專利名稱：控制水稻谷物產量,開花期及植株高度的多效性基因Ghd8的克隆及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域。具體涉及一個影響水稻谷物產量，開花期及 植株高度多效性基因GhdS的克隆及應用。本發明對該具有巨大效益的數量性狀位點基因 進行了精細定位，利用農桿菌介導的遺傳轉化，對該基因的功能進行了驗證；同時構建了該 基因不同等位基因型的近等基因系，對該基因不同等位基因型的功能進行了驗證。
背景技術：
目前，世界人口迫近70億，其中一半人口以水稻作為主糧。要滿足日益增長的人 口對糧食的需求，尤其在當今經濟發展可耕地面積不斷減少的情況下提高水稻的單位面積
產量具有重大意義。水稻產量是由多種因素共同影響的復雜農藝性狀，其構成因子主要包括株高，穗 粒數，抽穗期，結實率，分蘗數，千粒重等。每穗實粒數是每穗穎花數和結實率決定的，而每 穗穎花數指每個稻穗上穎花的數目，直接決定水稻谷物產量。水稻的植株高度是重要的株 型指標，決定著水稻的抗倒伏性與生物學產量，并作用于水稻谷物產量，植株高度的改良亦 是理想株型育種的重要方面。在當前分子育種及轉基因育種已經成為突破水稻產量瓶頸的 必然之選的情況下尋找控制每穗實粒數，抽穗期和株高的關鍵位點及至克隆相應基因并闡 明其遺傳基礎和分子機理，具有重大理論及實踐意義。水稻的穗粒數，抽穗期及株高是一類受多基因控制的復雜性狀，在分離后代中呈 現連續正態分布規律的表型變異。這些多基因被稱作數量性狀基因位點(quantitative trait loci，QTL)。產量等典型數量性狀本身受多基因控制，很難在F2即出現單基因分離， 一般還需要構建遺傳背景一致的近等基因系使目標性狀呈現單基因控制的孟德爾分離。近 等基因系的構建分為高世代回交法(Ashikari et al. 2005 ；Fan et al. 2006)和基于性狀 表現直接構建(Zhang et al.，2006)兩種方法。本發明中近等基因系即是基于重組自交系 F7代中一個性狀發生分離家系而構建。針對遺傳基礎復雜的數量性狀基因的克隆，圖位克隆依然是行之有效的方法。圖 位克隆(map-basedcloning) 1986 年首先由劍橋大學的 Alan Coulson 提出(Coulson et al.，1986)，用該方法分離基因是根據目的基因在染色體上的位置進行的，無需預先知道基 因的DNA序列，也無需預先知道其表達產物的有關信息。它是通過分析突變位點與已知分 子標記的連鎖關系來確定突變表型的遺傳基礎。Yano等采用圖位克隆法克隆了水稻抽穗期相關基因Hdl以來，尤其是水稻全基因 組序列釋放后水稻抽穗期QTL克隆工作也取得了巨大的成績。先后克隆抽穗期基因Hdl、 Hde^HdSa^Ehdl 等(Yano et al.，2000 ；Takahashi et al.，2001 ；Kojima et al.，2002 ； Kazuyuki Doi et al.，2004)。2005年第一個控制水稻穗粒數基因Gnla被克隆(AshikariM et al. , 2005)，利用包含約13，000個F2單株的分離群體將Gnla限定到6. 3kb的區域 并最終將此基因克隆。基因編碼細胞分裂素氧化脫氫酶的基因(cytokinin oxidase/dehydrogenase, 0sCKX2)，該基因和綠色革命基因sdl的聚合育種顯示了巨大的增產潛力。 薛為亞等(Xue et al.，2008)利用明恢63和珍汕97衍生的近等基因系克隆了位于水稻第 七染色體的抽穗期相關多效性基因Ghd7，研究證明其編碼一個CO-LIKE基因。該基因使得 其近等基因系兩種等位基因型在長日照條件下株高相差30cm，單株產量增幅達50% (Xue et al.，2008)，同時卻也使得抽穗期延遲了 20天，降低了其生產應用價值。本發明利用基于性狀差異的方法從HR5/ZS97衍生的重組自交系F7代的分離家系 RIL39中選取表型差異單株進行背景選擇后雜交構建近等基因系。以此近等基因系為基礎， 利用圖位克隆方法，最終克隆了這個同時控制水稻開花期，株高穗粒數的多效性QTL，Ghd8。 該位點使得近等基因系兩等位基因型之間單株產量由15. 1克增加至23. 8克，株高由78厘 米增加至98厘米，而抽穗期僅由77天增加至86天，生產應用潛力巨大。
發明內容
本發明目的在于克隆一個控制水稻谷粒產量、抽穗期和株高的多效性基因Ghd8。 利用這個基因調控水稻的谷粒產量、抽穗期和株高性狀，具有較好的應用前景。申請人將克 隆的這個基因命名為Ghd8?；蛉L891bp (即SEQ ID NO 2)，編碼一個含CCAAT結合結 構域的蛋白，全長296個氨基酸，其蛋白質的序列如SEQ ID NO :3所述。本發明是這樣實現的利用水稻品種珍汕97 (ZS97)和HR5構建的重組自交系(以下簡稱RIL) F7代群體 分離家系(方法見Zhang et al.，2006)，從中挑選得到2種極端表型單株N15 (表現為小 穗，矮株，早花；N15材料見Zhanget al.，2006)，N16 (大穗，高株，晚花；N16材料見Zhang et al.，2006，)進行雜交，構建近等基因系(以下簡稱NIL)。從NIL-F2分離群體中極端 早花單株，利用分子標記將基因精細定位于一個70Kb的片段中。對該70Kb區段內的候 選基因(L0C_08g07740)進行測序，發現編碼區存在差異，從9311BAC文庫(購于Arizona Genomics Institute,石if 究中心網站 http //www. genome, arizona. edu/orders/direct, html ？ library = 0SI9Ba)中分離到一個包含該候選基因的長10. 26kb的序列(即SEQ ID NO :1)，連接至雙元載體質粒PCAMBIA1301 (來自澳大利亞一個公開報道和使用的質粒)，采 用農桿菌介導轉化方法，互補轉化NIL-ZS97基因型植株(即N15單株)。轉基因單株表現 與Ghd8NIL-HR5基因型(即N16單株)表現型極為相似。Ghd8被成功克隆。利用198份微核心種質品種進行GhdS主要變異位點(S1-S5)同水稻谷物產量，開 花期以及植株高度的關聯分析。同時結合94份品種蛋白質序列單倍性聚類分析，構建不同 等位基因型的近等基因系對蛋白質功能進行了驗證，找到了利于增產但不延遲開花的等位 基因型Ghd8-9311等位基因型(編碼區序列如SEQID NO :2)及Ghd8_ruf等位基因型(編 碼區序列如SEQ ID NO 8)；能增產且僅略微延遲生育期的GhdS-nip等位基因型(編碼區 序列如SEQ ID NO 4)；增產的同時幾乎不影響生育期的Ghd8-MH63等位基因型(編碼區序 列如SEQ ID NO :6)，為育種改良提供了新的途徑。本發明的優點在于(1)本發明利用一種基于性狀表現的新方法構建了近等基因系，該方法簡單，高 效，避免了多世代回交方法耗時的缺點。(2)本發明克隆了一個影響水稻谷粒產量，抽穗期和株高的一因多效基因Ghd8。該基因同時控制水稻開花期，株高及穗粒數，為同時改良水稻株型，產量及地區適應性提供 了新的思路及可能性。(3)利用關聯分析方法對性狀進行了剖分并以近等基因系材料進行驗證，找到了 利用GhdS進行產量及地區適應性改良育種的途徑(增產但不延遲開花)。針對不同地區或 季節，合理選用GhdS不同等位基因型，培育高產品種。
序列表SEQ ID NO 1是包含候選基因的序列，用于轉化N15單株。序列表SEQ ID NO :2是Ghd8_9311等位基因(來源于水稻品種93-11)編碼序列。序列表SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 13是Ghd8_9311等位基因編碼氨基酸序列。序列表SEQ ID NO 4是Ghd8_Nip (來源于水稻品種日本晴)、Ghd8_HR5 (來源于水 稻品種HR5)等位基因編碼序列。序列表SEQ ID N0:5、SEQ ID NO 10 是 Ghd8-Nip、Ghd8_HR5 等位基因編碼氨基酸序列。序列表SEQ ID N0:6是Ghd8-MH63等位基因(來源于水稻品種明恢63)編碼序 列。序列表SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 11是Ghd8_MH63等位基因編碼氨基酸序列。序列表SEQ IDNO 8是Ghd8_ruf等位基因(來源于水稻品種0. rufipogon)編碼 序列。序列表SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 12是Ghd8_ruf等位基因編碼氨基酸序列。圖1 是本發明分離克隆GhdS基因的總體技術路線圖。圖2 是本發明中近等基因系的性狀表現圖3:是本發明利用極端隱性單株精細定位GhdS圖譜及基于雙元載體 PCAMBIA1301的轉化載體的構建圖示，染色體以加粗黑線標示，黑線上方標示標記名稱，對 應的數字表示重組時間，而黑色虛線方框表示已被純合為HR5背景的染色體區段。圖4 是本發明中近等基因系兩種親本(珍汕97、HR5)中候選基因氨基酸序列的 比對。圖5 是本發明的近等基因系和轉基因單株表現。NIL(ZS97)、NILZS97-分別為近 等基因系隱性親本和轉基因陰性單株，NIL(Hr97)、NILzS97+則是近等基因系顯性親本及轉 基因陽性單株。圖6 是本發明中用于檢測基因型及基因測序的引物。
具體實施例方式以下實施例進一步定義本發明，并描述了 GhdS基因的分離克隆及功能驗證。實施例1 :Ghd8基因的精細定位1、近等基因系構建及評價據圖1的技術路線種植ZS97和HR5的重組自交系F7群體，發現RIL39號家系內 部出現抽穗期，株高，穗粒數等表型的分離(表1)。挑選其中矮株，早穗，小穗的W5單株與 高株，晚穗，大穗的N16號單株，參照Temnykh等已發表的水稻遺傳連鎖圖譜(Temnykh et
5al.，2000 ；Temnykh et al.，2001)，選取了在N15，N16之間具有多態性的126個SSR標記 對進行背景篩選，同時對N15與N16單株衍生的F2群體進行QTL掃描(表2)，F2表型呈現 3 1分離，株高，穗大小，開花期共分離且低值性狀為隱性(見附圖2)。該QTL位于第八 染色體著絲粒區域，分子標記RM5432與RM547之間。該位點的近等基因系(稱GhdSNIL) 構建完成。表1 N15，N16及其原始親本HR5，ZS97的性狀表現 表2近等基因系群體各種性狀QTL效應 2.Ghd8基因的精細定位2006年的生長季節(5月至10月)在武漢種植包含2260個單株的Ghd8NIL_F2的 分離群體，選取其中極端早花的340個單株進行重組單株的篩選，分別以SSR標記RM547， RM310, RM5556, RM4085,冊5432(序列見圖 6)及自創多態性標記 SNP3，SEQ3-1，SEQ5-1 (序 列見圖6)篩選重組單株并最終將基因定位于一個70Kb的片段中(見圖3)，與標記 seIfpro (序列見圖6)共分離。3.候選基因的確定70Kb 候選區段包含一個編碼 CCAAT-BOX Binding factor (CBF)蛋白的基因(L0C_ 0s08g07740)。據Orna Ben-Naim等的報道，CBF類基因參與了擬南芥開花調控，對候選基 因的進一步的比較測序發現，HR5與日本晴該區段基因具有相同的核苷酸序列，而GhdSNIL 兩種等位基因型Ghd8-ZS97、Ghd8-HR5等位基因除了在啟動子區域存在多處差異外，在編 碼區離ATG第322堿基處存在一個移碼突變使得Ghd8-ZS97等位基因編碼氨基酸提前終止 (圖4)，L0C_0s08g07740被認為是Ghd8的候選基因。實施例2 :Ghd8基因的分離與克隆根據預測的候選基因序列，擴增PCR片段篩選931IBAC文庫，挑選出含有候選基因L0C_0s08g07740的克隆5(M15，利用限制性核酸內切酶SacI酶切陽性克隆，進行亞克隆，獲 得一個10. 26K b的片斷，該片段包含轉錄起始點上游3. 5kb和終止位點下游5. 7Kb的序列， 該片段內僅含有候選基因一個完整基因。將這個片段連接到雙元載體PCAMBIA1301上(圖3)，測序確定轉化載體正確后，采 用農桿菌介導的遺傳轉化方法，得到轉基因的水稻。本發明的轉基因具體步驟如下正確克隆的質粒通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系導入到隱性基因型 (Ghd8-ZS97)植株愈傷中，經過愈傷誘導，繼代，預培養、侵染、共培養、篩選具有潮霉素抗性 的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉基因植株。農桿菌介導的水稻(粳稻亞種)遺傳轉化 體系主要應用Hiei等人報道的方法(Hiei Y etal. , 1996)基礎上進行優化。本發明的遺傳轉化的主要步驟、培養基及其配制的方法如下所述(1)試劑和溶液縮寫本發明中培養基所用到的植物激素的縮寫表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧節青霉素)； KT (Kinet in, Mij] Μ) ；NAA (Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ； IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4- 二氯苯氧乙酸)； AS (Acetosringone, Zi lit T # Sll ) ；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate, /K I S S )； HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max (N6 大量元素 成分溶液)；N6mix (N6微量元素成分溶液)；MSmax (MS大量元素成分溶液)；MSmix (MS微量 元素成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培養基大量元素母液(按照10倍濃縮液(IOX)配制)硝酸鉀(KNO3)28. 3 克磷酸二氫鉀(KH2PO4)4. 0 克硫酸銨((NH4)2SO4)4. 63 克硫酸鎂(MgSO4· 7H20)1. 85 克氯化鈣(CaCl2· 2H20)1. 66 克將上述試劑逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000毫升。2)N6培養基微量元素母液(按照100倍濃縮液(100X)配制碘化鉀(KI)0. 08 克硼酸(H3BO3)0.16 克硫酸錳(MnSO4· 4H20)0. 44 克硫酸鋅(ZnSO4· 7Η20)0. 15 克將上述試劑在室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000毫升。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(按照100X濃縮液配制)將3. 73克乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA · 2H20)和2. 78克FeSO4 · 7H20分別溶解， 混合并用蒸餾水定容至1000毫升，至70°C溫浴2小時，4°C保存備用。4)維生素貯存液(按照100X濃縮液配制)煙酸(Nicotinicacid)0. 1 克維生素Bl (Thiamine HCl)0. 1 克
7
維生素 B6 (Pyridoxine HCl) 0. 1 克
甘氨酸(Glycine)0. 2克
肌醇(Inositol)10克
加蒸餾水定容至1000毫升，4°C保存備用。
5) MS培養基大量元素母液(MSmax母液)(按照IOX濃縮液配制)
硝酸銨(NH4NO3)16. 5 克
硝酸鉀19.0 克
磷酸二氫鉀1.7克
硫酸鎂3. 7克
氯化鈣4. 4克
將上述試劑在室溫下溶角厙，并用蒸餾水定容至1000毫升。
6) MS培養基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X濃縮液配制)
硫酸錳(MnSO4 · 4H20)2. 23 克
硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20)0. 86 克
硼酸(H3BO3)0. 62 克
碘化鉀(KI)0. 083 克
鉬酸鈉(Na2MoO4 · 2H20)0. 025 克
硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 0025 克
氯化鈷(CoCl2 · 6H20)0. 0025 克
將上述試劑在室溫下溶角厙，并用蒸餾水定容至1000毫升。
7)2，4-D貯存液(1毫克/毫升)的配制
秤取2，4-D 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10 3■升蒸餾水溶
解完全后定容至100毫升，于室溫下保存。8) 6-BA貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取6-BA 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶 解完全后定容至100毫升，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(1毫克/毫升)的配制稱取NAA 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解 完全后定容至100毫升，4°C保存備用。10)吲哚乙酸(IAA)貯存液(1毫克/毫升)的配制秤取IAA 100毫克，用1毫升IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10毫升蒸餾水溶解 完全后定容至100毫升，4°C保存備用。11)葡萄糖貯存液(0. 5克/毫升)的配制秤取葡萄糖125克，然后用蒸餾水溶解定容至250毫升，滅菌后4°C保存備用。12) AS貯存液的配制秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分裝至1. 5毫升離心管內，4°C保存備用。13) IN氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5. 6克，用蒸餾水溶解定容至100毫升，室溫保存備用。裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常規方法滅菌(例如121°C下滅菌25分鐘， 下述的培養基滅菌方法與本培養基的滅菌方法相同)。
0104](3)用于水稻遺傳轉化的培養基配方0105]1)誘導培養基0106]N6max母液(取已經制備好的IOX濃縮液，下同)100毫升0107]N6mix母液(取已經制備好的100X濃縮液，下同)10毫升0108]Fe2+EDTA貯存液(取已經制備好的100X濃縮液，下同)10毫升0109]維生素貯存液(取已經制備好的100X濃縮液，下同)10毫升0110]2,4-D貯存液(取上述制備好的)2. 5毫升0111]脯氨酸(Proline)0. 3克0112]CH0.6克0113]蔗糖30克0114]Phytagel3克0115]加蒸餾水至900毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分
0116]
0117]
0118]
0119]
0120] 0121] 0122]
0123]
0124]
0125]
0126]
2)繼代培養基 N6max 母液(IOX) N6mix 母液(100X) Fe2+EDTA 貯存液(100X) 維生素貯存液(100X) 2，4-D貯存液 脯氨酸 CH 蔗糖
Phytagel
100毫升 10毫升 10毫升 10毫升 2.0毫升 0. 5克 0.6克 30克 3克
加蒸餾水至900毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 9，煮沸并定容至1000毫升，分
裝到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法滅菌c
0127]
0128]
0129]
0130]
0131]
0132]
0133]
0134]
0135]
0136]
0137]
3)預培養基
N6max 母液(IOX)
N6mix 母液(100X)
Fe2+EDTA 貯存液(100X)
維生素貯存液(100X)
2，4-D貯存液
CH
蔗糖
瓊脂粉
12. 5毫升
1.25毫升 2. 5毫升
2.5毫升 0. 75毫升
0.15 克 5克
1.75 克
加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 6，封口，按上述方法滅菌。 使用前加熱溶解培養基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒 入培養皿中(25毫升/皿)。
4)共培養基
N6max母液(10X)12．5毫升[O140] N6mix母液(100X)1．25毫升
Fe“EDTA貯存液(100X)2．5毫升[O142] 維生素貯存液(100X)2．5毫升
2，4-D貯存液0．75毫升
CH0．2克
蔗糖5克
瓊脂粉1．75克
加蒸餾水至250毫升，lN氫氧化鉀調節pH值到5．6，封口，按上述方法滅菌。
使用前加熱溶解培養基并加入5毫升葡萄糖貯存液和250微升AS貯存液，分裝倒入培養皿中(25毫升／每皿)。
5)懸浮培養基
N6max母液(10X)5毫升
N6mix母液(100X)0．5毫升[O152] Fe“EDTA貯存液(100X)0．5毫升[O153] 維生素貯存液(100X)l毫升
2，4-D貯存液0．2毫升[O155] CH0．08克[O156] 蔗糖2克[O157] 加蒸餾水至100毫升，調節pH值到5．4，分裝到兩個100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法滅菌。使用前加入l毫升無菌葡萄糖貯存液和100微升AS貯存液。
6)選擇培養基[O159] N6max母液(10X)25毫升
N6mix母液(100X)2．5毫升
Fe“EDTA貯存液(100X)2．5毫升[O162] 維生素貯存液(100X)2．5毫升
2，4-D貯存液0．625毫升[O164] CH0．15克[O165] 蔗糖7．5克[O166] 瓊脂粉1．75克[O167] 加蒸餾水至250毫升，調節pH值到6．0，封口，按上述方法滅菌。
使用前溶解培養基，加入250微升HN(50毫克／毫升)和400微升CN(250毫克／毫升)分裝倒入培養皿中(25毫升／皿)。(注第一次選擇培養基羧芐青霉素濃度為400毫克／升，潮霉素濃度為50毫克／升)第二次及以后選擇培養基羧芐青霉素濃度為250毫克／升，潮霉素濃度為50毫克／升)。[O169] 7)預分化培養基[O170] N6max母液(10X)25毫升
N6mix母液(100X)2．5毫升[O172] Fe“EDTA貯存液(100X)2．5毫升0173]維生素貯存液(100X)2. 5毫升0174]6-BA貯存液0.5毫升0175]KT貯存液0.5毫升0176]NAA貯存液50微升0177]IAA貯存液50微升0178]CH0. 15 克0179]蔗糖7. 5克0180]瓊脂粉1. 75 克0181]加蒸餾水至250毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到5. 9，封口，按上述方法滅菌。0182]使用前溶解培養基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN (250毫克/毫
分裝倒入培養皿中(25毫升/皿)。 8)分化培養基
N6max 母液(IOX)100 毫升
N6mix 母液(100X)10 毫升
Fe2+EDTA C存液(100X)10 毫升
維生素貯存液(100X)10毫升
6-BA貯存液2毫升
KT貯存液2毫升
NAA貯存液0. 2毫升
IAA貯存液0. 2毫升
CH1克
蔗糖30克 Phytagel
0183]
0184]
0185]
0186]
0187]
0188]
0189]
0190]
0191]
0192]
0193]
0194]
0195]
0196]
3克
加蒸餾水至900毫升，IN氫氧化鉀調節pH值到6. 0。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按 上述方法滅菌。
9)生根培養基
MSmax母液(IOX)50毫升
MSmix母液(100X)5毫升
Fe2+EDTA貯存液(100X)5毫升
維生素貯存液(100X)5毫升
蔗糖20克
Phytagel
0197]
0198]
0199]
0200] 0201] 0202]
0203]
0204]
0205]
3克
加蒸餾水至900毫升，用IN氫氧化鉀調節pH值到5. 8。
煮沸并用蒸餾水定容至1000毫升，分裝到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述
方法滅菌。
0206](4)農桿菌介導的遺傳轉化步驟
0207]3. 1愈傷誘導
0208]1)成熟的合江19，牡丹江8號，水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分
11鐘，0. 15%氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；2)用滅菌水洗種子4-5次；3)將種子放在誘導培養基上；4)將接種后的培養基置于黑暗處培養4周，溫度25士 1°C。3. 2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養基上黑暗下培養2周，溫 度 25 士 1°C。3. 3預培養挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養基上黑暗下培養2周，溫度 25 士 1°C。3. 4農桿菌培養1)在帶有對應抗性選擇的LA培養基(LA培養基配制方法參照J.薩姆布魯克等， 分子克隆實驗指南，第三版，金冬雁等(譯)，科學出版社，2002,北京)上預培養攜帶SEQ ID N0:1序列片段的農桿菌EHA105(該菌株來自CAMBIA公司公開使用的農桿菌菌株)兩天， 溫度28 °C ；2)將農桿菌轉移至懸浮培養基里，28°C搖床上培養2-3小時。3. 5農桿菌侵染1)將預培養的愈傷轉移至滅好菌的瓶子內；2)調節農桿菌的懸浮液至OD6tltl 0. 8-1. 0 ；3)將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；4)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養基上培養3天，溫度 19-20 "C。3. 6愈傷洗滌和選擇培養1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；2)浸泡在含400毫克/升羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；3)轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；4)轉移愈傷至選擇培養基上選擇培養2-3次，每次2周。3. 7 分化1)將抗性愈傷轉移至預分化培養基上于黑暗處培養5-7天；2)轉移預分化培養的愈傷至分化培養基上，光照下培養，溫度26°C。3. 8 生根1)剪掉分化時產生的根；2)然后將其轉移至生根培養基中光照下培養2-3周，溫度26°C。3. 9 移栽洗掉根上的殘留培養基，將具有良好根系的幼苗轉入大田隔離環境，田間管理同 普通大田。經過互補轉化至Ghd8_ZS97基因型材料后，轉基因陽性單株出現開花期延遲，株 高增加及穗粒數增大的表現型(圖5)。四個獨立轉化家系的結果皆證實轉基因單株表型與 基因型共分離。種植Tl代，顯示其中一個家系表現型出現1 3分離(26 76)，以基因內
12標記Z9M-1 (序列見圖6)及gus染色均證實表型與基因型共分離，考種結果顯示Ghd8-9311 等位基因轉入Ghd8-ZS97基因型(隱性等位基因)植株后，表型得到了回復(表3)。由此， GhdS被成功克隆，本發明同時證實，通過轉基因手段可以利用GhdS服務于產量育種。表3 GhdS近等基因系及互補轉化轉基因單株考種表 表3 注NIL(zs97)、NIL(Hr5)分別代表 Ghd8NIL 中 Ghd8_ZS97、Ghd8_HR5 等位基 因型植株，NILzs97-,NILzs97+分別代表轉基因陰性、陽性植株實施例3 尋找區分產生的不同效應的GhdS等位基因型以 PCR 產物直接測序方法以引物 Ghd8-Sl，Ghd8_S2 Ghd8_S3，Ghd8_S4，Ghd8_S5 Ghd8-S16Ghd8-S7，Ghd8-S8共8對引物(引物序列參見圖6)擴增Ghd8基因各區段，PCR產 物經SAP及EXOI于37°C消化1小時候后(消化反應體系8微升)，80°C變性，取2. 5微升消 化產物以ABI公司測序試劑盒進行測序擴增反應(第一步96°C2分鐘變性，第二步96°C 10 秒變性，50°C復性，60°C延伸4分鐘，此步重復33個循環，第三步4°C 10分鐘)，擴增產物 以95%乙醇3M醋酸鈉(pH4. 8) = 25 1進行沉淀，26微升每孔反應，沉淀15分鐘后以 3000g轉數離心收集沉淀，取上清后加入75微升70%乙醇洗滌，3000g離心10分鐘后去上 清，晾干，加入7微升甲酰胺，96度3分鐘變性后以ABI3730測序儀進行序列測定。序列經 過sequencherf. 1. 2進行序列的拼接。結合所有材料的表現型數據及序列以TASSEL軟件 (Bradbury et al, . 2007)中的MLM進行關聯分析，結果表明主要有5個位點(Si、S2、S3、 S4、S5)與抽穗期、產量相關性狀緊密相關，其中S2和S5在2005、2006和2007三年實驗中對 抽穗期都有顯著的相關，位于Ghd8-MH63(編碼氨基酸序列如SEQ ID NO :7)、Ghd8_9311 (編 碼氨基酸序列如SEQ ID NO 3)、Ghd8-ruf (編碼氨基酸序列如SEQ ID NO 9)編碼第86位 氨基酸由GhdS-nip等位基因(編碼氨基酸序列SEQ ID NO 5)的絲氨酸(Ser)替換為丙氨 酸(Ala)的變異，及174位甘氨酸重復次數的變異同時對抽穗期和產量在三年實驗中都存 在顯著相關(表4)。實施例4 :Ghd8不同等位基因的效應評價通過以水稻品種93-11、明恢63、日本晴和0. rufipogon為供體親本，ZS97為輪回 親本，回交3-6次，同時利用基因標記Ghd8-S4確定目的基因Ghd8的存在，再經過1_2次自 交，最終獲得遺傳背景基本一致(為ZS97)，GhdS純合導入的一系列近等基因系(ZS979311， ZS97, ZS97nip，ZS97’。進行長短日處理比較發現Ghd8_9311等位基因型(編碼區序列 如SEQ ID NO 2)及Ghd8-ruf等位基因型(SEQ ID NO 8)為強功能位點，延遲抽穗期并同 時大幅度提高穗粒數；而以Ghd8-nip等位基因型(編碼區序列如SEQ IDNO 4)為代表為中 等功能位點，能提高產量同時在長日照條件下僅延遲生育期1. 5天，短日照條件下提前3. 4 天；而以Ghd8-MH63等位基因型(編碼區序列如SEQ ID NO 6)為代表的一類等位基因型為
13弱功能位點，其在增產的同時對生育期影響極小，(表5)，該結果說明Ghd8-nip、Ghd8-MH63 等位基因型中在進化過程中演化出對育種改良有應用價值的有利等位變異。表4核苷酸位點差異與性狀關聯性分析 表5 GhdS不同等位基因型近等基因系在不同日照條件下表型
Ghd8-MH63、Ghd8-9311、Ghd8_ruf等位基因構建的近等基因系?！?”代表差異顯著，“**”代 表差異極顯著。)參考文獻1. Ashikari M, sakakibara H,Lin S,et al. Cytokinin oxidase regulates rice grain production. Science,2005,309(5735) :741_7452. Ben-Naim 0, Eshed R, Parnis A, et al.The CCAAT binding factor can mediate interactions betweenCONSTANS-like proteins and DNA. Plant J,2006,46(3) 462-4763.Bradbury PJ, Zhang Z, Kroon DE, et al. TASSEL software for association mapping of complex traits indiverse samples. Bioinformatics,2007,23 (19) 2633-26354. Coulson A, Sulston J, Brenner S, et al. Toward a physical map of the genome of the nematode Caenorhabditiselegans. Proc Natl Acad Sci USA,1986, 83(20) 7821-78255. Doi K,Izawa T,Fuse T,et al. Ehdl,a B~type response regulator in rice,confers short-day promotion offlowering and controls FT—like gene expression independently of Hdl. Genes Dev，2004，18(8) :926_9366.Fan C C，Xing Y Z,Mao H L，et al. GS3,a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grainwidth and thickness in rice， encodes a putative transmembrane protein. Theor Appl Genet，2006，112(6) : 1164-11717. Hiei Y，Ohta S，Komari T，Kumashiro T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L)mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal，1994，6(2) 271-2828. Kojima S，Takahashi Y，Kobayashi Y，et al. Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene， promotestransition to flowering downstream of Hdl under short-day conditions. Plant Cell Physiol，2002，43 (10) :1096_11059. Takahashi Y，Shomura A，Sasaki T，et al. Hd6, a rice quantitative trait locus involved in photoperiodsensitivity, encodes the alpha subunit of protein kinase CK2. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98 (14) :7922_7927.10. Temnykh s，Park W D,Ayres N,et al. Mapping and genome ortanization of microsatellite sequences in rice(Oryza sativa L). Theor Appl Genet，2000，100 : 697-71211. Temnykh S，DeClerck G，Lukashova A，et al. Computational and experimental analysis of microsatellites inrice (Oryza sativa L) :frequency， length variation, transposon associations, and genetic marker potential. Genome Res，2001，ll(8) :1441_145212. Xue W，Xing Y,Weng X,et al. Natural variation in Ghd7 is an important regulator of heading date and yieldpotentialin rice. Nat Genet，2008，40 (6) 761-76713.Yano M， Katayose Y， Ashikari M， et al.Hdl, a major photoperiod sensitivity quantitative trait locus in rice， isclosely related to the Arabidopsis flowering time gene C0NSTANS. Plant Cell，2000，12 (12) :2473_248414. Zhang Y，Luo L，Xu C，et al. Quantitative trait loci for panicle size, heading date and plant heightco-segregating in trait-performance derived near-isogenic lines of rice (Oryza sativa). Theor Appl Genet，2006，113(2) 361-368
權利要求
Ghd8基因在控制水稻谷物產量，開花期以及植株高度中的應用，其特征在于，所述的Ghd8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.權利要求1所述基因的等位基因GhdS-ruf在增加水稻谷物產量，開花期以及植株高 度中的應用，其特征在于它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:8所示。
3.權利要求1所述基因的等位基因GhdS-ruf在增加水稻谷物產量，開花期以及植株高 度中的應用，其特征在于它的蛋白質序列如SEQ ID N0:9所示。
4.權利要求1所述基因的等位基因Ghd8-9311在增加水稻谷物產量，開花期以及植株 高度中的應用，其特征在于它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。
5.權利要求1所述基因的等位基因Ghd8-9311在增加水稻谷物產量，開花期以及植株 高度中的應用，其特征在于它的蛋白質序列如SEQ ID N0:3所示。
6.權利要求1所述基因的等位基因Ghd8-MH63在增加水稻谷物產量，不延長水稻開花 期及植株高度中的應用，其特征在于它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:6所示。
7.權利要求1所述基因的等位基因Ghd8-MH63在增加水稻谷物產量，不延長水稻開花 期及植株高度中的應用，其特征在于它的蛋白質序列如SEQ ID N0:7所示。
8.權利要求1所述基因的等位基因GhdS-Nip在增加水稻谷物產量，雙向改良水稻開花 期及植株高度中的應用，其特征在于它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
9.權利要求1所述基因的等位基因GhdS-Nip增加水稻谷物產量，雙向改良水稻開花期 及植株高度中的應用，其特征在于它的蛋白質序列如SEQ ID N0:5所示。
10.權利要求2-9任一等位基因在不同光照條件下作為提高水稻產量中的應用。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程領域?？寺〉玫揭粋€影響水稻谷物產量，開花期及植株高度多效性基因Ghd8。通過構建目的基因的近等基因系，初步定位，比較測序和遺傳轉化互補等實驗分離克隆到Ghd8基因(序列如SEQ ID NO2)。顯性等位基因型單株比隱性等位基因型單株產量增加58％，株高增加25.6％，而抽穗期僅增加9天。利用Ghd8主要變異位點與性狀關聯分析及不同品種蛋白質序列單倍性聚類分析的結果，構建不同等位基因型的近等基因系，獲得4種有利的Ghd8等位基因型。其中Ghd8-9311及Ghd8-ruf等位基因型，增產但不延遲開花，該基因適應于光溫條件良好地區育種；Ghd8-MH63及Ghd8-Nip等位基因型不感光，適用于短日照條件地區增產育種。
文檔編號C12N15/29GK101892246SQ20101022304
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月7日 優先權日2010年7月7日
發明者余四斌, 王鵬, 邢永忠, 鄢文豪 申請人:華中農業大學