專利名稱：一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬反硝化菌的篩選純化領(lǐng)域，特別是涉及一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化 篩選純化方法。
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)廢水和生活污水的大量排放，水體富營養(yǎng)化日益嚴(yán)重，高效去除水中氮 素污染成為當(dāng)今的一個(gè)熱點(diǎn)問題。氮污染主要來源為城市污水、工業(yè)廢水、畜禽養(yǎng)殖廢水、 垃圾填埋滲濾液等，污染物持續(xù)進(jìn)入水體，造成水生植物和藻類過度生長，同時(shí)藻類產(chǎn)生的 毒素引起引起魚和其他水生需氧動物死亡。傳統(tǒng)理論認(rèn)為反硝化是一個(gè)嚴(yán)格的厭氧過程， 而自20世紀(jì)80年代首次發(fā)現(xiàn)好氧反硝化菌后，好氧反硝化菌的分離及其性能研究迅速發(fā) 展，國內(nèi)外最近報(bào)道的有戴爾福特菌屬(Delftia)，沙門氏菌屬(Salmonella)和假單胞菌 屬(Pseudomonas)等。C. W. Lindau和M. Robert Hamersley等則分別證實(shí)了河流和湖泊等 地表水中，都存在著大量的反硝化菌和厭氧氨氧化細(xì)菌，而蘇州河是上海市內(nèi)重要的水體 功能地表水，但由于其接納的污水量大，污染負(fù)荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過自凈能力，水質(zhì)受到嚴(yán)重污染， 各種水體功能也因此受到損害，因此在污染較嚴(yán)重的地段能篩選出高性能的反硝化菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化 方法，該方法簡單，成本低，材料來源廣泛，適合于共業(yè)化生產(chǎn)；所得解鳥氨酸克雷伯菌 (Klebsiellaornithinolytica)反硝化效率可達(dá)87. 6 %，且易于滅活，保證了使用的生態(tài) 安全性。本發(fā)明的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，包括(1)將污水按1 100的體積比接入富集培養(yǎng)基，于30°C，110r/min搖床中富集培 養(yǎng) 24h ；(2)將步驟(1)富集培養(yǎng)后的菌株用稀釋平板涂布法轉(zhuǎn)接至固體分離培養(yǎng)基，置 于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 48h，經(jīng)過3次劃線分離得到純化菌種；(3)將純化菌種富集后，按18 23%的接種量接種到液體分離培養(yǎng)基，測試菌株 在30°C、好氧條件下培養(yǎng)24h時(shí)的反硝化率，篩選出反硝化率達(dá)75%以上的單一菌株，轉(zhuǎn)接 斜面培養(yǎng)基，4°C下保存。所述的污水取自蘇州河。所述步驟(1)中的富集培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g， NaC15g，蒸餾水1000ml，pH 7. 4-7. 6 ；固體培養(yǎng)基中加入18g/L的瓊脂粉。所述步驟(2)和(3)中的分離培養(yǎng)基為碳源3 5g，KN032g, K2HPO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 05g, CaCl2O. 02g，定容到 1000ml，調(diào)節(jié) pH 7. 4-7. 6 ；固體 培養(yǎng)基另外加1.8% W/V瓊脂。所述的碳源為乙酸鈉、丙酸鈉、乙醇、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、甲醇、硫代硫酸鈉、葡萄糖或碳酸氫鈉。所述的碳源為葡萄糖，在分離培養(yǎng)基中的用量為5g，培養(yǎng)基初始pH值為7. 5。所述步驟(3)中的菌株為較短粗的桿菌，單獨(dú)排列，無芽胞，無鞭毛，長度約 0. 8-1. 5微米，直徑約0. 3-0. 6微米；菌落呈灰白色，圓形；革蘭氏染色呈陰性。所述菌株經(jīng)16S rDNA序列測定和分析比較，鑒定為解鳥氨酸克雷伯菌，命名為 Klebsiella ornithinolytica N-4，同源性達(dá)到 97%。本發(fā)明為污染治理提供了新的方法。有益效果(1)本發(fā)明的方法簡單，成本低，材料來源廣泛，適合于工業(yè)化生產(chǎn)；(1)本發(fā)明所得的解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N_4具 有較高的反硝化作用，反硝化效率可達(dá)87. 6% ；菌株在好氧的條件下具有良好效果，能 適應(yīng)復(fù)雜的實(shí)際條件，在培養(yǎng)基上能存活數(shù)周至數(shù)月；解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的種源為蘇州河污染嚴(yán)重的路段，解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica) N-4對一般抗生素均無抗性，且易于滅活，55°C 30分鐘即可殺死，保證了 使用的生態(tài)安全性。


圖1為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的系統(tǒng)進(jìn)化樹；圖2為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的掃描電鏡；圖3為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4的革蘭氏染色效果 圖；圖4為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N_4的生長曲線及其反 硝化效果；圖5為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N_4在不同接種量下所 需的反硝化時(shí)間；圖6為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N_4在不同溫度下的反 硝化效果；圖7為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4在不同pH下的反 硝化效果；圖8為解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)N-4降解速率的測定。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實(shí)施例1高效脫反硝化菌的分離篩選與鑒定(1)將蘇州河不同地段取回來的水樣，分別吸取Iml至裝有100ml富集培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，30°C，110r/min搖床中培養(yǎng)24h ；富集培養(yǎng)基蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g，NaCl 5g，蒸餾水1000ml， pH 7. 4-7. 6。(2)然后用稀釋平板涂布法接種至固體分離培養(yǎng)基，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 48h，經(jīng)過3次劃線分離得到純化菌種；分離培養(yǎng)基葡萄糖5g，KN032g，K2HPO4O. 5g，MgSO4 ·7Η20 0. 2g，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 0. 05g, CaCl2O. 02g，瓊月旨 18g，定容至Ij 1000ml，調(diào)節(jié) pH 7· 4 7· 6。(3)將純化得到的菌株富集后，按20%接種量接種到反硝化試驗(yàn)培養(yǎng)基中(即液 體分離培養(yǎng)基)，測試各菌株在不同碳源(乙酸鈉、丙酸鈉、乙醇、木糖、乳糖、酒石酸鉀鈉、 甲醇、硫代硫酸鈉、葡萄糖或碳酸氫鈉)中，于30°C、好氧條件下培養(yǎng)24h時(shí)后的反硝化率， 篩選出反硝化率在75%以上性能良好的菌株；反硝化試驗(yàn)培養(yǎng)基葡萄糖5g (或等量替代上述碳源)，KN032g, K2HPO4O. 5g， MgSO4 · 7H20 0. 2g, FeSO4 · 7H20 0. 05g, CaCl2O. 02g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 4 7. 6。(4)然后對菌體進(jìn)行革蘭氏染色(圖3)和電鏡掃描(圖2)，觀察菌株的外部形態(tài) 特征，并將分離出的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上(酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂18g， 蒸餾水1000ml，pH 7. 0-7. 2)，4°C下保存于冰箱中待后續(xù)進(jìn)行降解試驗(yàn)，同時(shí)將單一菌落送 至上海基康生物技術(shù)公司測定全序列，確定菌種類型。實(shí)施例2高效反硝化菌的最佳條件將實(shí)施例1篩選出的性能最好的反硝化菌命名為N-4。將N-4菌種以接種量，分別接種于實(shí)施例1富集培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基，在30°C 好氧條件下，檢測30h內(nèi)菌種生物量及其硝態(tài)氮含量的變化(圖4)，由圖可知，生物量在 15h前后達(dá)到峰值，而硝態(tài)氮含量在24h達(dá)到最低，并且在接種量較小情況下，菌種延遲期 時(shí)間較長，不能短時(shí)間內(nèi)發(fā)揮反硝化作用。然后分別測定N-4菌在-30%接種量情況下 (其余培養(yǎng)條件相同)，反硝化所需的時(shí)間(圖5)，由圖可知，在接種量由增加到20% 時(shí)，反硝化時(shí)間大大縮短，但當(dāng)接種量大于20%后，反硝化時(shí)間都沒有太大變化，而且隨菌 體濃度增加，營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快，菌體進(jìn)入衰亡期時(shí)間提前，不利于長期觀察。因此菌株N-4 的最佳接種量為20%左右。(1)將菌株N-4接種于不同初始pH值的試驗(yàn)培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基成分相同)，接種 量為20%，30°C培養(yǎng)24h，測定反硝化率知反硝化適宜在偏堿條件下(pH為6. 5 8. 5)進(jìn) 行，PH低于7. 0和高于8. 0反硝化速率下降幅度很大見(圖6)，最適生長pH值為7. 5。(2)不同溫度下，在pH值7. 5的反硝化試驗(yàn)培養(yǎng)基中接入20%的含菌株N_4的培 養(yǎng)液，培養(yǎng)測定菌株N-4的反硝化速率和反硝化率(圖7)。由圖7可知30°C時(shí)菌株N-4的 反硝化效率最大，從應(yīng)用角度考慮，生物反硝化宜選用在30°C左右條件下進(jìn)行。通過生長條件優(yōu)化得出N-4的最適生長條件為在葡萄糖為唯一碳源下，最適接種 量為20%，最適培養(yǎng)基初始pH值為7. 5，最佳溫度為30°C。實(shí)施例3高效反硝化菌的降解效率分析在反硝化試驗(yàn)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基初始PH值調(diào)為7.5，NO3-N質(zhì)量濃度為280mg · 此處的濃度是否根據(jù)培養(yǎng)基中KN032g的量換算得到)接種量為20%，在30°C 下培養(yǎng)，間隔2h取樣測定培養(yǎng)基中硝態(tài)氮的降解速率(圖8)。由圖可知，N-4對NO3-N的 降解效果良好，在培養(yǎng)基中延遲期很短。在0 8h營養(yǎng)液中的NO3-N濃度迅速下降，8h后 NO3-N濃度繼續(xù)呈下降趨勢，但趨于平緩，16h內(nèi)降解率達(dá)87.6%。反硝化試驗(yàn)培養(yǎng)基葡萄糖5g，KN032g，K2HPO4O. 5g，MgSO4 · 7H20 0. 2g， FeSO4 · 7H200. 05g, CaCl2O. 02g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 5。表1反硝化菌株篩選的碳源試驗(yàn)
權(quán)利要求
一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，包括(1)將污水按1∶100的體積比接入富集培養(yǎng)基，于30℃，110r/min搖床中富集培養(yǎng)24h；(2)將步驟(1)富集培養(yǎng)后的菌株用稀釋平板涂布法轉(zhuǎn)接至固體分離培養(yǎng)基，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，經(jīng)過3次劃線分離得到純化菌株；(3)將純化菌株富集后，按18～23％的接種量接種到液體分離培養(yǎng)基，測試菌株在30℃、好氧條件下培養(yǎng)24h時(shí)的反硝化率，篩選出反硝化率為75％-100％的單一菌株，轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，4℃下保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特征在 于所述步驟⑴中的富集培養(yǎng)基為蛋白胨10g，牛肉浸出粉4g，酵母浸出粉3g，NaCl 5g， 蒸餾水1000ml，pH 7. 4-7. 6 ；固體培養(yǎng)基中加入18g/L的瓊脂粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特 征在于所述步驟⑵和(3)中的分離培養(yǎng)基為碳源3 5g，KN032g, K2HPO4O. 5g, MgSO4 · 7Η200· 2g, FeSO4 · 7Η20 0. 05g, CaCl2O. 02g，定容到 1000ml，調(diào)節(jié) pH 7. 4-7. 6 ；固體 培養(yǎng)基另外加1.8% W/V瓊脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特征在 于所述的碳源為乙酸鈉、丙酸鈉、乙醇、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、酒石酸鉀鈉、甲醇、硫代硫酸 鈉、葡萄糖或碳酸氫鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特征 在于所述的碳源為葡萄糖，在分離培養(yǎng)基中的用量為5g，培養(yǎng)基初始pH值為7. 5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，其特征在 于所述步驟(3)中的菌株經(jīng)16S rDNA序列測定和分析比較，鑒定為解鳥氨酸克雷伯菌，命 名為Klebsiella ornithinolytica N_4，同源性達(dá)到97% ；菌株為短粗的桿菌，單獨(dú)排列， 無芽胞，無鞭毛，長度0. 8-1. 5微米，直徑0. 3-0. 6微米；菌落呈灰白色，圓形；革蘭氏染色 呈陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種解鳥氨酸克雷伯菌的反硝化篩選純化方法，包括將污水按1∶100的體積比接入富集培養(yǎng)基，于30℃，110r/min搖床中富集培養(yǎng)24h；將富集培養(yǎng)后的菌株轉(zhuǎn)接至固體分離培養(yǎng)基，經(jīng)過3次劃線分離得到純化菌株；將純化菌株按18～23％的接種量接種到液體分離培養(yǎng)基，測試菌株在30℃、好氧條件下培養(yǎng)24h時(shí)的反硝化率，篩選出反硝化良好的單一菌株。本發(fā)明的方法簡單，成本低，材料來源廣泛，適合于共業(yè)化生產(chǎn)；所得解鳥氨酸克雷伯菌(Klebsiella ornithinolytica)反硝化效率可達(dá)87.6％，且易于滅活，保證了使用的生態(tài)安全性。
文檔編號C12N1/20GK101886053SQ20101019550
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月8日
發(fā)明者孫超, 王苑, 趙曉祥, 魏俊虎 申請人:東華大學(xué)