專利名稱：低產高級醇釀酒酵母工程菌及其構建方法
低產高級醇釀酒酵母工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，涉及工業微生物的育種，尤其是一種低產高級醇 的釀酒酵母工程菌及其構建方法。
背景技術：
白酒是中國特有的蒸餾酒，風味獨特，深受喜愛。高級醇是白酒風味物質的主要成 分之一，它對形成酒的風味和促使酒體豐滿、濃厚起著重要的作用。適宜的高級醇含量及各 種高級醇之間的比例協調可使白酒的口感柔和協調、酒體豐滿圓潤、味道獨特；但如果白酒 中高級醇含量較低，酒味將變得單調淡??；而當含量過高時會與酸、酯等成分比例失調，使 白酒產生異雜味。另外，高級醇是對人體有害的物質，對人的毒性與麻醉作用都比乙醇強。 因此，必須控制高級醇的含量在合適的范圍內。我國目前以玉米等蛋白質含量豐富的原料發酵生產的白酒中高級醇含量較高，發 酵結束后高級醇總含量通常在300mg/L(或300mg/kg，以異丁醇和異戊醇計)以上。在生產 中除在蒸餾過程中采用適當的掐頭去尾操作外，大多數是通過控制發酵工藝來降低高級醇 的生成量，以保證達到白酒出廠時高級醇含量不高于200mg/L的衛生標準。雖然國內外有 不少關于降低發酵過程中高級醇生成量的研究報告，但這些報導均為實驗室成果，離實際 應用還有一定距離。存在的主要問題有一是控制生產工藝的方法降低高級醇的生成量，由 于每批菌種的生長及發酵狀態不同，相應的就要調整發酵工藝，因此，如果沒有經驗十分豐 富且有責任心的員工，這種控制操作很難達到預定的要求；二是雖然已經獲得一些低產高 級醇的菌株(高級醇含量可降低30%左右的菌株)，但是這些菌株通常是營養缺陷型的，只 適用于實驗室研究，不利于工業化生產。目前，我國白酒年產量居全球首位，已逾700萬噸， 約占世界烈性酒總產量的40 %。但發酵過程中高級醇生成量高，加重了企業的生產成本，制 約了企業的發展。因此，要從根本上解決高級醇含量較高，還是要構建低產高級醇釀酒酵母 工程菌株，這是降低酒精生產過程中高級醇生成量的關鍵所在，也是工業微生物育種的發 展方向。釀酒酵母酒精發酵過程中，有兩條高級醇代謝途徑，分別為糖代謝合成途徑和氨 基酸分解代謝途徑(Ehrlich途徑)。采用分子育種技術減弱或抑制調控高級醇合成的關 鍵酶活性，從而切斷或減弱高級醇代謝途徑，是降低高級醇生成量有效的措施。釀酒酵母支 鏈氨基酸分解代謝的第一步是轉氨作用，它是由BATl和BAT2基因編碼的氨基酸轉氨酶調 控的，其中，BATl基因編碼線粒體轉氨酶，BAT2基因編碼細胞質轉氨酶。據研究報道表明， BAT2基因編碼的支鏈氨基酸轉氨酶在高級醇(特別是異丁醇和異戊醇)的生成過程中起著 非常重要的作用。因此，為了降低發酵過程中高級醇的生成量，敲除對高級醇有重要影響的 氨基酸轉氨酶編碼基因(BAT2)將是一條有效的途徑。

發明內容本發明的目的是解決發酵生產白酒過程中高級醇含量較高的問題，提供一種低產
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本發明提供的釀酒酵母工程菌是具有低產高級醇性能的釀酒酵母工程菌 (Saccharomyces cerevisiae)，具體為AY-20。該菌已于2010年6月21日保藏于中國微 生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區大屯路甲3 號)，保藏號為CGMCC No 3930，建議分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae。所述工程菌在其它發酵性能不受影響的情況下，轉化子菌株比親本菌株的異丁 醇、異戊醇含量分別降低了 55. 19%,34. 43%，總高級醇含量降低了 35.01%。所述釀酒酵母工程菌具體可以通過向出發菌釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 2. 1190 (中國微生物菌種保藏管理委員會，公眾可以通過該保藏管理委員會 獲得出發菌株2. 1190)。中插入一個核苷酸序列或者通過缺失釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 2. 1190中的部分或完整氨基酸轉氨酶編碼基因(BAT2)序列來實現。上述插入或缺失等可以用常規的敲除方法獲得。這些方法已有許多文獻報道，如 JosephSambrook等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1995。也可用本領域已知的 其它方法來構建基因突變的酵母菌。其中較優的是通過完全敲除氨基酸轉氨酶基因獲得。 該序列是缺失BAT2 100%的編碼序列。這種通過完全敲除氨基酸轉氨酶編碼基因獲得的菌 株不易產生回復突變，菌株的穩定性比利用點突變等方法構建的菌株穩定性更高，更有利 于工業化應用。本發明所提供的構建上述釀酒酵母工程菌的方法是，將PCR擴增重組質粒得到的 重組基因盒導入釀酒酵母工程菌中通過同源重組獲得重組菌。所述的重組質粒PUC-BBAK，是能夠完全敲除釀酒酵母的氨基酸轉氨酶編碼基因的 重組質粒，所述氨基酸轉氨酶編碼基因為BAT2基因。所述重組質粒上無任何營養缺陷型篩選標記。所述氨基酸轉氨酶編碼基因(BAT2)的序列號為853613。本發明同時提供了一種專門用于鑒定所述低產高級醇的釀酒酵母工程菌的基因 序列，該基因序列是以PK-U和PK-D為引物，以所述低產高級醇的釀酒酵母工程菌菌株基因 組為模板，擴增片段測序為一特異性序列，如序列表1所示。本發明的優點和積極效果一是本發明構建的重組釀酒酵母工程菌所敲除的酵母氨基酸轉氨酶編碼基因為 100%缺失，不易產生回復突變，并且重組菌株中的KanMX抗性基因已經敲除，保證了菌株 及發酵產品的安全性；二是本發明構建的重組釀酒酵母工程菌能夠降低高級醇的生成量， 而其它發酵性能沒有明顯變化。篩選得到的工程菌對發酵設備及條件沒有特殊要求，一般 酒廠的設備和條件均可使用，因而有廣泛的應用前景。

圖1是工程菌構建的技術路線2是pUC-BBAK質粒構建過程圖3是BAT2的重組過程。本發明所述的重組釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)具體為AY-20， 已于2010年6月21日保藏于中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJ*
4址為中國北京市朝陽區大屯路甲3號)，保藏號為CGMCC No 3930，建議分類命名為釀酒酵 母 Saccharomyces Cerevisiae0
具體實施方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1 低產高級醇釀酒酵母工程菌的構建(1)基因工程菌株的構建基因工程菌株的構建流程如圖1所示。雙倍體2. 1190經過單倍體化生成單倍體 菌株a-8和α -22，通過兩次同源重組的方法構建基因工程單倍體菌株，去除KanMX抗性基 因并雜交該單倍體菌株，生成雙倍體基因工程菌株。重組質粒pUC-BBAK的構建流程如圖2所示。通過PCR擴增技術，將BAT2基因兩 側用于同源重組敲除該基因的序列BA和BB片段及來自pUG6質粒的KanMX抗性基因擴增， 并以PUC19質粒為載體將這三個片段按照BA-KanMX-BB的順序連接，構建pUC-BBAK重組質粒。BAT2重組過程如圖3所示。以質粒pUC-BBAK為模板進行PCR擴增，得到 BA-KanMX-BB重組基因盒。電轉化重組基因盒進入酵母單倍體細胞，通過BA和BB片段與 酵母染色體上BAT2基因兩側的同源序列同源重組，從而整合到酵母染色體上并隨染色體 一起復制。轉化后通過G418抗性篩選重組子，KanMX片段同源重組替換了酵母染色體上的 BAT2基因，從而實現該基因的完全敲除。利用兩次同源重組的方法完全敲除釀酒酵母2. 1190的單倍體菌株a_8和α -22 的氨基酸轉氨酶基因 412基因)，得到81和8-(1菌株。將轉化子中的抗性基因(KanMX) 去除，并雜交得到雙倍體雜合子ΑΥ-20。(2)基因工程菌株的特異性序列獲得的基因工程菌株ΑΥ-20染色體中含有一段特異性序列，可通過PCR擴增測序 后進行菌株鑒定。特異性片段擴增的引物序列為PK-U :5’ -CTTCGTATAATGTATGCTATACGAA-3’PK-D :5，-TTCTGGATACTTTTTTCTTACTTGC-3，該特異性片段的基因序列見序列表1。實施例2 釀酒酵母工程菌株發酵實驗(1)轉化子與單倍體親本的發酵實驗將親本a-8和α -22及其對應的ΒΑΤ2基因完全缺失轉化子同時進行酒精濃醪發 酵，發酵結束后測定菌株發酵性能及高級醇生成量，結果見表1。結果顯示，親本a-8的異丁 醇、異戊醇和高級醇含量分別為70. 37mg/L和208. 33mg/L和312. 93mg/L，其BAT2基因完全 缺失轉化子的異丁醇、異戊醇和高級醇總含量分別為35. 37mg/L、137. 62mg/L和204. 13mg/ L，即a-8轉化子比親本a-8的異丁醇、異戊醇和高級醇分別降低了 49. 74%,33. 94% 和34.77 % ；親本α-22的異丁醇、異戊醇和高級醇含量分別為63. 16mg/L、221. 09mg/ L和320. 12mg/L，其BAT2基因完全缺失轉化子的異丁醇、異戊醇和高級醇總含量分別為 29. 52mg/L、143. 29mg/L和206. 92mg/L,即α -22的轉化子比α -22的異丁醇、異戊醇和高
5級醇分別降低了 53. 26%、35. 19%和35.36%。由結果看出，BAT2基因完全缺失阻斷或嚴 重地減弱了支鏈氨基酸轉氨酶的活性，進而減少纈氨酸向異丁醇和亮氨酸向異戊醇的轉化 而降低高級醇，最終使異丁醇的生成量降低了約52%，異戊醇的生成量降低了約34%，高 級醇總含量降低了約35%。表1菌株高級醇生成量及發酵性能 注所示數據為三個平行試驗結果的平均值。(2)雜合子和雙倍體親本的發酵實驗將a-8的轉化子B-a與α -22的轉化子B-α雜交，得到雜交子ΑΥ-20。將雜合子與 雙倍體親本2. 1190進行酒精濃醪發酵，發酵結束后測定菌株的發酵性能和高級醇生成量， 結果見表2。由表2可知，親本2. 1190的異丁醇、異戊醇和高級醇總含量分別為72.66mg/ L和213. 92mg/L和317. 62mg/L，雜合子的異丁醇、異戊醇和高級醇總含量分別為32. 56mg/ L、140. 26mg/L和206. 44mg/L,即雜合子比雙倍體親本2. 1190的異丁醇、異戊醇和高級醇總 含量分別降低了 55. 19%,34. 43%和35. 01%。表2雜交子的發酵性能和高級醇的生成量 注所示數據為三個平行試驗結果的平均值。
權利要求
一種低產高級醇的釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)，具體為AY 20，保藏號為CGMCC No 3930，建議分類命名為釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae。
2.根據權利要求1所述的低產高級醇的釀酒酵母工程菌，其特征在于，在其它發酵性 能不受影響的情況下，轉化子菌株比親本菌株的異丁醇、異戊醇含量分別降低了 55. 19%, 34. 43%，總高級醇含量降低了 35.01%。
3.一種低產高級醇的釀酒酵母工程菌的構建方法，其特征在于，通過向出發菌釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae) 2. 1190中插入一個核苷酸序列或者通過缺失釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 2. 1190中的部分或完整氨基酸轉氨酶編碼基因(BAT2)序列 來實現。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，較優的是通過完全敲除釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 2. 1190中的氨基酸轉氨酶編碼基因，獲得權利要求1所述的 低產高級醇的釀酒酵母工程菌，該菌株是缺失BAT2 100%的編碼序列。
5.一種專門用于鑒定權利要求1所述低產高級醇的釀酒酵母工程菌的基因序列，該基 因序列是以PK-U和PK-D為引物，以所述低產高級醇的釀酒酵母工程菌菌株基因組為模板， 擴增片段測序為一特異性序列，如序列表1所示。
全文摘要
一種低產高級醇釀酒酵母工程菌及其構建方法。本發明提供的釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)AY-20，保藏號為CGMCC No.3930。該菌在其它發酵性能不受影響的情況下，轉化子菌株比親本菌株的異丁醇、異戊醇含量分別降低了55.19％、34.43％，總高級醇含量降低35.01％?？赏ㄟ^向出發菌釀酒酵母2.1190中插入一個核苷酸序列或者通過缺失部分或完整氨基酸轉氨酶編碼基因(BAT2)序列來實現。如BAT2100％缺失，則不易產生回復突變，且重組菌株中的KanMX抗性基因已經敲除，保證了菌株及發酵產品的安全性。篩選得到的工程菌對發酵設備及條件沒有特殊要求，一般酒廠的設備和條件均可使用，因而有廣泛的應用前景，能為白酒廠的工業化生產帶來顯著經濟效益。
文檔編號C12R1/865GK101914461SQ201010227788
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者張翠英, 杜麗平, 肖冬光, 郝欣, 郭學武, 陳葉福 申請人:天津科技大學