專利名稱：一種固定化酶法連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領(lǐng)域，涉及通過固定化酶法生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法。
背景技術(shù)：
Y-氨基丁酸是一種具有很高生理活性的天然氨基酸，廣泛分布于動植物中。是目前研究較為深入的一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種代謝活動。根據(jù)目前的研究，發(fā)現(xiàn)Y-氨基丁酸的生理活性主要表現(xiàn)在以下幾方面(1)鎮(zhèn)靜神經(jīng)、抗焦慮；(2)降低血壓；(3)治療帕金森病、癲癇、老年癡呆等疾病；(4)降低血氨，以解決氨毒，從而增進(jìn)肝機(jī)能；(5)提高腦活力；(6)促進(jìn)乙醇代謝；(7)其他如防止皮膚老化、消除體臭、改善脂質(zhì)代謝、防止動脈硬化高效減肥等功能。Y-氨基丁酸目前在醫(yī)藥中已有廣泛的應(yīng)用，同時作為 一種具有顯著藥理作用的功能性因子，其在食品工業(yè)中的應(yīng)用也越來越受關(guān)注。由于Y -氨基丁酸在動植物原料中含量很低，很難直接從天然組織中大量提取得至IJ，目前Y-氨基丁酸的制備方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。但是，化學(xué)合成法得率較低，并且在生產(chǎn)工藝中使用危險(xiǎn)溶劑，甚至是有毒溶劑，因此化學(xué)合成法制備的Y -氨基丁酸不宜用于食品添加劑使用。生物合成法主要是利用酶催化轉(zhuǎn)化，在Y-氨基丁酸支路中合成。該方法生產(chǎn)成本低、無毒、安全環(huán)保，屬于低碳、綠色生產(chǎn)方式。就酶源而言，可分為兩種途徑植物組織代謝和微生物發(fā)酵。其中，植物組織代謝主要利用內(nèi)源酶轉(zhuǎn)化制備Y-氨基丁酸，分為植物組織生長代謝和立體植物組織應(yīng)激代謝兩種方式。微生物發(fā)酵法主要是利用谷氨酸脫羧酶(GAD)生物催化谷氨酸脫羧生成Y-氨基丁酸。至今為止，被發(fā)現(xiàn)具有GAD活性并用來制備Y-氨基丁酸的微生物主要包括大腸桿菌E. coli、乳酸菌、酵母菌、紅曲霉菌等，表I是目前微生物生產(chǎn)Y-氨基丁酸的情況。表I微生物生產(chǎn)Y -氨基丁酸的研究概況
權(quán)利要求
1.一種采用固定化酶法連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，其特征在于該方法包括 以固定化重組表達(dá)的纖維素結(jié)合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白、簡稱“固定化酶”為酶源，濃度為0. 05mlT0. 15mM的磷酸吡哆醛存在的條件下，進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)過程中，向反應(yīng)體系中加入固定化酶4mL/L至20mL/L，底物L(fēng)-谷氨酸鈉或L-谷氨酸為20g/L至50g/L，溫度25至50°C，pH值為4至6，經(jīng)酶法轉(zhuǎn)化反應(yīng)Ih至4h生產(chǎn)、-氨基丁酸，并進(jìn)一步分離獲得Y-氨基丁酸粉末或晶體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述的固定化重組表達(dá)的纖維素結(jié)合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白的制備方法是 首先，構(gòu)建高效融合表達(dá)纖維素結(jié)合域-谷氨酸脫羧酶的基因工程菌株大腸桿菌BL21 (DE3)-pET35b-GAD，即以大腸桿菌BL21的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增谷氨酸脫羧酶基因，構(gòu)建PET21 (+)-GAD表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行表達(dá)，隨后將確認(rèn)的GAD基因轉(zhuǎn)入pET35b，獲得重組表達(dá)載體pET35b_GAD，再構(gòu)建基因工程菌株大腸桿菌BL21 (DE3) -pET35b-GAD，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行表達(dá)； 以上述重組基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3)-pET35b-GAD的細(xì)胞裂解液為起始酶源，經(jīng)過纖維素載體吸附，完成固定化，得到固定化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的谷氨酸脫羧酶基因來源于構(gòu)建的重組菌株BL21 (DE3) -pET21a (+) -GAD,該菌株具備可表達(dá)谷氨酸脫羧酶融合蛋白，并能夠?qū)-谷氨酸或其鈉鹽轉(zhuǎn)化為Y-氨基丁酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的纖維素載體包括纖維素微球、纖維素凝膠、脫脂棉和濾紙。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于固定化酶采用纖維素結(jié)合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白特異性吸附固定的方式，或采用交聯(lián)劑進(jìn)一步交聯(lián)固定的方式，其中交聯(lián)劑為戊二醒，濃度為0. 1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于酶促反應(yīng)優(yōu)選轉(zhuǎn)化溫度為37°C;優(yōu)選轉(zhuǎn)化PH值為5. 5 ;優(yōu)選轉(zhuǎn)化時間為2h ;底物L(fēng)-谷氨酸鈉或L-谷氨酸的用量優(yōu)選分別為40g/L ；輔酶磷酸吡哆醛濃度為0. ImM ;固定化酶優(yōu)選用量為8mL/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于固定化酶源可重復(fù)使用15次以上，且在最佳的反應(yīng)條件和體系下，連續(xù)轉(zhuǎn)化10次，其催化底物轉(zhuǎn)化率均能夠達(dá)93%以上。
全文摘要
一種采用固定化酶連續(xù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法。采用構(gòu)建的谷氨酸脫羧酶基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，將其誘導(dǎo)表達(dá)后破碎細(xì)胞，收集上清液，對融合表達(dá)纖維素結(jié)合域(CBD)的谷氨酸脫羧酶的最適反應(yīng)條件和固定化條件進(jìn)行了研究。利用CBD標(biāo)簽對纖維素的特異性吸附性能，將纖維素載體加入到細(xì)胞裂解液中，實(shí)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶的特異性吸附，并采用交聯(lián)劑交聯(lián)固定化谷氨酸脫羧酶。優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，最佳的催化反應(yīng)條件為，pH5.5；反應(yīng)時間2h；底物L(fēng)-谷氨酸鈉的濃度40g/L；固定化酶濃度8mL/L；輔酶磷酸吡哆醛濃度0.1mM。在最適反應(yīng)條件下，重復(fù)連續(xù)轉(zhuǎn)化10次，底物L(fēng)-谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率均達(dá)到93%以上。
文檔編號C12N11/12GK102719500SQ201210233749
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者丁國鈺, 任麗梅, 余瓊林, 劉磊, 王文芳, 高智慧 申請人:天津啟仁醫(yī)藥科技有限公司