專利名稱：含jere盒的誘導型啟動子及構建和在基因工程上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種誘導型啟動子及構建和在基因工程上的應用，更具體地涉及了一種含 JERE盒的誘導型啟動子在單子葉植物水稻抗病蟲基因工程中的應用，屬于植物基因工程技 術領域。
背景技術：
真菌、細菌、病毒等病原微生物的侵染常造成各種農作物產量和質量的下降。培育和推 廣抗病品種是防治作物病害、保證作物穩產高產最安全有效的途徑。利用植物自身抗病基 因，通過常規育種和分子標記輔助育種方法已培育了許多抗病新品種。然而，抗性基因在種 屬間利用具有一定的局限性。轉基因方法可克服上述局限，為作物抗病育種開辟了一條新 途徑，也是植物種質創新的重要途徑之一。目前，在轉基因技術中所使用的啟動子大多數為 組成型啟動子，如果使用植物組織特異性啟動子或病原誘導的植物啟動子不僅會獲得目的 產物、達到預定目標，而且也不會產生副作用。植物基因啟動子是位于結構基因5’端上游區、含有順式作用元件的DNA序列，決 定著下游基因轉錄的特異性、方向和效率，是轉錄調控的中心。高等植物啟動子區域存在各 種特征元件，包括轉錄起始位點、TATA盒、起始因子和不同的順式作用元件等。其中，TATA 框是依賴于RNA聚合酶II轉錄所必需的，決定著轉錄起始，并調控著上游激活蛋白的行為； 起始因子的功能與TATA盒相似，可影響轉錄的方向和起始點的定位，但一般不能改變啟動 子內包含2個核心序列因子的TATA活性。植物的許多性狀與啟動子的結構及其調控方式 密切相關。因此，研究啟動子不僅可以為基因工程提供重要的調控元件，也可促進從遺傳分 子基礎上發掘具有重要利用價值的植物新資源。根據植物啟動子的轉錄模式可將其分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導 型啟動子。組成型啟動子調控的基因表達不受時空限制和某種物質的誘導而在植物中表達 出來。雙子葉植物中常用的組成型啟動子花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子是目前植物基 因工程中使用最多的啟動子，它驅使轉基因產生組成型表達。它是異源病毒型啟動子，在轉 基因植物中具有較高的表達活性。組成型啟動子可應用于評價一個基因的生物學功能、轉 基因表達數量及其活性，但在改良轉基因作物的實際應用中的主要問題是(1)組成型啟 動子驅動的基因在植物各組織中均有不同程度表達，它驅動外源基因在植物的各種組織和 所有發育階段都會表達，產生大量異源蛋白或代謝產物在植物體內積累，打破了植物原有 的代謝平衡，增加了植株的代謝負擔，有些產物甚至對植物的生長發育有毒，造成了物質和 能量上的巨大浪費，同時還會改變植物的形態，影響植物正常的生長發育，甚至導致死亡； (2)植物所有細胞可能會全部進入防御模式，即使在無病原侵染時仍進行抗病反應；(3)組 成型啟動子調控表達的轉基因產物可在人和動物食用的植物組織中積累，但是生物安全性 要求不能有轉基因產物。如果用組織、器官特異型和病原誘導型啟動子取代組成型啟動子，使外源基因能 夠定時、定點、定量地在植物中表達，可以克服組成型啟動子帶來的問題。因此，組織特異型啟動子和病原誘導型啟動子的研究與應用是植物基因工程的重要內容和當今國內外研究 的熱點。利用啟動子的最好方法可能是利用一個內源抗性基因啟動子，這樣既可以減少植 物的代謝負擔，又可以避免植物防御反應的假性激活。比組成型表達和組織特異型表達更理想的表達模式是，只在需要的時間和地點表 達而且僅在感染部位啟動抗病相關基因表達。病原誘導型啟動子能達到上述較為理想的結 果，防止“逃離細胞死亡”現象出現，消除了對植物生長和發育影響的副作用。一種理想的 病原誘導型啟動子應迅速被廣譜野生型病原侵染所激活，并有廣譜抗病性。然而由于植物 對不同病原菌采取了不同的防御機制，許多重要植物抗病分子機制尚不明確，所以，目前分 離的大多數病原誘導型啟動子很少能滿足上述要求，仍然存在輕微的“逃離細胞死亡”的現 象。因此，迫切需要分離或人工構建理想的病原誘導型啟動子。植物抗病機制研究、轉錄組 學和啟動子克隆技術的發展，為人工構建新的病原誘導型啟動子奠定了基礎。當前可使用的病原誘導型啟動子缺乏的主要原因是分離各種天然的病原誘導型 啟動子較少。與天然病原誘導型啟動子相比，人工構建病原誘導型啟動子不僅更具有廣譜 性，而且可根據不同目的進行靈活選擇，如消除啟動子表達元件，可改變啟動子的強度和病 原誘導表達基因的數量和質量。研究發現，啟動子元件在不同植物品種中防御信號是相對 保守的。因此，通過收集各種植物啟動子元件可以人工構建病原啟動子。啟動子組件有許多不同的類型，包括病原誘導型作用元件、組織特異型作用元件、 細胞特異型作用元件和人工組建啟動子所需的最小啟動子區段。其中病原誘導型作用元件 在抗病方面是最重要的。已知的植物轉錄因子家族中有許多在抗病反應中起重要作用的成 員，其中包括 WRKYs、ERFs, bZIPs、Mybs、Dofs、bHLHs、ffhirly, SR 和 DBPl 等。這些轉錄因 子與I3R基因特異結合的位點即順式作用元件，對于組建啟動子作用元件是非常有用的。在植物防衛反應相關基因的表達過程中，順式作用元件通過與轉錄因子的互作發 揮著重要調控作用環境刺激經過一系列信號轉導、傳遞后，激活防衛相關轉錄因子與特 異順式作用元件的互作，從而實現相關防衛功能基因的表達。目前，通過轉基因技術提高 植物的抗逆性已成為植物基因工程中重要的研究策略。鑒于順式作用元件的上述重要調 控作用，與早期的組成型表達的抗性基因的轉基因應用相比，使用誘導型啟動子介導的抗 性基因無疑具有多方面的優勢，因此鑒定抗性相關(特別是細菌性病原相關)誘導型啟動 子已成為目前植物分子生物學研究的熱點。迄今，已經發現了幾種受不同病原誘導的GCC box(AGC-CGCC)和受創傷、部分病原誘導的W box([T]TGAC[C/T]。在防御基因啟動子區經 常還含GCC box，它與調控茉莉酸、激發子誘導表達的JERE元件(AGACCGCC)和調控真菌誘 導表達的S box(AGCCACC)相似。JERE(Jasmonic acid and elicitor responsive element) 是在長春花色氨酸羧化酶σ論)基因啟動子中發現與AP2/ERF轉錄因子0RCA3結合而且應 答JA和病原菌激發子的順式作用原件，其核心序列為AGACCGCC。目前，使用組成型啟動子的基因工程植物中，轉入抗病相關基因的持續表達可能 會引起無法控制的防御反應，例如“逃離細胞死亡”。利用轉基因的方法來提高作物產量 面臨的另一個主要問題是啟動子引起的背景表達，帶有開關并在病原侵染位點能迅速短暫 地誘導抗病基因表達的啟動子是比較理想的啟動子。另外，內源啟動子的分離與利用可以 減少背景表達，但是某些啟動子的調控元件通常既調控病原誘導基因的表達又調控背景表 達，因而，理想的病原誘導特異型啟動子的分離迄今還比較困難。然而，隨著對啟動子作用元件和抗病調控機制研究的深入發展，成功地分離或人工構建更理想啟動子的可能性會越 來越大。研究表明，將馬鈴薯、擬南芥、芫荽菜、長春花等雙子葉植物中鑒定的JERE盒與 CaMV35S核心啟動子(-46 +8bp)融合所構建成的誘導型啟動子能在煙草、擬南芥等原生 質體中瞬間表達或在轉基因植株中被病原菌或誘發子處理后驅動^依基因表達。該結果 一方面表明JERE盒元件在誘導表達中的重要作用，另一方面也說明該順式作用元件的結 合蛋白及其上游的信號傳導途徑在上述多種雙子葉植物中具有保守性。但是，迄今仍缺乏 在水稻以及單子葉植物中JERE盒等元件應答病原菌或激發子的直接證據。進一步在水稻 中開展JERE盒應答病原菌、ET、JA信號的鑒定和應用研究，具有十分重要的意義(1)可 望找出應答病、蟲的順式作用元件，以這些元件為誘餌，可進一步分離其相應的轉錄因子基 因；(2)由于順式作用元件離開其宿主啟動子仍可保留其應答病原菌或誘發因子的功能， 可利用這些元件與合適啟動子核心序列(如CaMV35S、Actl等基因啟動子的核心序列)，構 建響應病原菌侵染或JA (昆蟲取食)的誘導型啟動子。

發明內容
本發明提供了一種含JERE盒的誘導型啟動子及構建和在基因工程上的應用，可較好 地應答生物和非生物逆境脅迫的誘導，將大力促進水稻抗病基因工程的發展與應用。本發明的含JERE盒的誘導型啟動子，其至少含有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序 列。構建方法如下
本發明將雙子葉植物歐芹中鑒定的應答逆境脅迫的JERE盒(其序列為 AGACCGCCAAAGAGGACCCAGAAT)與CaMV35S啟動子核心序列(-46 +8bp)融合，構建成誘導 型啟動子。所述 CaMV35S 啟動子核心序列為 TCGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATT TCATTTGGAGAGGAC。本發明的含JERE盒的誘導型啟動子本底表達低、應答速度快、持續時間長、表達 強度適中。將上述的誘導型啟動子與抗病(蟲)等基因結合，構建成轉化載體轉化水稻，可使 獲得的轉基因水稻的外源抗性基因誘導表達，既發揮抗性基因在抗病(蟲)中的作用，又可 避免由于抗性基因過量表達導致的物質、能量的浪費和抗性基因表達產物對轉基因植物細 胞本身的不利影響。
本發明的顯著優點
本發明的含JERE盒的誘導啟動子在轉基因水稻中可較好地應答水稻稻瘟病菌侵染、 稻縱卷葉螟取食和機械損傷等生物與非生物脅迫。該誘導型啟動子在單子葉植物水稻抗 病、蟲基因工程中具有十分重要的應用價值，其轉基因植物株系在誘導植物抗病的小分子 化合物高通量篩選中也有重要的應用價值。


圖1為瞬間表達載體ρΒΤΙΟ-GUS的質粒圖譜； 圖2為pDN0R-207入門載體；
圖3為pMDC-163目的載體；圖4為瞬間表達載體ρΒΤΙΟ-GUS的結構圖5為轉基因水稻TO代植株的目的片段PCR檢測；1 17，為陽性轉基因植株； 18，為非轉基因植株；19，為陽性對照；M，為Marker 2000
圖6為稻縱卷葉螟取食Tl代植株葉片不同時間段后GUS組織化學染色的結果，其中1 表示0. 5h后；2，表示Ih后；3，表示2h后；4，表示3h后；5，表示4h后；6，表示5h后；7，表 示12h后；8，表示24h后；
圖7為稻瘟病侵染不同時間段后對轉基因水稻GUS基因表達的影響；其中1，表示5天 后；2表示6天后；3，表示7天后；4，表示8天后；
圖8為機械損傷Tl代植株葉片不同時間段后GUS組織化學染色的結果；其中1，表示 0. 5h后；2，表示Ih后；3，表示2h后；4，表示3h后；5，表示4h后；6，表示5h后；7，表示12h 后；8，表示24h后。
具體實施例方式
1載體構建過程和轉基因植株的獲得 材料與方法 材料
1. 1. 1. 1菌株和載體大腸桿菌(fecAericAia co7i)DH5 a和DB3. 1 (福建農林大學生 命科學學院實驗室保存)；根癌農桿菌(^rohcteriws tumefaciems) EEAlOb菌株(福建農 林大學生命科學學院實驗室保存);pBT10_GUS瞬間表達載體(見圖1)由(Weisshaar教授惠 贈，Sprenger-Haussels and ffeisshaar, 2000);pDN0R_207 入門載體(見圖 2)和 pMDC-163 目的載體(見圖3)均購自Invitrogen公司。1. 1. 1. 2生化試劑DNA快速回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自上海生工生物工 程有限公司，損a/、SacU SpeU PfuTaq酶、rh^酶、T4連接酶和dNTP等購自TaKaRa公司， Gateway載體構建試劑盒購自Irwitrogen公司，慶大霉素、卡那霉素、利福平、羧卞青霉素、 潮霉素、X-gluc等為Sigma公司產品。其它化學試劑均為國產化學純。1. 1. 1. 3引物引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，如表1所示。表1引物名稱和核苷酸序列
1. 1. 1. 4序列合成根據Ohme-Takagi and Shinshi中的JERE盒序列，(其中劃線堿基 為附加上去的，使正反鏈退火合成的雙鏈兩側分別帶有損a/和兩個限制性酶切位點) 分別委托上海博亞生物技術公司合成，如表2所示。
表2合成鏈的名稱和核苷酸序列 1. 1. 1. 6生物和非生物脅迫稻瘟病菌(菌株為識分生孢子、稻縱卷葉螟幼 蟲、機械損傷等脅迫處理。方法
1. 1. 2. 1構建含二倍盒的誘導型啟動子瞬間表達載體將1. 1. 1. 4中合成的帶有損a/ 和SpeI限制性酶切位點的JERE盒雙鏈寡核苷酸片段插入pBT10_GUS的相應酶切位點上 (如圖4所示)，獲得含有單拷貝JERE盒的載體ρΒΤΙΟ-Χ-GUS (X-JERE盒，下同)，將載體 pBT 10-X-GUS分別用損和分組合酶切(37°酶切3_5h)，回收含JERE元盒 的片段通過使用T4連接酶進行連接、轉化大腸桿菌DH5 a和驗證，從而獲得帶有2個JERE 盒拷貝串聯的瞬間表達載體pBTlO-XX-GUS。1. 1. 2. 2構建含二倍盒的誘導型啟動子植物表達載體根據上述1. 1. 2. 1中構建 好的瞬間表達載體ρΒΤΙΟ-ΧΧ-GUS上的JERE盒和其下游相鄰的CaMV35S核心啟動子(-46 +8bp)片段設計Gateway內側引物，運用Gateway載體構建技術(參考Invitrogen公司 Gateway 技術)構建植物表達載體，以pDN0R-207載體為入門載體，pMDC-163為目的載體從 而獲得可用于植物遺傳轉化的誘導植物表達載體PMDC-XX-163，表達載體轉化農桿菌菌株 EHA105備用(取Iug左右的pMDC-XX-163載體質粒加入到EHA105感受態細胞中，混勻后，冰 浴30min ；液氮速凍3min ；取出后37°C水浴5min ；冰浴2min ；加入400ul不加抗生素的YEP 液體培養基，280C，ISOrpm搖培4h ；取出后涂在含有50mg/L卡那霉素和利福平的YEP固體 培養基，28°C培養到形成單菌落，挑取單克隆菌落進行PCR驗證)。1. 1. 2. 3植物表達載體轉化農桿菌以及對水稻的遺傳轉化用接種針挑取含目的 基因pMDC-XX-163的農桿菌EHA105菌液，劃線于濃度為50mg/L卡那霉素和利福平的AB固 體培養基，置于28°C黑暗培養3-4d。從上述AB培養基上挑取一個單克隆于AAM液體培養 基中置于28°C搖床，搖至OD值為0. 1。取脫殼的日本晴種子用70%乙醇消毒l-2min，無菌 水沖洗5遍，接著用2. 5%次氯酸鈉溶液(每50ml2. 5%次氯酸鈉溶液含一滴Tween-20)消毒 15min,用無菌水沖洗5遍，后置于滅菌過的濾紙上晾干，再接到N6D+2. 4D誘導培養基，置于 32°C光照培養箱中光照培養5-7d誘導產生愈傷組織。取出經誘導培養的種子，拔芽后浸入 上述OD為0. 1的AAM菌液中(含AS 10-20mg/L) IOmin,期間輕輕晃動，后用濾紙吸干愈傷 表面的菌液。將愈傷轉移到2N6-AS培養基上含AAM液體培養基的無菌濾紙上，25°C黑暗共培養3d。將共培養后的愈傷于無菌水中清洗5-6遍直至無混濁出現，接著用含500mg/L羧 芐青霉素的無菌水清洗30min，用濾紙吸干，將愈傷置于N6D篩選培養基上(含400mg/L羧芐 青霉素、2mg/L 2.4-D和50mg/L的潮霉素)32°C光照篩選培養2周。將經篩選培養的愈傷 轉移到RE-III培養基上(含0. 02mg/L α -NAA、2mg/L KT、50mg/L潮霉素和400mg/L羧芐青霉 素)32°C光照分化培養2-3周。取分化出來的小苗轉移到HF生根培養基上30°C誘導生根 培養1周。1. 1. 2. 4轉基因水稻DNA的提取以及分子檢測水稻基因組DNA的提取參照文獻 (sambrook and russel, 2002)方法。用Gateway內側特異引物序列對其進行PCR檢測(如 圖5所示)，圖中以表達載體ρΒΤΙΟ-ΧΧ-GUS為陽性對照，以非轉基因水稻為陰性對照，從圖 中可以看出1 17出現與陽性對照一樣的PCR條帶，說明均為陽性轉基因植物。1. 1. 2. 5轉基因植株生物和非生物脅迫處理取Tl代飽滿種子經含潮霉素的水 溶液(濃度50mg/L)抗性篩選每天12h光照、25°C、培養7_8d后取能正常萌發的綠色小苗種 到盛有土壤的塑料小花盆中，以尿素和有機肥作為基肥，出苗后追肥兩次尿素。3-4葉期時 采用噴霧接種法接種濃度為105個/mL的稻瘟病菌(菌株為識仏77)分生孢子后移至25°C 和80%濕度的溫室培養數天。稻縱卷葉螟幼蟲取食Tl代轉基因植株5-6葉期的幼嫩葉片 不同時間段后將稻縱卷葉螟幼蟲從葉片上移走。機械損傷處理用解剖刀對Tl代轉基因植 株5-6葉期幼嫩葉片切割數處2-3cm傷口。1. 1. 2. 6組織化學染色生物脅迫和非生物脅迫應答結果檢測按照 (Jefferson, 1987)的方法配置⑶S染色液，于-20°C避光儲存。經上述生物和非生物脅迫 處理后剪取5-6cm葉片于37°C放置12h再用70%乙醇脫色，期間更換乙醇數次。待脫色完 全后拍取其照片。代轉基因植株對生物、非生物脅迫的應答 代轉基因植株用稻縱卷葉螟幼蟲取食處理
用稻縱卷葉螟幼蟲從開始取食主要功能葉片時計時0. 5h、lh、2h、3h、4h、5h、12h和24h 后輕輕將蟲從葉片上移走。剪取葉片5-6cm浸入⑶S液中于37°C黑暗放置12h后進行脫色 處理，可以清晰觀察到上述不同時間段取食后GUS基因表達量的變化，在稻縱卷葉螟取食 處能檢測到明顯的GUS活性，隨著被取食時間增加，葉片受損區域增加進行GUS染色后發現 其表達也隨著遞減。該結果說明，該啟動子能應答咀嚼式口器昆蟲危害，而且隨著危害的加 重其介導的表達也隨之降低(見圖6 )。代轉基因植株稻瘟病處理
Tl代JERE-GUS轉基因植株生長到3-4葉期時用稻瘟病(菌株為guy 11)分生孢子侵染 后移至25°C和濕度為80%的溫室培養5-8d分別檢測⑶S報告基因的表達情況，發現接種 后隨著培養時間的延長病害逐漸變得嚴重，而GUS的表達量也隨著增加，第5d時GUS表達 僅局限于病原菌侵染的區域，而到第7d和第8d時隨著病害的增加GUS表達在病害嚴重的 區域或其周圍，甚至擴散至整片葉片。該結果說明，該啟動子能應答病原菌侵染在侵染處表 達，而且隨著病害的加重其表達也隨之增強(見圖7)。代轉基因水稻對機械損傷的應答
機械損傷處理用解剖刀對Tl代轉基因植株5-6葉期取幼嫩葉片切割數處2- 3cm傷 口，分別于0. 5h、lh、2h、3h、4h、5h、12h、24h后剪取傷口附近5_6cm長的葉片浸入GUS液中置于37°C黑暗放置12h，后分別檢測上述不同時間段處理后⑶S表達量的變化。經染色后 在用解剖刀切割傷口處可見清晰的藍色，在此實驗中其結果說明，該啟動子能快速應答機 械損傷脅迫，在短時間內(Ih或2h時)其表達達到最強。該啟動子介導的表達持續時間長， 從機械損傷0. 5h開始一直持續到24h，而且隨著損傷時間的延長其介導的表達也逐漸減弱 (見圖8)。討論
本發明選擇從雙子葉植物長春花中發現的JA和激發子應答元件JERE，將其從啟動子 側翼序列中分離出來并與CaMV35S核心啟動子(-46 +8bp)融合，再連接G依報告基因，對 水稻進行遺傳轉化。獲得其水稻轉基因Tl株系，利用該轉基因株系葉片，通過分析G依基 因的表達來檢測JERE介導的信號途徑在水稻中對不同逆境的應答作用，結果發現轉基因 水稻種JERE可不受其原來啟動子上側翼序列的影響，對稻瘟病、稻縱卷葉螟等生物逆境產 生響應。植物在進化過程中經過自然選擇形成了調控較為嚴密的誘導型抗逆反應，通過適 時、適量地啟動防衛反應使抗逆與生長并行不悖，使植物體內物質和能量得到高效利用，誘 導型防衛反應機制在植物抗逆基因工程遺傳改良中具有十分重要的指導意義。研究表明， 抗逆基因在轉基因植物中組成型表達往往導致轉基因植物生長和表型上的缺陷，解決這一 問題的對策之一是采用誘導型啟動子。綜上所述本發明所構建的二倍JERE元件與CaMV35S核心啟動子融合所形成的誘 導型啟動子具有本底表達低、應答速度快、持續時間長、表達強度適中以及其表達量與病害 程度相一致，可較好地應答生物和非生物逆境脅迫的誘導。對于促進水稻抗病、抗蟲基因工 程的實用化；同時通過啟動子的鑒定將植物抗病、抗蟲分子生物學研究成果向糧食作物水 稻延伸，促進水稻抗病、抗蟲的分子機制研究具有重要意義。
權利要求
一種含JERE盒的誘導型啟動子，其至少含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種如權利要求1所述的誘導型啟動子的構建方法，其特征在于將雙子葉植物歐 芹中鑒定的應答逆境脅迫的JERE盒與CaMV35S啟動子核心序列融合，構建成誘導型啟動 子。
3.根據權利要求2所述的誘導型啟動子的構建方法，其特征在于所述JERE盒的核苷 酸序列為 AGACCGCCAAAGAGGACCCAGAAT。
4.根據權利要求2所述的誘導型啟動子的構建方法，其特征在于所述CaMV35S啟動 子核心序列為 TCGACCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGAC0
5.一種含有權利要求1所述的誘導型啟動子或由權利要求2、3或4所述的方法構建的 誘導型啟動子在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種含JERE盒的誘導型啟動子及構建和在基因工程上的應用，所述誘導型啟動子至少含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，構建方法是將雙子葉植物歐芹中鑒定的應答逆境脅迫的JERE盒與CaMV35S啟動子核心序列融合構建成誘導型啟動子。本發明的含JERE的誘導型啟動子本底表達低、應答速度快、持續時間長、表達強度適中，該誘導型啟動子在轉基因水稻中可較好地應答水稻稻瘟病菌侵染、稻縱卷葉螟取食和機械損傷等生物與非生物脅迫，在單子葉植物水稻抗病、蟲基因工程中具有十分重要的應用價值，其轉基因植物株系在誘導植物抗病的小分子化合物高通量篩選中也有重要的應用價值。
文檔編號C12N15/10GK101886080SQ20101025449
公開日2010年11月17日 申請日期2010年8月17日 優先權日2010年8月17日
發明者何水林, 劉志欽, 官德義, 方開星, 牟少亮, 王小燕, 王芳權, 黃定全 申請人:福建農林大學