專利名稱：金黃色葡萄球菌截短SasA蛋白在大腸桿菌中的表達及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體地說涉及一個金黃色葡萄球菌MsA基因及其編碼蛋白以及作為亞單位疫苗在金黃色葡萄球菌感染預防方面的應用。
背景技術：
金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)是一種重要的革蘭氏陽性條件致病菌，最常見的金黃色葡萄球菌引發的感染是局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心臟內膜炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。大面積燒傷、需進行血液透析的患者、早產兒及其他免疫力低下的人群是金黃色葡萄球菌的易感人群。國內一項研究結果表明，燒傷面積大于30%者，40%并發金黃色葡萄球菌引起的膿毒癥，其中20%的患者最終轉為多器官功能障礙綜合癥，50%以上死亡。另據報道75%的早產兒膿毒癥是由金黃色葡萄球菌引起的。金黃色葡萄球菌感染的經典治療是使用抗生素，而多種抗生素抗性菌株的出現，特別是甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌菌株的迅速蔓延和萬古霉素抗性金黃色葡萄球菌菌株的出現，使得疫苗的研制變得更為迫切。金黃色葡萄球菌的疫苗研制的最大障礙是金黃色葡萄球菌的毒力因子很多，包括多種毒素、多種粘附分子和莢膜等。金黃色葡萄球菌的MsA蛋白表達在金黃色葡萄球菌細胞壁上，全長由1759個氨基酸組成，分子量約為193kDa。目前有關該蛋白的功能報導還非常少。由于金黃色葡萄球菌毒力相關蛋白很多，毒力蛋白在臨床分離的菌株中的分布也不一致，目前還沒有有效的針對金黃色葡萄球菌的蛋白疫苗。目前進入臨床的針對金黃色葡萄球菌的疫苗是將金黃色葡萄球菌的莢膜多糖CP5和CP8與銅綠假單胞菌的外毒素A偶聯制成的，在血液透析病人進行的三期臨床結果顯示該疫苗存在一定的有效性。但該疫苗存在的主要問題是需要對莢膜多糖進行提取，制備過程復雜。選擇金黃色葡萄球菌的保護性抗原開發基因工程蛋白疫苗是金黃色葡萄球菌疫苗研究的方向。在對金黃色葡萄球菌的多個毒力蛋白的免疫保護效果進行分析后，截短&isA被發現是保護效果最好的蛋白。本研究擬在大腸桿菌中的可溶性高表達制備具有天然構象的亞單位疫苗，并對該疫苗的免疫劑量、免疫效價、保護效果等方面進行研究并進一步探索截短的&isA作為亞單位疫苗可行性，為下一步深入制備金黃色葡萄球菌亞單位疫苗奠定基石出。

發明內容
本發明的目的是提供一個經優化后可以在大腸桿菌中進行高效可溶性表達且能夠激發機體對金黃色葡萄球菌感染產生免疫保護作用的金黃色葡萄球菌截短MsA基因及其編碼蛋白在金黃色葡萄球菌亞單位疫苗中的應用。本發明所提供的金黃色葡萄球菌截短MsA基因，名稱為tSasA，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No. 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID No. 2的DNA序列；3)與序列表中SEQ ID No. 1限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有激發機體對金黃色葡萄球菌感染產生免疫保護作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No. 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列表中的SEQ ID No. 1由882個堿基組成，其編碼序列為自5’端第882堿基， 編碼具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列的蛋白質。所述金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼的蛋白tSasA，是下述氨基酸殘基序列之1)序列表中的 SEQ ID No. 2 ；2)將序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且具有激發機體對金黃色葡萄球菌感染產生免疫保護作用的蛋白質。序列表中的SEQ ID NO. 2由294個氨基酸殘基組成。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以使非結構域中的氨基酸殘基， 其改變不會對該蛋白的功能產生影響。含有本發明基因金黃色葡萄球菌截短MsA基因細胞系及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。以pET21a(+)為載體，構建的含有金黃色葡萄球菌截短MsA基因tMsA的重組原核表達載體為pET21a-t&isA。本發明還提供了一種表達金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白tSasA的方法。本發明所提供的表達上述金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白t&isA的方法是將上述含有金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼t&isA重的組表達載體導入宿主細胞，表達得到金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白tSasA。所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌等，優選為大腸桿菌。所述大腸桿菌可為E.coli DH5 α、Ε· coli BL21 (DE3)、Ε· coli BL21 (DE3)pLysS或 Ε. coliToplO 等。上述重組均可按照常規方法構建。培養含有金黃色葡萄球菌截短MsA基因t&isA的宿主細胞的培養基和培養條件， 均可為培養出宿主的培養基和培養條件。其中，培養所述重組大腸桿菌時需加入誘導劑， 如IPTG等，所加入IPTG的濃度為0. 1-1. OmM，優選為0. 2mM，誘導溫度為16_37°C，優選為 37°C，誘導時間為4-8h，優選為他。本發明提供了一種金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白tSasA的純化方法，可通過QFF柱和鎳柱兩步純化獲得較高純度的蛋白。本發明的金黃色葡萄球菌截短MsA基因所編碼的蛋白可用于制備金黃色葡萄球菌亞單位疫苗。需要的時候，以金黃色葡萄球菌截短MsA基因編碼蛋白制備的金黃色葡萄球菌亞單位疫苗還可以融入顆粒白細胞-巨噬細胞集落刺激劑因子(GM-CSF)、干擾素-Y (IFN- Y )、白介素2 (IL-2)、TGF- β 4等一種或多種細胞因子的基因或蛋白質作為分子免疫佐劑。本發明的疫苗可以制成注射液、干粉針劑或噴霧劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規方法制備。上述亞單位疫苗的用量可采用藥學領域中亞單位疫苗的常規劑量，如1-10 μ g，并可根據實際情況調整。本發明提供了一種在大腸桿菌中高效可溶性表達金黃色葡萄球菌截短&isA基因編碼蛋白的方法。根據金黃色葡萄球菌S. aureus MASA252株的測序結果(GenBank BX571856. 1)，設計引物以S. aureus 12598菌株的基因組DNA為模板，擴增得到編碼金黃色葡萄球菌&isA 48-333aa的基因，序列如SEQ ID No. 1，其編碼的蛋白序列如SEQ ID No. 2。 在t&isA序列的兩端分別加入NdeI和BioI酶切位點。擴增得到的基因經雙酶切后連接入表達載體pET21a(+)中，重組金黃色葡萄球菌tSasA在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了可溶性高表達，目的蛋白占碎菌上清總蛋白的約30%。經QFF柱和鎳柱兩步純化后，目的蛋白純度可達85 %以上，。通過本發明的方法制備的重組蛋白具有很好的免疫原性，能夠誘導小鼠產生高滴度保護性抗體，抵御致死劑量金黃色葡萄球菌的攻擊。本發明在金黃色葡萄球菌重組亞單位疫苗的大規模高效制備中具有廣闊的應用前景。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為金黃色葡萄球菌tSasA蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的可溶性表達的 SDS-PAGE蛋白電泳圖。其中M為蛋白分子量標準；1為表達金黃色葡萄球菌tSasA的 BL21(DE3)碎菌上清；2為空載體碎菌上清。圖2為經QFF柱和鎳柱兩步純化后得到的tSasA的SDS-PAGE蛋白電泳圖。圖3為金黃色葡萄球菌tMsA蛋白免疫BALB/c小鼠后檢測血清中的抗體滴度。圖4為金黃色葡萄球菌t&isA蛋白免疫后BALB/c小鼠在致死劑量金黃色葡萄球菌感染后的存活曲線。
具體實施例方式實施例一、金黃色葡萄球菌截短MsA基因片段獲得根據報導的Maphylococcus Aureus MASA252 株的序列(GenBank :ΒΧ571856· 1)， 對基因編碼的蛋白全長進行分析后，設計引物擴增142-999bp片段，在tSasA序列的兩端分別加入NdeI和B10I酶切位點，并去除終止密碼子，在3’端引入編碼6個組氨酸的序列。實施例二、金黃色葡萄球菌截短&isA表達載體構建將擴增得到的t&isA基因用NdeI和XhoI雙酶切后，連接入同樣用NdeI和XhoI 雙酶切后的表達載體pET21a(+)上，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5ci，37°C培養過夜。次日挑取單克隆于5mL LB (Amp+)培養基中，37°C，220rpm培養12h，提取質粒，NdeI和XhoI雙酶切鑒定目的基因的插入，并送測序。測序正確的質粒命名為pET21a-t&iSA。實施例三、金黃色葡萄球菌截短MsA的大腸桿菌表達及western-blot鑒定正確連接入t&isA基因的pET21a(+)載體，轉化大腸桿菌感受態細胞BL21 (DE3)， 挑取單克隆于5mL LB (Amp+)液體培養基中，37°C，220rpm培養至0D600nm ^0.6時，加入終濃度為ImM的IPTG，28°C，220rpm繼續培養乩。5，000g，4°C離心收集菌體，用PBS重懸后超聲碎菌。12，000g，4°C離心取上清，行SDS-PAGE電泳，以空載體表達產物為對照，鑒定大小為40kDa的t&isA蛋白的表達。Western-blot分析tSasA蛋白與鼠抗His標簽單克隆抗體的特異性結合。將含有 tSasA蛋白的超聲碎菌上清及空載體碎菌上清行SDS-PAGE蛋白電泳后，蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用含3% BSA的PBS室溫封閉Ih后，加入1 1000稀釋的鼠抗His標簽單克隆抗體，37°C反應lh。將膜用PBST洗滌4遍后，加入1 5000稀釋的辣根酶標記的羊抗鼠 IgG 二抗，37 V反應Ih后PBST洗滌4遍，采用化學發光法顯色、壓片、曝光。從圖1的實驗結果可以看到，與空載體對照相比，轉化有pET21a-t&iSA質粒的菌株在40kDa左右有明顯的條帶，western-bolt結果證實該蛋白可與鼠抗His標簽單克隆抗體發生特異性的結合，說明該條帶即為tSasA目的條帶。經薄層掃描分析目的蛋白約占碎菌上清總蛋白的20%，說明t&isA蛋白在大腸桿菌中得到了高效可溶性表達。實施例四、金黃色葡萄球菌tSasA的大腸桿菌發酵及純化表達tSasA蛋白的種子液1L，轉接入30L發酵罐中，培養至0D600nm竺0. 6時， 加入終濃度為ImM的IPTG，37°C，300rpm繼續培養乩。10，000g，4 °C離心收集菌體，用 20mMTris-HCl緩沖液(pH8. 5)重懸后勻漿碎菌。20，000g，4°C離心收集上清。上清液過QFF 柱進行陰離子交換，流出液用20mM NaH2PO4,0. 5M NaCl (pH7. 4) 3倍稀釋后進行鎳柱純化，用 20mM NaH2PO4,0. 5M NaCl，0. 5M咪唑(pH7. 4)進行連續梯度洗脫。經過兩步純化后，目的蛋白t&isA得到了很好的純化，純度可達85%以上(圖2)，目的蛋白最終保存在PBS緩沖液中。實施例五、tSasA蛋白的免疫原性研究按10μ g/只小鼠的tSasA蛋白與鋁佐劑混勻后，4°C吸附過夜，腹腔免疫6_8周齡BALB/c小鼠，每兩周免疫一次，共免疫三次，第二次和第三次免疫后7天取血檢測血清中的抗體滴度；抗體滴度的測定采用ELISA的方法，金黃色葡萄球菌t&isA蛋白2μ g/mL， 100 μ L/孔包被96孔酶聯板，4°C包被過夜。PBST洗滌4次，5min/次。將抗血清用PBST從 1 100依次倍比稀釋后，加入酶聯板中，37°C反應lh，同時設PBS免疫后的血清為對照。 PBST洗滌4次，5min/次。加入HRP-抗小鼠鼠二抗，37°C反應30_40min。加入TMB顯色液， 50 μ L/孔，顯色后用2MH2S04終止，酶標儀450nm測定光吸收值。以加入陰性對照血清孔的顯色值為對照，以0D450nm大于0. 1且高于陰性孔2倍為陽性稀釋滴度。從實驗結果可以看到，t&isA組的抗體滴度基本在1 128000以上。實施例六、tSasA蛋白免疫可避免致死劑量金黃色葡萄球菌引起的小鼠死亡。挑取金黃色葡萄球菌菌株USA300單克隆接種至5mL營養肉湯培養基中，37°C、 220rpm培養過夜，然后按1 100轉種至200mL應用肉湯培養基中，37°C、220rpm培養證， SOOOrpm離心收集菌體，菌體沉淀用IOOmL PBS洗滌兩遍，然后用IOmL PBS重懸，用比濁法測定菌體濃度。調整菌體濃度為SXlOicVmLt5取tSasA蛋白三次免疫的小鼠，腹腔注射金黃色葡萄球菌USA3003X IO9/只小鼠，觀察小鼠的存活。tMsA蛋白免疫小鼠生長狀態較好， 小鼠存活率顯著高于對照組，具有很好的預防效果。SEQ ID No. 1<110>軍事醫學科學院微生物流行病研究所<120>金黃色葡萄球菌截短MsA蛋白在大腸桿菌中的高效表達及應用<160>權利要求
1.截短的金黃色葡萄球菌MsA基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID No. 1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQID No. 2的蛋白序列；3)與序列表中SEQID No. 1限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有激發機體對金黃色葡萄球菌產生免疫保護作用的核苷酸序列；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQID No. 1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述基因編碼的蛋白。
3.根據權利要求2所述的蛋白，其特征在于所述蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQID No. 2 ；2)將序列表中SEQID No. 2的氨基酸殘基序列經過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有激發機體對金黃色葡萄球菌產生生免疫保護作用的蛋白質。
4.含有權利要求1所述基因的表達載體、轉基因細胞系和宿主菌。
5.一種表達權利要求2或3所述金黃色葡萄球菌MsA基因編碼蛋白的方法，是將含有權利要求1所述金黃色葡萄球菌MsA基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到金黃色葡萄球菌MsA基因編碼蛋白。
6.權利要求2或3所述金黃色葡萄球菌MsA基因編碼蛋白在制備破傷風毒素亞單位疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及在大腸桿菌中高效表達金黃色葡萄球菌截短的SasA(Serine-rich adhesion forplatelets)蛋白的方法。根據GenBank報導的金黃色葡萄球菌SasA基因全長序列(GenBankBX571856.1)，設計引物擴增金黃色葡萄球菌SasA基因的142-999bp，擴增得到的基因序列如SEQ ID No.1，其編碼的蛋白序列如SEQ ID No.2。擴增得到的SasA基因經雙酶切后連接入表達載體pET21a(+)中，重組SasA蛋白在大腸桿菌中獲得了可溶性高表達，目的蛋白占碎菌上清總蛋白的約20％。經QFF柱、鎳柱純化后，目的蛋白純度可達85％以上。通過本發明的方法制備的重組蛋白具有很好的免疫原性，能夠誘導小鼠產生高滴度保護性抗體，抵御致死劑量金黃色葡萄球菌引起的小鼠死亡。本發明在金黃色葡萄球菌重組亞單位疫苗的大規模高效制備中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/31GK102268444SQ20101019095
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月3日 優先權日2010年6月3日
發明者于婷, 于長明, 付玲, 任軍, 侯利華, 徐俊杰, 易紹瓊, 陳薇 申請人:軍事醫學科學院微生物流行病研究所