專利名稱：一種香蕉果實特異高效表達dna調(diào)控元件及其植物表達載體的制作方法
一種香蕉果實特異高效表達DNA調(diào)控元件及其植物表達載
體本發(fā)明涉及香蕉淀粉粒合成酶基因啟動子序列的獲得和植物表達載體的構建。 [背景技術]香蕉(Musa spp.)屬芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(Musa)。是重要的熱帶水果，是利 用轉(zhuǎn)基因方法生產(chǎn)重組藥用蛋白和肽，或者是有價值的化合物的理想植物。外源基因能夠在植物組織中實現(xiàn)正常乃至高效的表達，一個重要的條件是構建一 個能高水平表達異源蛋白質(zhì)的表達載體，而對一個高效表達的載體而言，啟動子則是其最 重要元件之一。因此，選擇合適的植物啟動子和改進其活性是增強外源基因表達首先要考 慮的問題。目前在植物表達載體中廣泛應用的啟動子是組成型啟動子，例如，絕大多數(shù)雙子 葉轉(zhuǎn)基因植物均使用CaMV35S啟動子，單子葉轉(zhuǎn)基因植物主要使用來自玉米的Ubiquitin 啟動子和來自水稻的Actinl啟動子。在這些組成型表達啟動子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基 因植物的所有部位和所有的發(fā)育階段都會表達。然而，外源基因在受體植物內(nèi)持續(xù)、高效的 表達不但造成浪費，往往還會引起植物的形態(tài)發(fā)生改變，影響植物的生長發(fā)育。為了使外 源基因在植物體內(nèi)有效發(fā)揮作用，同時又可減少對植物的不利影響，目前人們對特異表達 啟動子的研究和應用越來越重視。果實特異性啟動子作為重要的組織特異性啟動子，可以 控制外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的果實中特異表達?？寺『脱芯抗麑嵦禺愋詥幼樱蔀樯钊?研究果實品質(zhì)形成機理、提高果實品質(zhì)及為在植物中特異性地表達外源基因奠定基礎。但 是，由于受到果實特異表達基因數(shù)量的限制，果實特異表達啟動子的克隆鑒定及應用研究 的報道非常有限，目前相關研究在番茄上進展較大，如番茄E8基因的啟動子被證明是果實 成熟啟動子且對乙烯做出反應，Penarrubia(Penarrubia et al. 1992)等用該啟動子轉(zhuǎn)移 的指導甜蛋白基因在番茄果實成熟中表達，結果獲得較高的表達量，且甜蛋白受乙烯誘導 而增加。番茄PG基因(Bird C R et al. 1998)和2A11基因亦被證實為果實成熟特異表達， Chengappa等(Chengappa S et al. 1990)用2A11基因啟動子在番茄果實中特異表達反義 蔗糖合成酶基因，證實為果實特異表達。毛自朝等(2002)用番茄果實專一性啟動子2A12 驅(qū)動ipt基因在番茄中表達，結果表明在果實中專一表達。另外，Atkinson (Atkinson R G et al. 1995)和Wang(Wang Z Y et al. 2000)分別研究了蘋果ACC合成酶、PG基因和獼猴 桃PG基因的表達，它們均為果實特異表達，分離三個基因的啟動子，分別與報告基因GUS構 建表達載體且轉(zhuǎn)化番茄，在轉(zhuǎn)基因番茄中GUS表達表明呈現(xiàn)果實成熟特異性。香蕉的啟動 子研究也獲得一些進展，王新立等(2001)克隆了香蕉ACC合成酶和氧化酶基因的啟動子， 通過⑶S基因的瞬時表達研究證實為果實特異性，但未見更深入的研究報道。亦未見有果 實特異啟動子在香蕉轉(zhuǎn)基因中應用的報道。Prabodh Kumar Trivedi等2004年發(fā)現(xiàn)乙烯和 IAA可促進香蕉果實中MaExpl的啟動子(888bp)的活性，認為這個啟動子可用作香蕉中外 源基因的轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)果實成熟。香蕉淀粉粒合成酶基因(Granule-BoundStarch Synthase gene，MaGBSS)是我們通過果實抑制差減文庫獲得的一個香蕉成熟相關基因，器官表達特異性證明該基因只在果 實中表達。通過基因芯片表達和Northern blot分析，結果顯示該基因在果實中大量表達且 與果實成熟過程密切相關(香蕉果實成熟相關基因克隆及表達。楊小亮，碩士論文，2004; XuBY,Su W,Liu JHjWang JB and Jin ZQ. Differentially expressed cDNAs at the early stage ofbanana ripening identified by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray. Planta, March, 2007, 226 :529_539)，因此我們認為，MaGBSS 基因的啟動 子很可能是果實特異高效表達啟動子。為了解決香蕉作為生物反應器的需要，同時亦為在香蕉果實特異表達氨基酸合成 基因、抗衰老基因、藥用蛋白質(zhì)基因等有用基因，培育具有較高商業(yè)價值及保健價值的香蕉 新品種，本發(fā)明的目的是提供一種香蕉果實特異高效表達DNA調(diào)控元件及其植物表達載 體。本發(fā)明的技術方案為一種分離的香蕉果實特異高效表達DNA調(diào)控元件，具有序 列表中<400>項下的序列。上述DNA調(diào)控元件是包括從香蕉總DNA分離的香蕉MaGBSS基因啟動子，經(jīng)測序 其長度為606bp，通過Promoter predictions等軟件進行基礎啟動子的分析，結果表明 在93-138和182-227bp存在2處基礎啟動子區(qū)。利用該啟動子序列置換植物表達載體 PCAMBIA1304啟動子構建成一個含有MaGBSS基因啟動子驅(qū)動GFP和⑶S基因的新的植物 融合表達載體P1304PGBSS。通過基因槍法將載體pl304PGBSS轉(zhuǎn)化香蕉果實薄片、根系及葉 片中，GFP和⑶S染色顯示該啟動子為果實特異表達啟動子；啟動子啟動⑶S基因表達活性 檢測顯示，P1304PGBSS質(zhì)粒轟擊的果片活性高于pCAMBIA1304質(zhì)粒轟擊的果片，而且持續(xù) 的時間較長，說明MaGBSS基因啟動子在果實中的啟動活性高于35S啟動子，證明了 MaGBSS 基因啟動子是一個果實特異性的高效啟動子。本發(fā)明還提供了一種香蕉果實特異高效表達載體，其特征在于轉(zhuǎn)入了前述的分 離的香蕉果實特異高效表達啟動子置換植物表達載體PCAMBIA1304上的35S啟動子構建 成一個含有MaGBSS基因啟動子驅(qū)動GFP和GUS基因的新的植物融合表達載體，命名為 P1304PGBSS。[結果分析]一、MaGBSS基因啟動子的克隆及表達載體構建1. MaGBSS基因啟動子的分離及序列分析香蕉基因組DNA提取采用經(jīng)改良的SDS法小量提取香蕉基因組DNA。根據(jù)我們克 隆的MaGBSS基因的序列，根據(jù)TAIL-PCR方法的要求設計3個引物，進行PCR擴增。PCR擴 增到一條長約600bp左右的產(chǎn)物，擴增片段與pGEM-T Easy Vecter連接，于上海生工測序。 測序結果為長606bp，序列參照序列表中<400>。通過Promoter predictions等軟件進行 基礎啟動子的分析，結果表明在93-138和182-227bp存在三處基礎啟動子區(qū)。該啟動子具 有高等植物啟動子應具有的調(diào)控元件，如TATA盒、CAAT盒、轉(zhuǎn)錄起始位點及其他調(diào)控元件 (見表1)。表1 :MaGBSS基因啟動子元件分析
2.果實特異表達載體pl304PGBSS構建根據(jù)已測序的MaGBSS基因啟動子序列，在其兩端加上EcoR I和Spe I酶切位點
設計5’和3’端引物。通過PCR反應擴增啟動子目的片段，回收PCR產(chǎn)物，用EcoR I和Spe I雙酶切該產(chǎn)物和植物表達載體PCAMBIA1304，將酶切獲得的含有兩個酶切位點的啟動子 片段和pCAMBIA1304載體大片段連接獲得含有MaGBSS基因啟動子表達載體pl304PGBSS。二、MaGBSS基因啟動子的功能鑒定1.基因槍法對香蕉不同器官轉(zhuǎn)化pl304PGBSS及GFP顯微觀察、⑶S基因的組織化 學染色定位將香蕉果實用1%。氯化汞溶液消毒lOmin，用滅菌蒸餾水沖洗數(shù)次再將其徒手切 成薄片；縱剖香蕉組培苗的根并將葉切為1 2cm小塊。置上述材料于1/2MS培養(yǎng)基上， 室溫放置3h.。參照王關林的方法以pl304PGBSS、pCAMBIA1304兩種表達載體的質(zhì)粒DNA 和H2O包被金粉制備微彈，按廠商提供的使用手冊用基因槍轟擊香蕉材料。轟擊后的香蕉 材料于26°C暗培養(yǎng)。然后進行熒光顯微鏡觀察和GUS組織化學染色。顯微鏡觀察顯示， P1304GBSS載體包被的微彈轟擊的材料，葉片、根在顯微鏡下沒有觀察到藍色，而果實薄片 在果肉中觀察到藍色；PCAMBIA1304載體包被的微彈轟擊的葉片、根、果實均在顯微鏡下觀 察到藍色(

圖1，圖中藍色、黑色)。取基因槍轉(zhuǎn)化24h香蕉葉、根、果在熒光顯微鏡下觀察， P1304GBSS載體轉(zhuǎn)化的植物表達載體香蕉材料的根、葉均未發(fā)現(xiàn)熒光，而只在果實中特異表 達，轉(zhuǎn)化含有35S啟動子的pCAMBIA1304植物表達載體香蕉材料根、葉、果實均有熒光(圖 2，圖中綠色)。2.轉(zhuǎn)化材料的⑶S酶活性檢測方法參照王關林“分子克隆原理”中提供的方法。(1) pl304PGBSS和pCAMBIA1304載體轉(zhuǎn)化香蕉⑶S活性測得各轉(zhuǎn)化材料⑶S提取 液的A595，根據(jù)標準曲線計算樣品蛋白含量如下(表3)。表3 轉(zhuǎn)化24小時各器官GUS提取液中蛋白含量 根據(jù)表1可以看出，pl304PGBSS轉(zhuǎn)化的果實中⑶S蛋白明顯高于pCAMBIA1304。 PCAMBIA1304轉(zhuǎn)化的各器官中⑶S含量差別不大，而pl304PGBSS轉(zhuǎn)化的各香蕉果實高出其 他器官35-300倍左右。這個結果說明，MaGBSS基因啟動子的活性很高，在香蕉果實中略高 于目前常用的組成型強啟動子35S(圖3)，而且是果實特異性的。(2)轉(zhuǎn)化24小時后一定時間內(nèi)GUS酶活力變化與時間的對應關系基因槍轉(zhuǎn)化后數(shù) 十小時取相同重量的基因搶轟擊的果實薄片制備GUS提取液，酶反應后測得415nm處兩種 果實轉(zhuǎn)化材料Gus提取液不同反應時間的光吸收值，按0. 0170標樣OD為Inmol產(chǎn)物/ml 的標準將其換算成消光產(chǎn)物量后對時間作圖(圖4)。Gus酶活力曲線圖表明，pl304PGBSS質(zhì)粒轟擊的果片在15-60min Gus活性與 PCAMBIA1304質(zhì)粒轟擊的果片基本相同，60min后pl304PGBSS質(zhì)粒轟擊的果片的Gus活性 高于pCAMBIA1304質(zhì)粒轟擊的果片。說明MaGBSS基因啟動子在果實中的啟動活性稍高于 35S啟動子，而且持續(xù)的時間較長，證明了 MaGBSS基因啟動子是一個果實特異性的高效啟 動子，本研究從MaGBSS基因啟動子的分離、測序、植物表達載體的構建、基因槍法轉(zhuǎn)化香蕉各組織(根、莖、葉)、GFP熒光顯微觀察、⑶S基因染色定位、⑶S基因活性測定等作了 系統(tǒng)研究，獲得了一個香蕉果實特異高效表達DNA調(diào)控元件，以此啟動子轉(zhuǎn)化香蕉及番茄 等果用型植物是可行的。以下結合實例應用對本發(fā)明進行詳細說明。1.啟動子序列的克隆根據(jù)MaGBSS基因啟動子測序結果設計5’、3’引物，并分別 加上EcoR I和Spe I酶切位點(下劃線處)5’ Primer CGGAATTCTCGAGTATGGTGTTCTTTTTG 3’ Primer GGACTAGTCCACTCACGTCACTTCAGC目的片段PCR擴增在PCRlf中依次加入
滅菌水18. 9ul
香蕉基因組DNA1. Oul
緩沖液2. 5ul
dNTP0. Oul
TaqDNA聚合酶0. 5ul
5' Premer1. 5ul
3' Premer1. 5ul_總體積25ul輕輕混勻，瞬時離心，將Eppendorf管置PCR擴增儀中，蓋上加熱帽。反應程序 940C 2S、72°C 3min 7 個循環(huán)；94°C 2s ;67°C 3min. 37 個循環(huán) 67V 4min.取5. O μ 1 PCR擴增反應液進行1. O %瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm恒電壓條件下電泳 30min后，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。2.目的片段的回收用QIAQUICK Gel Extraction Kit(QAGEN)回收，方法參照說明書進行3.回收PCR產(chǎn)物和pCAMBIA1304植物表達載體用EcoR I、Spe I雙酶切?；厥?PCR 產(chǎn)物IOulBuffer E5ulBamHl5ulHindlll5ulBSA(IOOx)0. 5ulH2024. 5ul_總體積50ulpBI121 質(zhì)粒 DNA5ulBuffer E5ulBamHl5ulHindlll5ul
7
BSA(IOOx)0. 5ulH2029. 5ul_總體積50ul37°C 水浴，3.5h。4.回收MaGBSS基因啟動子和pCAMBIA1304雙酶切載體片段并連接用QlAquick Gel Extraction Kit (50)回收兩個目的片段(方法同2)，1 %瓊脂糖 凝膠電泳檢測回收結果。啟動子雙酶切片段與pBI121雙酶切載體連接反應606bp 目的片段 DNA7. OulpCAMBIA1304 雙酶切載體1. OulIOx 連接酶 buffer2ulT4DNA 連接酶Iul_總體積IOul16°C, 16h05.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒鑒定方法參照分子克隆手冊中。6. MaGBSS基因啟動子連接芪合酶基因植物表達載體的構建1)芪合酶基因PCR擴增根據(jù)已發(fā)表的芪合酶基因序列設計兩個引物，分別在5’和3’加上Bgl II和SpeI 酶切位點5' Primer CC kGATCTi GCTTCAATTTCATTACGT 3’ Primer CC ACTAGT CTCCTATTTGATACATTA利用葡萄葉片的總DNA為模板進行PCR反應
滅菌水18.9ul
葡萄基因組DNA1. Oul
緩沖液2. 5ul
dNTP0. Oul
TaqDNA聚合酶0. 5ul
5' Premer1. 5ul
3' Premer1. 5ul_總體積25ul輕輕混勻，瞬時離心，將Eppendorf管置PCR擴增儀中，蓋上加熱帽。反應程序 95°C變性1分鐘94°C變性30秒55°C退火30秒72°C延伸2分鐘35個循環(huán)72°C延伸10分 鐘取5. 0 μ IPCR擴增反應液進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，5V/cm恒電壓條件下電泳 30min后，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。獲得一條長約1500bp的條帶，測序證明是葡萄芪合酶基因。總體積10. Oul37°C 水浴，3h。經(jīng)酶切鑒定，含有MaGBSS基因啟動子及葡萄芪合酶基因的植物表達載體 P1304PGBSSH已構建成功。7.轉(zhuǎn)化香蕉1)材料與試劑巴西香蕉未成熟雄花愈傷組培由我研究室培育。卡那霉素(Kanamycin)，利福平(Rifampicin)、鏈霉素(Str印tomycin)、噻孢霉素 (Cefotaxime)、潮霉素(Hygromrycin Rif)均購自寶生物公司。2)香蕉材料的準備及抗性梯度實驗①香蕉材料的準備將巴西香蕉未成熟雄花愈傷組織接種于MS附加6-BA 2. 0mg/L、NAA 0. 2mg/L的培 養(yǎng)基上進行擴大繁殖培養(yǎng)。②抗性梯度實驗將取自香蕉未成熟雄花愈傷組織分別接種于含有潮霉素5mg/L、10mg/L、30mg/L、 50mg/L、100mg/L的MS附加6-BA 2. Omg/L、NAA 0. 2mg/L培養(yǎng)基上，進行誘芽培養(yǎng)，測定外 植體對潮霉素的敏感性及最適選擇濃度。篩選的最適潮霉素濃度為50mg/L。3)質(zhì)粒 pl304PGBSSH 導入農(nóng)桿菌 EHA105三親交配法將載體pl304PGBSSH導入農(nóng)桿菌EHA105 ①接種受體農(nóng)桿菌EHA105在含有Rif50mg/L、str 100mg/L的YEP固體培養(yǎng)基上， 28°C培養(yǎng)，長出單菌落后，挑選一個單菌落接種在液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)。②接種帶有“協(xié)助”質(zhì)粒PRK2013的大腸桿菌在含有Kan 50mg/L的固體培養(yǎng)基上， 37°C培養(yǎng)，長出菌落后挑選一個單菌落接種在相應液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)。③挑帶有中間質(zhì)粒載體pBIL2的大腸桿菌的單菌落在含有Kan 50mg/L的液體LB 培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)。④三種菌生長到OD6tltl為0. 5左右時，等體積混勻，涂布于不含抗生素的YEP固體 培養(yǎng)基上，28 °C過夜培養(yǎng)。⑤用接種針將長出的菌苔轉(zhuǎn)接至含有Rif 50mg/L、Str 100mg/L、Kan 50mg/L的 固體YEP培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2-3天，長出單菌落。同時設三個對照EHA105、pRK2013、 P1304PGBSSH。⑥將長出的單菌落再次轉(zhuǎn)接到含有上述三種抗生素的YEP固體培養(yǎng)基上，28°C培 養(yǎng)。YEP培養(yǎng)基蛋白胨10g/L pH 7.0、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/LLB培養(yǎng)基蛋白胨IOg/ L pH 7.0、酵母提取物10g/L、氯化鈉5g/L(配制固體培養(yǎng)基時，需加入15g/L瓊脂粉)挑菌苔涂三抗平板后，三個對照pl304PGBSSH、EHA105、pRK 2013都未長出菌苔或 菌落，只有三親交配產(chǎn)物長出菌苔及菌落，說PBIL2已導入農(nóng)桿菌EHA105。4)農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化香蕉未成熟雄花愈傷組織取培養(yǎng)好的香蕉未成熟雄花愈傷組織作為受體材料。從平板上挑取含有目的載 體P1304PGBSSH的農(nóng)桿菌單菌落，接種于三抗YEP液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)24小時以上，至 OD600 為 0. 6-0. 8。
將菌液分裝于IOmL離心管中，4°C，4000rpm，離心lOmin，棄上清。將菌體重懸于2 倍體積，附加500uM乙酰丁香酮(Acetosyringone AS)的MS液體培養(yǎng)基中。將菌液倒入無 菌小燒杯內(nèi)，將受體材料放入菌液中，分別浸泡10min、20min、30min，取出薄片放于無菌濾 紙上吸去多余菌液。將侵染過的薄片接種于MS附加6-BA 2. Omg/L、NAAO. 2mg/L的培養(yǎng)基 上，在28°C暗培養(yǎng)4-6天。將經(jīng)過共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到加有50mg/L Rif及300mg/L Cef 的脫菌分化培養(yǎng)基上，在光照為5000LX，25-28°C條件下進行誘芽選擇培養(yǎng)。待吸芽長到0. 5cm以上時切下來轉(zhuǎn)入含有50mg/L Rif的生根培養(yǎng)基(MS+O. 5mg/ LKT+1. Omg/L NAA)上進行生根培養(yǎng)。
圖1是基因槍轉(zhuǎn)化香蕉不同器官⑶S瞬時表達圖，其中A是從左至右pCAMBIA1304質(zhì) 粒轟擊香蕉根、果、葉⑶S瞬時表達圖；B是從左至右pl304BR47質(zhì)粒轟擊香蕉根、果、葉⑶S 瞬時表達圖2是基因槍轉(zhuǎn)化香蕉不同器官綠色熒光蛋白(GFP)瞬時表達圖，其中A是從左至右 PCAMBIA1304質(zhì)粒轟擊香蕉根、果、葉GFP瞬時表達圖；B是從左至右pl304BR47質(zhì)粒轟擊香 蕉根、果、葉GFP瞬時表達圖3是MaGBSS基因啟動子與35S啟動子相對酶活對比圖； 圖4是瞬間表達的轉(zhuǎn)化果實中GUS酶活性變化曲線圖。
權利要求
一種分離的香蕉果實特異高效表達啟動子，其特征在于具有序列表中<400>1項下的序列。
2.一種香蕉果實特異高效表達載體，其特征在于轉(zhuǎn)入了權利要求1所述的分離的香蕉 果實特異高效表達啟動子。
3.根據(jù)權利要求2所述的香蕉果實特異高效表達載體，其特征在于用權利要求1所述 的香蕉果實特異高效表達啟動子置換植物表達載體PCAMBIA1304上的CaMV35S啟動子，構 建成在啟動子下游含有GFP和GUS基因的香蕉果實特異高效表達載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及香蕉果實特異高效表達DNA調(diào)控元件及其植物表達載體，該啟動子長606bp，以其取代植物表達載體pCAMBIA1304上的組成型35S啟動子，構建成為一個新的植物表達載體，命名為pCSS1。用GFP基因和GUS基因瞬時表達方法檢測了含有該段啟動子及pCAMBIA1304啟動子的啟動活性，綠色熒光蛋白(GFP)顯微鏡觀察和GUS組織染色顯示該啟動子具有表達組織特異性，且略高于35S啟動子。該啟動子的獲得，為香蕉的轉(zhuǎn)基因及對香蕉果實的分子生物學研究提供了一個有力的工具，特別是為利用香蕉作為生物反應器的研究和開發(fā)創(chuàng)造了條件。因此，該啟動子的獲得，具有重要理論和實踐意義。
文檔編號C12N15/82GK101928708SQ201010237890
公開日2010年12月29日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權日2010年7月23日
發(fā)明者劉菊華, 張建斌, 徐碧玉, 王紀, 譚光蘭, 賈彩紅, 金志強 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所;農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術重點開放實驗室;中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院海口實驗站