專利名稱：利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器及其制備方法
技術領域：
本發明涉及酶反應器，具體是一種利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器及其制 備方法。
背景技術：
對大量化合物進行篩選，發現具有生物活性的先導化合物，是研究開發新藥的源 頭和起點，對整個創新藥物的研制具有決定性的意義。一般來說，篩選的樣品量越大，比較 的范圍越廣，獲得品質優異的藥物的可能性就越大。天然產物及其衍生物在以往的疾病治療中發揮了重大作用，也是當今藥物研發過 程中最具潛力的資源之一。美國國立癌癥研究院調查顯示，1981-2002年上市的877種小 分子新藥中，來源于天然產物的占61% (包括天然產物的衍生物和天然產物藥效團的合成 物)(Newman D. J. et al. J. Nat. Prod. 2003,66 :1022—1037)。據報道，在我國有一定應用記載的藥用植物約有五六千種，而做過一定化學成分 或藥物研究的不過1/5 ；我國具有18000km漫長的海岸線，擁有極其豐富的微生物與海洋生 物資源，其代謝產物具有新穎而多樣的化學結構與生物活性。充分利用我國天然藥用資源 優勢，擴大篩選樣品的來源，是我國藥物篩選研究的重要方向之一。然而，目前被國際大多數藥物研發機構廣泛采用，作為藥物篩選主要技術手段的 基于多孔微板的高通量篩選技術并不適合分析混合物，尤其是成分復雜的天然產物粗提 物。傳統的中藥活性組分篩選的程序是對有效復方或單味藥進行化學分離，制備出每種成 分的純品化合物，勞動強度高、耗時耗力，而且獲得有效化合物的準確性非常低。研究天然 產物的高成本和長周期限制了它的發展。高效毛細管電泳是一種新型高效的微分離分析技術，以其樣品用量少、分離效率 高和分析時間短及能與各種檢測模式(如紫外可見檢測、激光誘導熒光檢測、質譜、電化學 檢測和化學發光檢測等)聯用等優點在生物分析和生命科學領域中有極為廣闊的應用前 景。高效毛細管電泳技術具有極高的分離選擇性，可以十分準確且可靠地實現反應物、產物 和待篩選物質的分離和測定，有效地解決了混合物樣品篩選中出現的檢測干擾問題，為混 合物的篩選提供了十分簡便的平臺。酶是在分子水平進行藥物篩選的重要靶點，將酶固定在毛細管上可以實現酶的重 復利用，降低成本，也容易實現分析的自動化和通量化。固定化酶的方法有共價結合法、離 子吸附法等。單純利用離子吸附固定酶，酶容易從載體中泄露出去，這是由于酶與載體間的 相互作用比較弱，容易被高離子強度、PH等破壞掉。利用共價結合法制備的酶反應器比較 穩定，但反應條件劇烈，不適合敏感的酶，酶活力損失較大。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器。上述的一種利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器，包含毛細管和固定化的酶，毛細管內壁涂覆著高聚物，酶包埋在高分子三維網狀結構中，包埋著酶的高分子三維網狀 結構離子鍵合固定于高聚物涂層。所述的高聚物為聚乙烯亞胺。所述高分子為聚賴氨酸、海藻酸鹽、明膠、阿拉伯膠、羥甲基纖維素、乙基纖維素、 或聚丙烯酰胺。所述的酶是氧化還原酶或水解酶。本發明的另一目的在于提供一種利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器的制備 方法。本發明提出的毛細管酶微反應器的具體制備步驟如下(1)毛細管用強堿溶液浸泡10-40分鐘，然后用超純水沖洗；(2)經預處理后的毛細管，采用壓力進樣或其它進樣方式將高聚物溶液導入毛細 管一端，長度在0. 3-5厘米，維持5-40分鐘，之后用超純水沖洗；(3)將酶混在高分子溶液中，形成高分子與酶的混合液；(4)在經過步驟(2)后的毛細管那一端，以與步驟(2)相同的進樣方式注入高分子 與酶的混合液，保留15-60分鐘，用超純水沖洗；(5)在經過步驟(4)后的毛細管那一端，以與步驟(2)相同的進樣方式將交聯劑導 入毛細管，維持10-60分鐘，之后用超純水沖洗。本發明也可在高分子與酶的混合液注入毛細管前，可以預先加入部分交聯劑。所 述的交聯劑為氯化鈣溶液。通常情況下，強堿溶液是NaOH溶液，以使硅羥基充分解離。經預處理后的毛細管，使聚乙烯亞胺通過離子鍵合固定在毛細管內壁之后，要用 超純水沖洗掉多余的聚乙烯亞胺。同樣也要用超純水洗去未固定的酶、以及多余的交聯劑。上述的毛細管酶微反應器中，毛細管內徑為10-100 μ m，總長為20-200cm。所述的各種氧化還原酶和水解酶，具體如谷氨酸脫氫酶、腺苷脫氨酸、嘌呤核苷磷 酸化酶等。本發明的毛細管酶微反應器可應用在藥物篩選研究中。上述的待篩選物質可以是單一化合物，也可以是混合物，尤其適用于天然產物粗 提物。可選取傳統中藥、藏藥等少數民族藥材、處方作為研究對象。它們在我國已有千年的 應用，至今還用于各種疾病的治療。也可選用海藻、海綿等海洋生物作為研究對象。由于生態環境與陸地截然不同，海 洋生物體內生物合成過程不同，具有新穎結構分子的可能性大，也是新藥開發的來源。還可以選取微生物作為本發明的研究對象。微生物特有的生理過程和生長環境， 也含有極其豐富的特有天然產物。本發明具有如下優點(1)毛細管酶微反應器的制備方法簡單，條件溫和，酶活性高。(2)毛細管酶微反應器使用凝膠包埋的方法，可制備多酶體系，以及進行連續的酶 反應，實現簡單模擬體內代謝的效果。(3)運用此毛細管酶微反應器消耗的樣品和試劑少，均為納升級，有效降低成本。
(4)運用此毛細管酶微反應器可實現天然產物粗提物的分析，簡化樣品前處理程序。(5)與陣列毛細管結合，易于實現自動化和通量化。


圖1毛細管酶微反應器的剖面示意圖；圖2未添加抑制劑時嘌呤核苷磷酸化酶毛細管酶微反應器的電泳譜圖；圖3嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑8-氨基鳥苷的抑制曲線；圖4嘌呤核苷磷酸化酶毛細管酶微反應器上篩選中藥的典型電泳譜圖；圖5腺苷脫氨酶毛細管酶微反應器上篩選中藥的典型電泳譜圖。
具體實施例方式下面用實施例對本發明做進一步闡述，但這些實施例絕非對本發明有任何限制。實施例1 酶毛細管酶微反應器的制備毛細管進樣端用lmol/L氫氧化鈉溶液活化20分鐘， 然后用超純水沖洗5分鐘。經預處理后的毛細管，采用進樣端50mbar壓力將4%的聚乙烯 亞胺溶液導入毛細管一端0.4厘米，保留10分鐘后在毛細管出口端加壓lOOmbar，用超純 水沖洗掉多余的聚乙烯亞胺。將酶和海藻酸鈉溶于水中配制成酶濃度為45. 5unit .mr1和 0. lmg/mL海藻酸鈉，以相同的進樣方式在毛細管進樣端注入該酶溶液，保留30分鐘，未固 定的酶用超純水沖洗去。以同樣的進樣方式將的氯化鈣溶液導入毛細管，保留10分鐘 后用超純水洗去。制備好的毛細管酶微反應器如圖1所示，其中毛細管內壁1涂覆著聚乙 烯亞胺涂層2，酶包埋在高分子三維網狀結構3中，包埋著酶的高分子三維網狀結構3離子 鍵合固定于聚乙烯亞胺涂層2。實施例2 以嘌呤核苷磷酸化酶為具體靶酶，按實施例1的步驟進行，得嘌呤核苷磷酸化酶 毛細管酶微反應器。實施例3 用腺苷脫氨酶代替嘌呤核苷磷酸化酶，按實施例1的步驟進行，得腺苷脫氨酶毛 細管酶微反應器。實施例4 (1)用實施例2制備的嘌呤核苷磷酸化酶毛細管酶微反應器進行藥物篩選，過程 具體如下以25mmol/L的硼砂緩沖溶液(pH 8. 0)作為電泳介質，254nm為檢測波長。采用 壓力進樣40mbarX5s，注入反應物溶液(0. 2mmol/L肌苷和4mmol/L磷酸鹽溶液)，然后孵 育2分鐘，使底物與酶充分作用轉化為產物，接著在毛細管兩端加分離電壓25kV，使未反應 的底物和產物分離，根據產物峰面積得到固定化酶的活性。其譜圖如圖2所示，其中數字1 代表系統峰，2代表產物次黃嘌呤的峰，3代表反應物肌苷的峰(2)以嘌呤核苷磷酸化酶的抑制劑8-氨基鳥苷為例進行篩選研究。將不同濃度的 8_氨基鳥苷加入反應物溶液中混合均勻(保持與空白反應物濃度一致)，按以上步驟分析， 比較含抑制劑和不含抑制劑時的產物峰面積，計算出抑制劑的抑制率，繪制出抑制曲線，如圖3所示。(3)用中藥粗提液代替步驟(2)的抑制劑8-氨基鳥苷，篩選了如表1所列的28 種中藥粗提液樣品。其中，反應物為0. 2mmol/L肌苷和4mmol/L磷酸鹽溶液，中藥濃度為 0.6mg/mL。研究發現中草藥王不留行和大黃的提取物對嘌呤核苷磷酸化酶有抑制作用。圖 4(a)和(b)分別為大黃和王不留行的提取物在該嘌呤核苷磷酸化酶毛細管酶微反應器上 的電泳譜圖，其中數字1代表系統峰，2代表產物次黃嘌呤的峰，3代表反應物肌苷的峰，4代 表天然產物中未知物質的峰。實施例5 (1)用實施例3制備的腺苷脫氨酶毛細管酶反應器，以25mmol/L的硼砂緩沖溶液 (PH8.0)作為電泳介質，254nm為檢測波長。采用壓力進樣40mbar X 5s，注入反應物溶液 (0. 2mmol/L腺苷溶液)，然后孵育2分鐘，使底物腺苷與酶充分作用轉化為產物肌苷，接著 在毛細管兩端加分離電壓20kV，使未反應的底物腺苷和產物肌苷分離，根據產物峰面積得 到固定化酶的活性。其譜圖如圖5(a)所示，其中數字1代表反應物腺苷的峰，2代表產物肌 苷的峰；(2)以腺苷脫氨酶的抑制劑 EHNA[erythro-9-(-laydfoxy-3-nonyl)adenine]為 例進行篩選研究。將30nmol/L的EHNA加入反應物溶液中混合均勻(腺苷濃度保持為 0. 2mmol/L)，按以上步驟分析，比較含抑制劑和不含抑制劑時的產物峰面積，計算出抑制劑 的抑制率為76.8%。其電泳譜圖如圖5(b)所示，其中數字1代表反應物腺苷的峰，2代表 產物肌苷的峰；(3)用中藥粗提液代替步驟(2)的抑制劑EHNA，篩選了 20種中藥粗提液樣品，實 驗測得的結果見表2。其中，反應物為0.2mmol/L腺苷溶液，中藥濃度為0.6mg/mL。圖5 (c) 為川芎提取物在該毛細管酶微反應器上的電泳譜圖，數字1代表反應物腺苷的峰，2代表產 物肌苷的峰，3代表川芎中未知物質的峰；表1 部分中草藥提取物在嘌呤核苷磷酸化酶毛細管酶微反應器上的篩選結果
6 表2 部分中草藥提取物在腺苷脫氨酶毛細管酶反應器上的篩選結果
權利要求
一種利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器，包含毛細管和固定化的酶，其特征是毛細管內壁涂覆著高聚物，酶包埋在高分子三維網狀結構中，包埋著酶的高分子三維網狀結構離子鍵合固定于高聚物涂層。
2.如權利要求1所述的利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器，其特征是所述的高 聚物為聚乙烯亞胺。
3.如權利要求1所述的利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器，其特征是所述高分 子為聚賴氨酸、海藻酸鹽、明膠、阿拉伯膠、羥甲基纖維素、乙基纖維素、或聚丙烯酰胺。
4.如權利要求1所述的利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器，其特征是所述的酶 是氧化還原酶或水解酶。
5.一種利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)毛細管用強堿溶液浸泡10-40分鐘，然后用超純水沖洗；(2)經預處理后的毛細管，采用壓力進樣或其它進樣方式將高聚物溶液導入毛細管一 端，長度在0. 3-5厘米，維持5-40分鐘，之后用超純水沖洗；(3)將酶混在高分子溶液中，形成高分子與酶的混合液；(4)在經過步驟(2)后的毛細管那一端，以與步驟(2)相同的進樣方式注入高分子與酶 的混合液，保留15-60分鐘，用超純水沖洗；(5)在經過步驟(4)后的毛細管那一端，以與步驟(2)相同的進樣方式將交聯劑導入毛 細管，維持10-60分鐘，之后用超純水沖洗。
6.如權利要求5所述的利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器的制備方法，其特征 是高分子與酶的混合液注入毛細管前，可以預先加入部分交聯劑。
7.如權利要求5或6所述的利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器的制備方法，其特 征是交聯劑為氯化鈣溶液。
全文摘要
本發明涉及酶反應器，具體是一種利用包埋法固定酶的毛細管酶微反應器及其制備方法。毛細管酶微反應器，包含毛細管和固定化的酶，毛細管內壁涂覆著高聚物，酶包埋在高分子三維網狀結構中，包埋著酶的高分子三維網狀結構離子鍵合固定于高聚物涂層。本發明的毛細管酶微反應器可應用在藥物篩選研究中。本發明的毛細管酶微反應器的制備方法簡單，條件溫和，酶活性高，可制備多酶體系，以及進行連續的酶反應，實現簡單模擬體內代謝的效果，運用此毛細管酶微反應器消耗的樣品和試劑少，均為納升級，有效降低成本，可實現天然產物粗提物的分析，簡化樣品前處理程序。與陣列毛細管結合，易于實現自動化和通量化。
文檔編號C12N11/10GK101914437SQ20101018991
公開日2010年12月15日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者冀曉雯, 葉芳貴, 林娉毯, 趙書林 申請人:廣西師范大學