焦顯微圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建方法按以下步驟 實現一、將基質(Growthfactor-reducedMatrigel )在4°C條件下融解，然后鋪在4°C預 冷的細胞培養板上，每孔基質厚度為0. 5mm，再置于37°C細胞培養箱中30 60min，得到基 質凝膠的細胞培養板；二、采用質量濃度為0. 25%的胰酶和質量濃度為0. 02%的EDTA消化 原代培養的妊娠4個月的奶牛乳腺上皮細胞5min，然后以1500r/min離心5min，收集細胞； 三、將收集到的細胞懸浮于4ml的分析培養基中，制得細胞懸液，然后用分析培養基將細胞 懸液稀釋到密度為IX 104;四、向基質凝膠的細胞培養板中加入2ml密度為1X104的細胞 懸液，置于培養箱中，在溫度為37°C，C02的體積濃度為5%的條件下培養15日，即完成奶牛 乳腺腺泡泌乳模型的體外構建；其中步驟三中分析培養基由98ml的DMEM/F12基礎培養基、 2ml的胎牛血清、lOiU濃度為50mg/ml的牛胰島素、20 yl濃度為15. 15mg/ml的催乳素、 60 u 1濃度為5mg/ml的氫化可的松和100 yl的10 X雙抗組成，經0. 22 y m濾膜過濾后，在 4°C下儲存。本實施方式步驟一中置于37°C細胞培養箱中30 60min，是為了使液態基質成為
基質凝膠。本實施方式步驟三將收集到的細胞懸浮于4ml的分析培養基中，采用lOOOiU的 加樣槍輕輕將細胞團吹散，可使制得細胞懸液均勻。本實施方式步驟四中培養15日，每4日更換一次分析培養基。
本實施方式中所用試劑的配制
質量濃度為0. 25%的胰酶稱取0. 25g胰酶，用100ml無鈣鎂離子的D-Hank’ s溶液溶 解，經0. 22 y m濾膜過濾后，分裝1ml/管，-20°C儲存；
質量濃度為0. 02%的EDTA 稱取0. 02gEDTA，用100ml無鈣鎂離子的D-Hank，s溶液溶 解，經0. 22 y m濾膜過濾后，分裝1ml/管，-20°C儲存；
牛胰島素將50mg牛胰島素溶于1ml濃度為0. 05mol/L的HC1中，配成終濃度為50mg/ ml的儲備液，經0. 22 y m濾膜過濾后，分裝40 yl/管，-20°C儲存；
催乳素將10mg催乳素溶于660iU濃度為0. 001mol/L的NaOH中，配成終濃度為 15. 15mg/ml的儲備液，經0. 22 y m濾膜過濾后，分裝40 u 1/管，-20°C儲存；
氫化可的松將19mg氫化可的松溶于3. 8ml無水乙醇中，配成終濃度為5mg/ml的儲備 液，經0. 22 y m濾膜過濾后，分裝120 u 1/管，-20°C儲存；
雙抗配制10 X雙抗，每100ml培養基中添加100 ill ；青霉素160萬單位，鏈霉素100 萬單位；取2支青霉素，3支鏈霉素，溶于30ml三蒸水中，經0. 22 y m濾膜過濾后，分裝，即 為10X雙抗。本實施方式中妊娠4個月的奶牛乳腺上皮細胞，在最初培養的第3 6日，增殖形 成小的細胞團；第6 10日發育成一個頂點-基底側的極性的軸；基膜成分(膠原IV和層 粘連蛋白5)位于基底側；位于細胞團中央的細胞經過復雜的細胞死亡過程，使得腺泡發育 成由單層乳腺上皮細胞合圍而成的，具有分泌活性、通過功能性緊密連接組合而成的腔狀 結構，可以向腺泡腔中分泌乳蛋白。本實施方式步驟四中培養15日，完成奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建，將所得 奶牛乳腺腺泡泌乳模型進行DAPI染色(染細胞核)，并采用激光共聚焦顯微鏡進行逐層掃描 并觀察，結果如圖1_13(奶牛乳腺腺泡泌乳模型從中間至底端逐層掃描圖，上下相鄰兩層 之間的間距為5i!m)所示，可以看到在培養15日后，奶牛乳腺腺泡已經發育成由單層細胞 合圍而成的閉合腔狀結構；可見本實施方式采用原代培養的奶牛乳腺上皮細胞與奶牛乳腺 組織內細胞的生理狀態一致，且具有很好的增殖特性，因此，以此細胞為基礎構建出的奶牛 乳腺腺泡模型與反芻動物體內的乳腺腺泡具有一致的泌乳功能與生物學特性，模擬體內環 境的真實性高。本實施方式中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型，采用間接免疫熒光方法檢測其乳蛋白 合成與分泌能力，結果如圖14和15所示，可以看到酪蛋白的表達部位位于腺泡上皮細胞以 及腺泡腔中，表明在培養15日后，奶牛乳腺腺泡泌乳模型已經具有合成和分泌酪蛋白的能 力，可將腺泡上皮細胞中合成的酪蛋白分泌到腺泡腔中，具有與體內相同的功能與分泌極 性。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中置于37°C細 胞培養箱中40 50min，得到基質凝膠的細胞培養板。其它步驟及參數與具體實施方式
一 相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中置于37°C細 胞培養箱中45min，得到基質凝膠的細胞培養板。其它步驟及參數與具體實施方式
一相同。
權利要求
奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建方法，其特征在于奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建方法按以下步驟實現一、將基質在4℃條件下融解，然后鋪在4℃預冷的細胞培養板上，每孔基質厚度為0.5mm，再置于37℃細胞培養箱中30～60min，得到基質凝膠的細胞培養板；二、采用質量濃度為0.25%的胰酶和質量濃度為0.02%的EDTA消化原代培養的妊娠４個月的奶牛乳腺上皮細胞5min，然后以1500r/min離心5min，收集細胞；三、將收集到的細胞懸浮于4ml的分析培養基中，制得細胞懸液，然后用分析培養基將細胞懸液稀釋到密度為1×104；四、向基質凝膠的細胞培養板中加入2ml密度為1×104的細胞懸液，置于培養箱中，在溫度為37℃，CO2的體積濃度為5%的條件下培養15日，即完成奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建；其中步驟三中分析培養基由98ml的DMEM/F12基礎培養基、2ml的胎牛血清、10μl濃度為50mg/ml的牛胰島素、20μl濃度為15.15mg/ml的催乳素、60μl濃度為5mg/ml的氫化可的松和100μl的10×雙抗組成，經0.22μm濾膜過濾后，在4℃下儲存。
2.根據權利要求1所述的奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建方法，其特征在于步驟一 中置于37°C細胞培養箱中40 50min，得到基質凝膠的細胞培養板。
3.根據權利要求1所述的奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建方法，其特征在于步驟一 中置于37°C細胞培養箱中45min，得到基質凝膠的細胞培養板。
全文摘要
奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構建方法，它涉及泌乳模型的體外構建方法。它解決了現有體外研究奶牛乳腺的泌乳功能時均以乳腺上皮細胞為研究載體，存在模擬體內環境真實性低的問題。方法一、制備基質凝膠的細胞培養板；二、采用胰酶和EDTA消化原代培養的妊娠４個月的奶牛乳腺上皮細胞，離心后收集細胞；三、制備細胞懸液并稀釋；四、向基質凝膠的細胞培養板中加入細胞懸液，置于培養箱中培養15日，即完成構建。本發明構建的奶牛乳腺腺泡泌乳模型的人工構建過程，是體外模擬血乳屏障的仿真過程，其三維腺泡結構能真實地模擬體內情況，與反芻動物體內的乳腺腺泡具有一致的泌乳功能與生物學特性，模擬體內環境的真實性高。
文檔編號C12N5/071GK101857852SQ20101018730
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者侯曉明, 李慶章, 林葉, 高學軍 申請人:東北農業大學