專利名稱：含s盒的誘導型啟動子及構建和在基因工程上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種誘導型啟動子及構建和在基因工程上的應用，更具體地涉及了一種含 S盒的誘導型啟動子在水稻單子葉植物水稻抗病蟲基因工程中的應用，屬于植物基因工程 技術領域。
背景技術：
真菌、細菌、病毒等病原微生物的侵染常造成各種農作物產量和質量的下降。培育和推 廣抗病品種是防治作物病害、保證作物穩產高產最安全有效的途徑。利用植物自身抗病基 因，通過常規育種和分子標記輔助育種方法已培育了許多抗病新品種。然而，抗性基因在種 屬間利用具有一定的局限性。轉基因方法可克服上述局限，為作物抗病育種開辟了一條新 途徑，也是植物種質創新的重要途徑之一。目前，在轉基因技術中所使用的啟動子大多數為 組成型啟動子，如果使用植物組織特異性啟動子或病原誘導的植物啟動子不僅會獲得目的 產物、達到預定目標，而且也不會產生副作用。植物基因啟動子是位于結構基因5’端上游區、含有順式作用元件的DNA序列，決 定著下游基因轉錄的特異性、方向和效率，是轉錄調控的中心。高等植物啟動子區域存在各 種特征元件，包括轉錄起始位點、TATA盒、起始因子和不同的順式作用元件等。其中，TATA 框是依賴于RNA聚合酶II轉錄所必需的，決定著轉錄起始，并調控著上游激活蛋白的行為； 起始因子的功能與TATA盒相似，可影響轉錄的方向和起始點的定位，但一般不能改變啟動 子內包含2個核心序列因子的TATA活性。植物的許多性狀與啟動子的結構及其調控方式 密切相關。因此，研究啟動子不僅可以為基因工程提供重要的調控元件，也可促進從遺傳分 子基礎上發掘具有重要利用價值的植物新資源。根據植物啟動子的轉錄模式可將其分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導 型啟動子。組成型啟動子調控的基因表達不受時空限制和某種物質的誘導而在植物中表達 出來。雙子葉植物中常用的組成型啟動子花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子是目前植物基 因工程中使用最多的啟動子，它驅使轉基因產生組成型表達。它是異源病毒型啟動子，在轉 基因植物中具有較高的表達活性。組成型啟動子可應用于評價一個基因的生物學功能、轉 基因表達數量及其活性，但在改良轉基因作物的實際應用中的主要問題是(1)組成型啟 動子驅動的基因在植物各組織中均有不同程度表達，它驅動外源基因在植物的各種組織和 所有發育階段都會表達，產生大量異源蛋白或代謝產物在植物體內積累，打破了植物原有 的代謝平衡，增加了植株的代謝負擔，有些產物甚至對植物的生長發育有毒，造成了物質和 能量上的巨大浪費，同時還會改變植物的形態，影響植物正常的生長發育，甚至導致死亡； (2)植物所有細胞可能會全部進入防御模式，即使在無病原侵染時仍進行抗病反應；(3)組 成型啟動子調控表達的轉基因產物可在人和動物食用的植物組織中積累，但是生物安全性 要求不能有轉基因產物。如果用組織、器官特異型和病原誘導型啟動子取代組成型啟動子，使外源基因能 夠定時、定點、定量地在植物中表達，可以克服組成型啟動子帶來的問題。因此，組織特異型啟動子和病原誘導型啟動子的研究與應用是植物基因工程的重要內容和當今國內外研究 的熱點。利用啟動子的最好方法可能是利用一個內源抗性基因啟動子，這樣既可以減少植 物的代謝負擔，又可以避免植物防御反應的假性激活。比組成型表達和組織特異型表達更理想的表達模式是，只在需要的時間和地點表 達而且僅在感染部位啟動抗病相關基因表達。病原誘導型啟動子能達到上述較為理想的結 果，防止“逃離細胞死亡”現象出現，消除了對植物生長和發育影響的副作用。一種理想的 病原誘導型啟動子應迅速被廣譜野生型病原侵染所激活，并有廣譜抗病性。然而由于植物 對不同病原菌采取了不同的防御機制，許多重要植物抗病分子機制尚不明確，所以，目前分 離的大多數病原誘導型啟動子很少能滿足上述要求，仍然 存在輕微的“逃離細胞死亡”的現 象。因此，迫切需要分離或人工構建理想的病原誘導型啟動子。植物抗病機制研究、轉錄組 學和啟動子克隆技術的發展，為人工構建新的病原誘導型啟動子奠定了基礎。當前可使用的病原誘導型啟動子缺乏的主要原因是分離各種天然的病原誘導型 啟動子較少。與天然病原誘導型啟動子相比，人工構建病原誘導型啟動子不僅更具有廣譜 性，而且可根據不同目的進行靈活選擇，如消除啟動子表達元件，可改變啟動子的強度和病 原誘導表達基因的數量和質量。研究發現，啟動子元件在不同植物品種中防御信號是相對 保守的。因此，通過收集各種植物啟動子元件可以人工構建病原啟動子。啟動子組件有許多不同的類型，包括病原誘導型作用元件、組織特異型作用元件、 細胞特異型作用元件和人工組建啟動子所需的最小啟動子區段。其中病原誘導型作用元件 在抗病方面是最重要的。已知的植物轉錄因子家族中有許多在抗病反應中起重要作用的成 員，其中包括 WRKYs、ERFs, bZIPs、Mybs、Dofs、bHLHs、ffhirly, SR 和 DBPl 等。這些轉錄因 子與I3R基因特異結合的位點即順式作用元件，對于組建啟動子作用元件是非常有用的。在植物防衛反應相關基因的表達過程中，順式作用元件通過與轉錄因子的互作 發揮著重要調控作用環境刺激經過一系列信號轉導、傳遞后，激活防衛相關轉錄因子與 特異順式作用元件的互作，從而實現相關防衛功能基因的表達。目前，通過轉基因技術提 高植物的抗逆性已成為植物基因工程中重要的研究策略。鑒于順式作用元件的上述重要 調控作用，與早期的組成型表達的抗性基因的轉基因應用相比，使用誘導型啟動子介導的 抗性基因無疑具有多方面的優勢，因此鑒定抗性相關(特別是細菌性病原相關)誘導型 啟動子已成為目前植物分子生物學研究的熱點。迄今，已經發現了幾種受不同病原誘導 的GCC box(AGC-CGCC)和受創傷、部分病原誘導的W box([T]TGAC[C/T]。在防御基因啟 動子區經常還含GCC box，它與調控茉莉酸、激發子誘導表達的JERE元件(AGACCGCC)和 調控真菌誘導表達的S box(AGCCACC)相似。S盒(核心序列AGCCACC)是2000年Kirsch 等人從荷蘭芹EL17基因啟動子發現了一個新的受病原真菌誘導的順式作用元件，是一 個類GCC (AGCCGCC)元件，與茉莉酸應答元件JERE (AGACCGCC )、干旱應答元件DRE/CRT (TACCGACAT)都具有高度相似性。這幾個順式作用元件都能特異性結合于AP2/EREBP轉錄 因子。目前，使用組成型啟動子的基因工程植物中，轉入抗病相關基因的持續表達可能 會引起無法控制的防御反應，例如“逃離細胞死亡”。利用轉基因的方法來提高作物產量 面臨的另一個主要問題是啟動子引起的背景表達，帶有開關并在病原侵染位點能迅速短暫 地誘導抗病基因表達的啟動子是比較理想的啟動子。另外，內源啟動子的分離與利用可以減少背景表達，但是某些啟動子的調控元件通常既調控病原誘導基因的表達又調控背景表 達，因而，理想的病原誘導特異型啟動子的分離迄今還比較困難。然而，隨著對啟動子作用 元件和抗病調控機制研究的深入發展，成功地分離或人工構建更理想啟動子的可能性會越 來越大。
研究表明，將馬鈴薯、擬南芥、芫荽菜、長春花等雙子葉植物中鑒定的S盒與 CaMV35S核心啟動子(-46 +8bp)融合所構建成的誘導型啟動子能在煙草、擬南芥等原生 質體中瞬間表達或在轉基因植株中被病原菌或誘發子處理后驅動^依基因表達。該結果一 方面表明S盒元件在誘導表達中的重要作用，另一方面也說明該順式作用元件的結合蛋白 及其上游的信號傳導途徑在上述多種雙子葉植物中具有保守性。但是，迄今仍缺乏在水稻 以及單子葉植物中S盒等元件應答病原菌或激發子的直接證據。進一步在水稻中開展S盒 應答病原菌、ET、JA信號的鑒定和應用研究，具有十分重要的意義(1)可望找出應答病、 蟲的順式作用元件，以這些元件為誘餌，可進一步分離其相應的轉錄因子基因；(2)由于順 式作用元件離開其宿主啟動子仍可保留其應答病原菌或誘發因子的功能，可利用這些元件 與合適啟動子核心序列(如CaMV35S、Actl等基因啟動子的核心序列)，構建響應病原菌侵 染或JA (昆蟲取食)的誘導型啟動子。

發明內容
本發明提供了一種含S盒的誘導型啟動子及構建和在基因工程上的應用，將大力促進 水稻抗病基因工程的發展與應用。本發明的含S盒的誘導型啟動子，其至少含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。構建方法如下
本發明將雙子葉植物歐芹中鑒定的應答逆境脅迫的S盒(其序列為 CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAA)與CaMV35S啟動子核心序列(-46 +8bp)融合，構建成誘導型 啟動子。所述 CaMV35S 啟動子核心序列為 TCGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTC ATTTGGAGAGGAC。本發明的含S盒的誘導型啟動子本底表達低、應答速度快、持續時間長、表達強度 適中。將上述的誘導型啟動子與抗病(蟲)等基因結合，構建成轉化載體轉化水稻，可使獲得 的轉基因水稻的外源抗性基因誘導表達，既發揮抗性基因在抗病(蟲)中的作用，又可避免 由于抗性基因過量表達導致的物質、能量的浪費和抗性基因表達產物對轉基因植物細胞本 身的不利影響。本發明的顯著優點
本發明的含S盒的誘導型啟動子在轉基因水稻中可較好地應答水稻稻瘟病菌侵染、稻 縱卷葉螟取食和機械損傷，對已經分離鑒定的具有抗病作用的小分子化合物(如乙烯利、苯 丙噻二唑、茉莉酸甲酯)的處理也有明顯的應答活性，而對干旱、低溫、高溫等非生物逆境處 理的應答活性比較弱或者不表達。該誘導型啟動子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中 具有十分重要的應用價值，其轉基因植物株系在誘導植物抗病的小分子化合物高通量篩選 中也有重要的應用價值。


圖1為瞬間表達載體ρΒΤΙΟ-GUS的質粒圖譜；圖2為pDN0R-207入門載體；
圖3為pMDC-163目的載體；
圖4為瞬間表達載體ρΒΤΙΟ-GUS的結構圖5為轉基因水稻TO代植株的目的片段PCR檢測；1-13為轉基因植株擴增產物條帶， 14為野生型擴增條帶；15為質粒擴增條帶；
圖6為稻瘟病菌侵染Tl代植株5-7天后GUS染色的結果；其中1表示5天后，2表示6 天后，3表示7天后，CK為對照；
圖7為稻縱卷葉螟取食Tl代植株葉片不同時間段后GUS組織化學染色的結果；其中1 表示3h后,2表示5h后,3表示24h后。
具體實施例方式
1載體構建過程和轉 1. 1材料與方法 材料
1. 1. 1. 1菌株和載體大腸桿菌(fecAericAia co7i)DH5 a和DB3. 1 (福建農林大學生 命科學學院實驗室保存)；根癌農桿菌(^rohcteriws tumefaciems) EEAlOb菌株(福建農 林大學生命科學學院實驗室保存);pBT10_GUS瞬間表達載體(見圖1)由(Weisshaar教授惠 贈，Sprenger-Haussels and ffeisshaar, 2000);pDN0R_207 入門載體(見圖 2)和 pMDC-163 目的載體(見圖3)均購自Invitrogen公司。1. 1. 1. 2生化試劑DNA快速回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自上海生工生物工 程有限公司，損a/、SacU SpeU PfuTaq酶、rh^酶、T4連接酶和dNTP等購自TaKaRa公司， Gateway載體構建試劑盒購自Irwitrogen公司，慶大霉素、卡那霉素、利福平、羧卞青霉素、 潮霉素、X-gluc等為Sigma公司產品。其它化學試劑均為國產化學純。1. 1. 1. 3引物引物序列由上海生工公司合成，如表1所示。表1引物名稱和核苷酸序列
1. 1. 1. 4序列合成根據Ohme-Takagi and Shinshi中的S盒序列，(其中劃線堿基為 附加上去的，使正反鏈退火合成的雙鏈兩側分別帶有損a/和兩個限制性酶切位點)分別委托上海博亞生物技術公司合成，如表2所示。
表2合成鏈的名稱和核苷酸序列
1. 1. 1. 5外植體粳稻品種日本晴sativa μ/λ的成熟胚所誘導愈傷
組織為轉化所用外植體。1. 1. 1. 6生物和非生物脅迫處理稻瘟病菌(菌株為識分生孢子、稻縱卷葉 螟幼蟲。方法
1. 1. 2. 1構建含二倍盒的誘導型啟動子瞬間表達載體將1. 1. 1. 4中合成的帶有損a/ 和SpeI限制性酶切位點的S盒雙鏈寡核苷酸片段插入ρΒΤΙΟ-GUS的相應酶切位點上(如 圖4所示)，獲得含有單拷貝S盒的載體ρΒΤΙΟ-Χ-GUS (X-S盒，下同)，將載體pBT10_X_GUS 分別用XbaI/SacI和SpeI/SacI組合酶切(37°酶切3_5h)，回收含S盒的片段通過使用T4 連接酶進行連接、轉化大腸桿菌DH5 a和驗證，從而獲得帶有2個S盒拷貝串聯的瞬間表達 載體 pBT 10-XX-GUS。1. 1. 2. 2構建含二倍盒的誘導型啟動子植物表達載體根據上述1. 1. 2. 1中構 建好的瞬間表達載體ρΒΤΙΟ-ΧΧ-GUS上二倍的S盒和其下游相鄰的CaMV35S核心啟動子 (-46 +8bp)片段設計Gateway內側引物，運用Gateway載體構建技術(參考Invitrogen 公司Gateway 技術)構建植物表達載體，以pDN0R-207載體為入門載體，pMDC-163為目的載 體從而獲得可用于植物遺傳轉化的誘導表達載體PMDC-XX-163，表達載體轉化農桿菌菌株 EHA105備用(取Iug左右的pMDC-XX-163載體質粒加入到EHA105感受態細胞中，混勻后，冰 浴30min ；液氮速凍3min ；取出后37°C水浴5min ；冰浴2min ；加入400ul不加抗生素的YEP 液體培養基，28 V，ISOrpm搖培4h ；取出后涂在含有50mg/L卡那霉素和利福平的YEP固體 培養基，28°C培養到形成單菌落，挑取單克隆菌落進行PCR驗證)。1. 1. 2. 3植物表達載體轉化農桿菌以及對水稻的遺傳轉化用接種針挑取含目 的基因pMDC-XX-163的農桿菌EHA105菌液，劃線于濃度為50mg/L卡那霉素和利福平的AB 固體培養基，置于28°C黑暗培養3-4d。從上述AB培養基上挑取一個單克隆于AAM液體培 養基中置于28°C搖床，直至OD值為0. 1。取脫殼的日本晴種子用70%乙醇消毒l-2min，無 菌水沖洗5遍，接著用2. 5%次氯酸鈉溶液(每50ml2. 5%次氯酸鈉溶液含一滴Tween-20)消 毒15min，用無菌水沖洗5遍，后置于滅菌過的濾紙上晾干，再接到N6D+2. 4D誘導培養基，置 于32°C光照培養箱中光照培養5-7d誘導產生愈傷組織。取出經誘導培養的種子，拔芽后 浸入上述OD為0. 1的AAM菌液中(含AS 10-20mg/L) lOmin，期間輕輕晃動，后用濾紙吸干 愈傷表面的菌液。將愈傷轉移到2N6-AS培養基上含AAM液體培養基的無菌濾紙上，25°C黑 暗共培養3d。將共培養后的愈傷于無菌水中清洗5-6遍直至無混濁出現，接著用含500mg/ L羧芐青霉素的無菌水清洗30min，用濾紙吸干，將愈傷置于N6D篩選培養基上(含400mg/L 羧芐青霉素、2mg/L 2.4-D和50mg/L的潮霉素)32°C光照篩選培養2周。將經篩選培養的愈傷轉移到RE- III培養基上(含0. 02mg/L α -NAA、2mg/L KT、50mg/L潮霉素和400mg/L羧芐 青霉素)32°C光照分化培養2-3周。取分化出來的小苗轉移到HF生根培養基上30°C誘導 生根培養1周。1. 1. 2. 4轉基因水稻DNA的提取以及分子檢測水稻基因組DNA的提取參照文獻(sambrook and russel, 2002)方法。用Gateway內側特異引物序列對其進行PCR檢測(如 圖5所示)，圖中以表達載體ρΒΤΙΟ-ΧΧ-GUS為陽性對照，以非轉基因水稻為陰性對照，從圖 中可以看出1 13出現與陽性對照一樣的PCR條帶，說明均為陽性轉基因植物。1. 1. 2. 5轉基因植株生物和非生物脅迫處理取Tl代飽滿種子經含潮霉素的水 溶液(濃度50mg/L)抗性篩選每天12h光照、25°C、培養7_8d后取能正常萌發的綠色小苗種 到盛有土壤的塑料小花盆中，以尿素和有機肥作為基肥，出苗后追肥兩次尿素。3-4葉期時 采用噴霧接種法接種濃度為105個/mL的稻瘟病菌(菌株為識仏77)分生孢子后移至25°C 和80%濕度的溫室培養數天。稻縱卷葉螟幼蟲取食Tl代轉基因植株5-6葉期的幼嫩葉片 不同時間段后將稻縱卷葉螟幼蟲從葉片上移走。1. 1. 2. 6組織化學染色生物脅迫和非生物脅迫應答結果檢測按照 (Jefferson, 1987)的方法配置⑶S染色液，于_20°C避光儲存。經上述生物和非生物脅迫 處理后剪取5-6cm葉片于37°C放置12h再用70%乙醇脫色，期間更換乙醇數次。待脫色完 全后拍取其照片。2 S盒對稻縱卷葉螟和稻瘟病等生物逆境脅迫的應答
Tl代S-GUS轉基因植株生長到3-4葉期時被稻瘟病(菌株為乃分生孢子侵染后 培養5-7天分別檢測⑶S報告基因的表達情況發現，隨著接種后培養時間的增加病害逐漸 變得嚴重，而⑶S的表達量也隨著增加，尤其是病害嚴重的區域。在未經稻瘟病菌侵染的Tl 代同齡植株除靠近用剪刀剪取部位外葉片其他部位未檢測到明顯的GUS活性(見圖6)。用稻縱卷葉螟幼蟲取食Tl代轉基因水稻5-6葉期植株的幼嫩葉片，從開始取食時 開始計時3h、5h、24h后輕輕將稻縱卷葉螟從葉片上移走。剪取葉片5-6cm浸入⑶S液中于 370C 12h后分別檢測上述不同時間段取食后GUS基因表達量的變化，在稻縱卷葉螟取食處 能檢測到明顯的GUS活性，隨著取食時間延長受損區域增加GUS表達相應的增加(見圖7)。3 結論
將含有S順式作用元件的35S啟動子連接上GUS報告基因導入水稻，在稻縱卷葉螟和 稻瘟病等生物逆境脅迫下，觀察到轉基因水稻中⑶S得到了一定的表達，這說明水稻中也 存在能識別S元件(或含S核心序列的元件)、并與之結合促使報告基因⑶S表達的AP2/ EREBP類轉錄因子。
權利要求
一種含S盒的誘導型啟動子，其至少含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種如權利要求1所述的誘導型啟動子的構建方法，其特征在于將雙子葉植物歐 芹中鑒定的應答逆境脅迫的S盒與CaMV35S啟動子核心序列融合，構建成誘導型啟動子。
3.根據權利要求2所述的誘導型啟動子的構建方法，其特征在于所述S盒的核苷酸 序列為 CAGCCACCAAAGAGGACCCAGAA。
4.根據權利要求2所述的誘導型啟動子的構建方法，其特征在于所述CaMV35S啟動 子核心序列為 TCGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC。
5.一種含有權利要求1所述的誘導型啟動子或由權利要求2所述的方法構建的誘導型 啟動子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種含S盒的誘導型啟動子及構建和在基因工程上的應用，所述誘導型啟動子至少含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，構建方法是將雙子葉植物歐芹中鑒定的應答逆境脅迫的S盒與CaMV35S啟動子核心序列融合構建而成。本發明的誘導型啟動子在轉基因水稻中可較好地應答水稻稻瘟病菌侵染、稻縱卷葉螟取食和機械損傷，對已經分離鑒定的具有抗病作用的小分子化合物的處理也有明顯的應答活性，而對干旱、低溫、高溫等非生物逆境處理的應答活性比較弱或者不表達。該誘導型啟動子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中具有十分重要的應用價值，其轉基因植物株系在誘導植物抗病的小分子化合物高通量篩選中也有重要的應用價值。
文檔編號C12N15/10GK101886078SQ20101025449
公開日2010年11月17日 申請日期2010年8月17日 優先權日2010年8月17日
發明者何水林, 劉志欽, 官德義, 方開星, 牟少亮, 王小燕, 王芳權, 黃定全 申請人:福建農林大學