專利名稱：用于定量檢測her2擴增的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于診斷癌癥的試劑盒。具體地說，本發明涉及通過定量檢測HER2擴增來診斷癌癥的試劑盒。
背景技術：
我國每年新發乳腺癌約18萬例。在近三成乳腺癌患者中，其腫瘤細胞表面的HER2 蛋白含量增多，這種情況被稱為“HER2陽性”。HER2又被稱作人表皮生長因子受體2，在調控細胞的生長、發育和分化中發揮重要作用。一旦過度表達(即HER2陽性)，HER2便會刺激癌細胞瘋狂增長，使其侵襲性增加。因此，HER2陽性乳腺癌的進展速度比其它類型乳腺癌更快，惡性程度更高，復發和轉移更快[Burstein HJ, N Engl J Med, 2005, 353 (16) 1652-1654]。研究結果表明，如果只接受常規綜合治療，HER2陽性乳腺癌患者的生存時間僅為HER2陰性患者的一半。HER2陽性乳腺癌患者可從曲妥珠單抗(Herceptin)單藥方案或與部分化療藥物聯合方案中獲益[Piccart-GebHERt MJ, Procter Μ, et al. NEngl J Med, 2005, 353 (16) 1659-1672 ；Romond EH, Perez EA, et al. NEngl J Med，2005，353 (16) :1673-1684]。單克隆抗體Here印tin與HER2受體細胞外區域結合，具有高度親和力和特異性，既能阻斷HER2 受體而產生抗腫瘤效應，又能與人體免疫細胞作用，產生抗體依賴性細胞毒(ADCC)效應和補體介導細胞毒(CDC)效應。Here印tin單藥對于HER2陽性的轉移性乳腺癌的治療總有效率為23%，對其中HER2(+++)患者的有效率達31%。目前臨床上Here印tin主要用于治療 HER2基因擴增或過度表達且伴腋窩淋巴結轉移的乳腺癌患者[Pegram MD, Konecny GE, et al. J Natl Cancer Inst，2004，96 (10) :739-749]。由此可見，如果能夠及早確定 HER2 的擴增或表達狀態，便可及早使患者接受更佳的治療方案，讓患者擁有更多的生存機會。在《中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2007版)》、《乳腺癌HER2檢測指南》 (2009版)、《乳腺癌臨床實踐指南(中國版)》(2009年第一版)中均指出對于HER2免疫組化結果不明確的患者，需要應用FISH檢測來確定。然而，FISH檢測價格較為昂貴，導致不少乳腺癌患者喪失了檢測機會。有研究表明，實時熒光PCR法與FISH方法檢測乳腺癌組織樣本的一致性高，且可能具有更高的靈敏度[Gjerdrum LM, Sorensen BS, et al. J Mol Diagn,2004,6(1) :42-51]。本試驗所用人HER2基因擴增定量檢測試劑盒(實時熒光PCR法)相對于FISH檢測具有以下優點1.樣本處理過程簡便，實驗周期短，實驗操作易于標準化。2.價格適中，易于臨床推廣。3.定量準確，這是本試劑方法最獨特的優點。通過實時熒光PCR擴增曲線參數，定量測定樣本中HER2基因拷貝數。4.減少人為實驗誤差。FISH檢測易因主觀因素造成結果誤判，同時也受到檢測者專業知識和實驗室條件的限制，且目前FISH檢測試劑價格較高，很難大面積推廣。人HER2基因擴增定量檢測試劑盒(實時熒光PCR法)是第一個實現HER2基因擴增檢測批量化、標準化的產品。

發明內容
本發明要解決的問題是提供一種HER2基因擴增的定量檢測試劑盒。為解決上述問題，本發明提供包含Taq酶、10 X Taq緩沖液、MgCl2, dNTP混合液及可特異性擴增HER2基因的PCR引物與探針的定量檢測試劑盒及檢測方法(1)針對HER2基因組DNA設計上下游引物及特異性的探針，該引物可以特異性的擴增HER2基因組的一段序列，該探針可與HER2特異性結合。(2)為定量檢測HER2擴增比例，本發明設計了內參，針對內參基因ACTB基因組 DNA設計上下游引物及特異性的探針，該引物可以特異性的擴增ACTB基因組的一段序列， 該探針可與ACTB特異性結合。(3)為定量檢測HER2擴增比例，本發明設計了標準品，對待測樣品與標準品進行 HER2與內參基因的熒光定量PCR檢測。(4)由標準品檢測結果得到用于定量的標準曲線，由標準曲線計算得到待測樣品核酸的HER2基因與ACTB基因的比例。所述步驟⑴之前還包括對待測樣品中的核酸進行提取、純化和濃度測定。針對HER2基因組DNA，熒光定量PCR檢測所用探針在適宜的PCR條件下與HER2的堿基特異性結合。所述探針優選在5’端連接有熒光發光基團，3’端連接有熒光淬滅基團。 所述的熒光發射基團選自FAM、ΤΕΤ、HEX、ROX ；所述的熒光淬滅基團選自BHQ、TAMARA。優選的，所述熒光發射基團為FAM，所述的熒光淬滅基團為BHQ。所述探針的序列優選為SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12。針對內參基因ACTB基因組DNA，熒光定量PCR檢測所用探針在適宜的PCR條件下與ACTB的堿基特異性結合。所述探針優選在5’端連接有熒光發光基團，3’端連接有熒光淬滅基團。所述的熒光發射基團選自FAM、ΤΕΤ、HEX、ROX ；所述的熒光淬滅基團選自BHQ、 TAMARA。優選的，所述熒光發射基團為FAM，所述的熒光淬滅基團為BHQ。所述探針的序列優選為 SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14。所述標準品至少包括質粒、基因組DNA或化學合成序列中的一種。優選地，所述標準品為質粒，所述含部分HER2基因序列的質粒的序列為SEQ ID NO 15 ；所述含部分ACTB 基因序列的質粒的序列為SEQ IDNO :16ο所述待檢樣品包括新鮮組織、石蠟包埋組織。所述引物由上游引物與下游引物組成。所述HER2引物優選為SEQID NO :3、SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 ；所述 ACTB 引物優選為 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :10。所述HER2基因擴增的定量檢測試劑盒包括選自以下的試劑如上所述的引物、探針和對照品。所述試劑盒優選還包括Taq酶、10XTaq緩沖液、MgCl2、dNTP混合液。優選的引物與探針的比例為2 1-10 1，優選的正向與反向引物之間的比例為1 3-3 1。


下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。
圖1是本發明實施例2所用標準品構建方法示意圖。圖2是本發明實施例2質粒圖譜，箭頭所指即為載體中插入基因PCR產物序列的位置。圖3是本發明實施例2的HER2質粒標準品測序結果圖。圖4是本發明實施例2的ACTB質粒標準品測序結果圖。圖5是本發明實施例3的標準品擴增曲線圖，其中圖A是HER2質粒標準品擴增曲線，圖B是ACTB質粒標準品擴增曲線。圖6是根據圖5繪制的標準曲線圖，其中圖A是HER2質粒標準曲線，圖B是ACTB 質粒標準曲線，圖7是本發明實施例3的樣本HER2基因擴增曲線圖，其中圖A是石蠟包埋組織擴增曲線圖；圖B是新鮮組織擴增曲線圖。圖8是本發明實施例3的樣本ACTB基因擴增曲線圖，其中圖A是石蠟包埋組織擴增曲線圖；圖B是新鮮組織擴增曲線圖。圖9是本發明的定量方法示意圖。
實施例以下的實施例用于為本領域中的普通技術人員提供有關如何實施和使用本發明的完整披露和描述，并且這些例子并非意在對發明人所認為的發明范圍進行限制，亦非意指下文的實驗是被實施的全部實驗而且是僅可實施的實驗。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南第三版(Sambrook J.)，或按照廠商所建議的條件。實施例1 人類新鮮腫瘤組織、石蠟包埋組織基因組DNA抽提我們所測試的人類新鮮乳腺癌腫瘤組織、石蠟包埋乳腺癌組織。標本DNA抽提可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的DNA提取試劑盒提取樣本基因組DNA，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量測量儀檢測所提DNA濃度與純度 (0D260/0D280約為1. 8，0D260/0D230大于2. 0)。下面以使用Promega公司的DNA提取試劑盒為例介紹樣本DNA提取步驟1.新鮮組織DNA抽提(1)用剪刀切取約黃豆粒大小的組織，置于研缽中，將組織剪碎，加液氮研成粉末。(2)加入600 μ 1預冷的裂解液于研缽中，用Iml大槍頭吹打6次，盡量使組織粉末與裂解液混勻，轉移混合物到1. 5ml EP管中，上下顛倒6次混勻后65°C水浴20分鐘。(3)加3 μ 1的RNA酶，上下顛倒6次混勻，37 °C水浴20分鐘。(4)冷卻到室溫，加200 μ 1蛋白沉淀劑，上下顛倒6次混勻，冰上放置5分鐘后 13，000*g，室溫離心4分鐘。(5)轉移上清至事先加600 μ 1異丙醇(室溫)的新EP管中，輕柔混勻6次后 13，000*g，室溫離心1分鐘。(6)棄上清，加600μ1 70%乙醇(室溫)至沉淀中，上下顛倒6次混勻后 13，000*g，室溫離心1分鐘。
(7)吸干乙醇，空氣干燥15分鐘。(8)沉淀加入40 μ 1 DNA溶解液，65°C 1小時或4°C過夜。2.石蠟包埋組織DNA抽提(1)將Img或少于Img的組織放入1. 5ml離心管內。(2)加入新鮮制備的100 μ 1溫育緩沖液/蛋白酶K溶液。根據樣品的類型，56°C 溫育過夜。(3)取出溫育的樣品管，加入兩倍體積的裂解緩沖液。(4)高速渦旋振蕩樹脂10秒鐘至樹脂完全懸浮，加入7 μ 1完全懸浮的樹脂。高速渦旋振蕩3秒鐘后室溫溫育5分鐘。(5)高速渦旋振蕩2秒鐘，將管子放在MagneSpHER2e 磁分離架上。磁分離立刻進行。(6)小心去除所有溶液，不要觸碰管壁上的樹脂。(7)加入100 μ 1裂解緩沖液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩2秒鐘。(8)將管子放回到磁分離架上，并去除所有的裂解液。(9)加入100 μ 1配制的Ix洗滌液，從磁分離架上取下管子，并高速渦旋振蕩2秒鐘。(10)將管子放回到磁分離架上，去掉所有洗滌液。(11)重復步驟9和10兩次，共3次洗滌，并確保在最后一次洗滌后，除去所有的液體。(12)打開蓋子，將管子放在磁分離架上，空氣中干燥5分鐘。(13)加入25 μ 1洗脫液。(14)蓋上管蓋并高速渦旋振蕩2秒鐘。65°C溫育5分鐘。(15)取出溫育的管子，高速渦旋振蕩2秒鐘。立即放到磁分離架上。(16)將DNA溶液小心地轉移到選定的容器中。實施例2 陽性標準品的準備1載體的準備TA克隆載體pMD18-T購自TAKARA公司。2插入片段的準備使用PCR方法制備插入片段，PCR的模板為經實施例1提取的樣本基因組DNA，反應體系與擴增條件如下表(表1、表2、表3)表1 =PCR 反應體系(50 μ 1)
權利要求
1.一種聚合酶鏈式反應引物，其在適宜的PCR條件與HER2基因或ACTB基因發生反應。
2.如權利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物由上游引物與下游引物組成。
3.如權利要求1或2所述的引物，其特征在于，所述引物的序列為SEQID N0:3、SEQ ID NO :4, SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQID N0:8、SEQ ID NO :9 或 SEQ ID NO :10o
4.一種熒光定量PCR探針，其在適宜的PCR條件下與HER2基因或ACTB基因堿基序列特異性結合。
5.如權利要求4所述的探針，其特征在于，所述探針5’端連接有熒光發光基團，3’端連接有熒光淬滅基團。
6.如權利要求4或5所述的探針，其特征在于，所述探針的序列為SEQID NO=IUSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO: 14。
7.一種質粒，該質粒包含待檢測的HER2基因或ACTB基因序列。
8.如權利要求7所述的質粒，其特征在于，所述質粒包含的HER2基因序列為SEQID NO 15，ACTB 基因序列為 SEQ ID NO :16。
9.一種HER2基因擴增的定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括選自以下的試劑如權利要求1-3任一項所述的引物、權利要求4或5所述的探針、以及權利要求7或8 所述的質粒。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，引物與探針的比例為2 1-10 1，正向與反向引物之間的比例為1 3-3 1。
全文摘要
本發明涉及用于定量檢測HER2擴增的試劑盒。具體地說，本發明涉及與分子靶向抗癌藥物療效相關的HER2基因擴增檢測方法及檢測試劑盒。尤其涉及熒光定量PCR檢測方法、試劑盒及其應用。本發明對HER2基因擴增進行檢測，并可對分子靶向抗腫瘤藥曲妥珠單抗進行療效預測，進而對腫瘤患者的臨床個體化用藥方案提供指導。
文檔編號C12N15/11GK102373197SQ20101025540
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月18日 優先權日2010年8月18日
發明者李雋 , 莫敏俐, 許軍普, 陳釗 申請人:北京雅康博生物科技有限公司