專利名稱：一種從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法
技術領域：
本發明屬于生物化工領域，涉及一種從大腸桿菌懸浮液中提取、制備低蛋白質含量、高品質的谷胱甘肽的方法，屬于谷胱甘肽制備技術領域。
背景技術：
谷胱甘肽，即是L -谷氨酰-L -半胱氨酰甘氨酸(縮寫GSH)，是由L-谷氨酸、L -半胱氨酰和甘氨酸經肽鍵縮合而成的一種同時具有谷氨?；蛶€基的生物活性三肽化合物。谷胱甘肽有兩種形式還原型GSH和氧化型GSSG，只有GSH才具有活性，而生物體內的GSSG需還原后才能發揮其重要的生理功能。還原型谷胱甘肽固體較為穩定，但其水溶液在空氣中極易被氧化成氧化型谷胱甘肽GSSG。GSH在自然界中廣泛分布于動物、植物和微生物細胞內。GSH在生物體內有著多種重要的生理功能，特別是對于維持生物體內適宜的 氧化還原環境起著至關重要的作用。GSH還具有獨特的生理功能，被稱為長壽因子和抗衰老因子。由于GSH在強化食品風味的同時對人體有保健作用，它的應用前景顯然要優于其它類型的防腐劑或抗氧化劑。隨著GSH的生理生化功能和性質被不斷研究發現，GSH作為一種多功能的生物活性添加劑在食品加工業中的應用將會愈來愈廣，GSH的需求量正日益增大。生物發酵法生產谷胱甘肽的方法不斷得到改進，已經成為目前國內外生產谷胱甘肽最普遍的方法。但要從菌體發酵液中獲得純度很高的GSH，一直成為國內外研究的熱點。到目前為止報道的分離提純GSH的方法有銅鹽法、離子交換、親和層析、雙水相分離等。銅鹽法是一種比較傳統的方法，有一定實用價值，目前仍然被一些GSH生產工藝所應用，但污染較大，工藝復雜，所以隨著各項新的分離純化技術的出現，必將逐漸被淘汰。由于氨基酸和多肽類物質為具有弱堿性和弱酸性官能團的兩性化合物，因此采用陰陽離子交換樹脂吸附、解吸的方法來使得氨基酸和膚類化合物和其他物質快速有效的分離。該方法經濟效益較高，可望完全代替銅鹽法。親和層析方法是一種有效的分離純化GSH的方法。一般而言含汞樹脂對酸堿比較敏感，穩定性比較差，在工業應用上有一定的限制。近年來我國離子交換樹脂工業發展迅速，國產離子交換樹脂的價格相對于進口樹脂價格大大降低，使得離子交換法在生化物質的分離方面的研究不斷深入。離子交換法能夠將帶電情況不同的物質進行分離，廣泛應用于天然活性成分的研究中。對于離子交換法，國內外對陽離子交換樹脂的研究比較多，但大多GSH的回收率很低，只達到32. 9%—57. 6%，同時獲得的產品純度普遍較低。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術存在的不足，提供一種從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法，是利用生物發酵法在大腸桿菌中表達積累谷胱甘肽后，通過先進的分離純化手段制備高品質、高含量的谷胱甘肽的方法，制備的產品以富含谷胱甘肽的作為高端食品添加劑存在。為解決上述技術問題，本發明所提供的技術方案是一種從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法，包括步驟如下
(I)用2±0· 5moIH2SO4調節大腸桿菌懸浮液的pH值為2-3，經過2. 5±0· 5MPa勻漿均質機破壁得破壁好的懸浮液，所述的破壁時間為45-60min ；
(2)將破壁好的懸浮液離心得到離心上清液，離心轉速為5000土 lOOrpm，時間為10-15 min ；
(3)將離心上清液經陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂連續吸附與解吸，收集富含谷胱甘肽的高峰液；
(4)將谷胱甘肽高峰液進行低溫濃縮成谷胱甘肽濃縮液，再將谷胱甘肽濃縮液冷凍干燥即得白色粉末狀谷胱甘肽成品。
進一步在上述從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法中，所述步驟3的陽離子樹脂交換是指將型號為DOOl陽離子交換樹脂裝柱，柱體積6CmX80Cm，將離心上清液直接上柱，其上柱時pH值為2-3，流速為100ml/min，上樣直至飽和；用3_5倍柱體積的以鹽酸調pH值為4的蒸餾水洗樹脂柱，將雜質洗去，再用3-5倍柱體積的I. 5%HC1洗脫，其洗脫速度為100ml/min，洗脫收集DOOl陽離子高峰液。所述步驟3的陰離子樹脂交換是指將型號為D293陰離子交換樹脂裝柱，柱體積6cmX80cm，將DOOl陽離子高峰液直接上柱，速度為100ml/min，收集富含谷胱甘肽的高峰液。所述步驟4的低溫真空濃縮條件是真空度
O.9±0. IMPa，旋轉速度130±20 rpm，溫度55_60°C，濃縮至谷胱甘肽高峰液重量百分濃度的8-10倍，得谷胱甘肽濃縮液。所述步驟4的冷凍干燥條件是將谷胱甘肽在低溫條件下經納濾濃縮與真空低溫濃縮后的濃縮液在_72±5°C下干燥28±2h，即得白色粉末狀谷胱甘妝成品。與現有技術相比，本發明從谷胱甘肽大腸桿菌的懸浮液中提取GSH的過程分為提取和濃縮兩個部分，提取為從含有谷胱甘肽的大腸桿菌中，通過菌體破壁抽提，懸浮液的固液分離，得到含有谷胱甘肽的上清液，經過離子交換樹脂技術、代溫納濾濃縮、真空低溫濃縮、冷凍干燥得到GSH。用2molH2S04調節pH值，經過高壓勻質器破壁，高速離心得到含有的谷胱甘肽的上清液。采用在破壁前調節pH值，不僅有利于GSH的穩定，而且可以使大分子蛋白質變性沉淀，除去大部分蛋白質。陽陰離子交換技術去除大分子雜質和脂類色素物質，最終達到從懸浮液中分離、純化、濃縮谷胱甘肽的操作工序，有效的去除菌體細胞碎片、大分子蛋白、有色物質，尤其是離子交換技術適合大規模的工業化生產。該法操作簡單、高效、費用低廉、成品純度較高、環境污染小、易于工業化。制得GSH產品的純度為95%以上、蛋白質含量為I. 3%、提取收率為86. 5%的谷胱甘肽成品。
具體實施例方式為更好理解本發明，下面結合實施例對本發明作進一步介紹，但需要說明的是，本發明所要求的保護的范圍并不局限于實施例所表述的范圍。實施例I
發酵培養得到的谷胱甘肽大腸桿菌懸浮液，成份分析結果菌體275g/L;GSH含量
3.95 g/L。將上述30L懸浮液用2 mo I/L硫酸調節pH至2_3范圍內，經過高壓勻質器破壁45-60min，將破碎好的懸浮液，經高速冷凍離心機分離，條件5°C -10°C，5000rpm，15min。得到離心上清液12L，取12L上清液直接上DOOl陽離子交換樹脂柱，柱體積為6mX80cm，流速為100ml/min，上樣直至飽和；用3_5倍柱體積的pH 4. O的PBS緩沖液洗樹脂柱，將雜質洗去，再用3-5倍柱體積的I. 5% HCl洗脫，其洗脫速度為100ml/min，洗脫收集富含DOOl陽離子高峰液。再將DOOl陽離子高峰液直接上D293陰離子交換樹脂柱，速度為100ml/min，收集富含谷胱甘肽的脫色高峰。此時GSH回收率為93. 1，蛋白質去除率為78%。將上述經吸附柱濃縮后的谷胱甘肽濃縮液進行真空濃縮，按照下列條件進行真空度O. 9MPa，旋轉速度130 rpm，溫度35V -60°C濃縮至8倍。將谷胱甘肽濃縮液進行冷凍干燥，于_72°C下干燥28 h后得到白色粉末狀谷胱甘肽成品。此時谷胱甘肽的純含量為102. 52 g，提取收率為86. 5%。谷胱甘肽呈白色粉末狀物質，具有良好的感官品質。對比實施例I
改變破壁pH。在破壁前不用硫酸所調pH值，其它操作同實施例I 一樣操作。 結果谷膚甘肽的純含量為36. 85g，提取收率為31. 1%
對比實施例2
改變所用的洗脫劑，將I. 5%的HCl改為采用I. 5%NaCl為洗脫劑。其他操作同實施例I。結果提取收率為72. 4%，蛋白質去除率40. 6%
對比實施例3
陽離子交換樹脂前不用調節PH值，其他操作同實施例1，結果離交后因雜質太多，無法離交高峰的純度明顯下降，純含量只有38. 32%。對比實施例4
依照實施例I方法，將谷胱甘肽低溫濃縮液進行真空干燥，最終得到谷胱甘肽26. 43g，提取收率為22. 3%。對比實施例5
對比其他的干燥方式，凍干的損失率最低，真空烘干損失率69. 3% ;鼓風烘干損失率87. 7%。通過上述對比說明，本發明操作簡單、高效、費用低廉、成品純度較高、環境污染小、易于工業化。
權利要求
1.一種從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征步驟如下 (1)用2±0·5moIH2SO4調節大腸桿菌懸浮液的pH值為2-3，經過2. 5±0· 5MPa勻漿均質機破壁得破壁好的懸浮液，所述的破壁時間為45-60min ； (2)將破壁好的懸浮液離心得到離心上清液，離心轉速為5000±100rpm，時間為10-15min ； (3)將離心上清液經陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂連續吸附與解吸，收集富含谷胱甘肽的高峰液； (4)將谷胱甘肽高峰液進行低溫濃縮成谷胱甘肽濃縮液，再將谷胱甘肽濃縮液冷凍干燥即得白色粉末狀谷胱甘肽成品。
2.根據權利要求I所述的從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于所述步驟3的陽離子交換樹脂是指將型號為DOOl陽離子交換樹脂裝柱，柱體積6cmX80cm，將離心上清液直接上柱，其上柱時pH值為2-3，流速為100ml/min，上樣直至飽和；用3_5倍柱體積的PH值為4. O的PBS緩沖液洗樹脂柱，將雜質洗去，再用3-5倍柱體積的I. 5%HC1洗脫，其洗脫速度為100ml/min，洗脫收集DOOl陽離子高峰液。
3.根據權利要求I所述的從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于所述步驟3的陰離子交換樹脂是指將型號為D293陰離子交換樹脂裝柱，柱體積6cmX80cm，將DOOl陽離子高峰液直接上柱，速度為100ml/min，收集富含谷胱甘肽的高峰液。
4.根據權利要求I所述的從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于所述步驟4的低溫真空濃縮條件是真空度O. 9±0. IMPa,旋轉速度130±20 rpm,溫度350C _60°C，濃縮至谷胱甘肽高峰液重量百分濃度的8-10倍，得谷胱甘肽濃縮液。
5.根據權利要求I所述的從大腸桿菌懸浮液中提取谷胱甘肽的方法，其特征在于所述步驟4的冷凍干燥條件是將谷胱甘肽超濃縮液在-72±5°C下干燥28±2h，即得白色粉末狀谷胱甘肽成品。
全文摘要
本發明公開了一種從大腸桿菌中提取谷胱甘肽的方法，是通過調節大腸桿菌懸浮液的pH值、高壓勻質破壁、離心分離得到上清液，再使用離子交換樹脂去除大分子雜質和脂類色素，將離子交換純化液低溫濃縮后，冷凍干燥最終達到從大腸桿菌中分離純化還原型谷胱甘肽成品。制得谷胱甘肽成品GSH產品的純度95%以上、蛋白質含量為1.3%、提取收率為86.5%。
文檔編號C07K1/18GK102942615SQ20121041192
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月25日 優先權日2012年10月25日
發明者朱義福, 吳平剛, 周新榮 申請人:廣東肇慶星湖生物科技股份有限公司