專利名稱：一種酶法合成Gal-sorbitol的方法
一種酶法合成Ga卜sorbitol的方法技術路線本發明涉及一種Gal-Sorbitol的酶法制備方法，具體地說是一種利用β -D-半乳 糖苷酶催化乳糖和山梨糖醇合成Gal-Sorbitol的方法。
背景技術：
低聚糖(Oligosaccharides)是指由2 10個單糖組成的糖類，廣泛存在于各種 天然食物中。其中，功能性低聚糖具有某些獨特的生理活性，包括低甜度、低熱量，難以被 人體消化吸收，食用后基本不增加血糖、血脂并能防止齲齒發生。糖醇是一種多元醇，一般 具有與功能性低聚糖類似的生理功能和物理特性。一般來說糖醇含有兩個以上的羥基，可 以由來源廣泛的、相應的糖來制取，即將糖分子上的醛基或酮基還原成羥基而成糖醇。國外 把糖醇作為食糖替代品，廣泛應用于食品工業，添加糖醇的甜食品稱為無糖食品。糖醇因不 被口腔中微生物利用，又不使口腔PH降低，反而會上升，所以不腐蝕牙齒，是防齲齒的好材 料，糖醇對人體血糖值上升無影響且能為糖尿病人提供一定熱量，所以可作為糖尿病人提 供熱量的營養性甜味劑。對于糖醇的合成，工業上采用的是傳統的化學方法。化學法合成需要在高溫、高壓 的環境下進行，造成其在基本建設投資及操作費用上花費較高，同時高壓氫氣易燃易爆容 易造成安全隱患，再加上用鎳作為催化劑在產品安全性方面也存在一定的問題，并且還會 造成嚴重的環境污染，總體來說化學方法的工業化生產糖醇存在諸多的不足之處。近年來，一些科學們嘗試采用酶法合成一些雙糖醇。Klewicki (2000年)利用 脆壁克魯維酵母的0-0-半乳糖苷酶的水解和轉糖苷基作用合成了631-吐7讓1~^01、 Gal-xylitol 等。乳糖醇是一種雙糖醇，具有比乳糖穩定，味覺和特性接近于砂糖等性質，其代謝與 胰島素無關，不增加血糖濃度，可供糖尿病人食用；同時，乳糖醇能促進人體腸道有益菌增 殖，具有低能量、低致齲齒性等特點。目前，在食品和醫藥領域已經得到廣泛的應用。作為 乳糖醇的同分異構體Gal-Sorbitol也應該存在潛在的生理功能和應用，但國際上對其相 關研究很少。

發明內容
本發明的目的是采用利用β-D-半乳糖苷酶催化乳糖和山梨糖醇合成 Gal-Sorbitol ο本發明的技術方案包括利用β -D-半乳糖苷酶來催化合成反應，通過HPLC法檢測 各種反應產物。HPLC法無法確定的產物通過進一步的分離純化后，進行1H-NMK13C-NMR和 ESI-TOF-MS分析確定其結構組成。本發明專利以乳糖和山梨糖醇作為底物，由β-D-半乳糖苷酶來催化合成反應， 得到乳糖醇的同分異構體——Gal-β-(1 — 3) sorbitol。


圖1為β -D-半乳糖苷酶催化合成Gal-Sorbitol的酶反應液中糖類組成的典型 HPLC圖譜圖2 為 Gal-Sorbitol 的質譜 3 為 Gal-Sorbitol 的 1H-NMR 圖譜圖 4 為 Gal-Sorbitol 的 13C-NMR 圖譜
具體實施例方式1、酶法合成反應稱取0. 4g乳糖和0. 2g山梨糖醇置于螺口瓶中，再加入一定量蒸餾水后進行高壓 處理(12rC，20min)，使其完全溶解得到過飽和溶液，自然冷卻至反應溫度40°C。然后加入 適量的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(PH6.0)和蒸餾水調整溶液濃度至40% (w/v) 0稱取一定量 的半乳糖苷酶(3U/mL)加入上述體系并置于40°C水浴中開始反應，然后每隔一定時間 取樣，沸水浴IOmin使酶滅活。用純凈水稀釋一定倍數以后，進行HPLC分析。2、反應產物的測定方法采用HPLC外標法測定產物的含量。(1)糖標準溶液的制備。準確稱取Gal-Sorbitol (經純化得到)的標準樣品，用 水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同濃度梯度的標準溶液，經0. 45 μ m濾膜過濾 后，按濃度從低到高的順序進HPLC檢測，記錄各個濃度對應的峰面積，以各個濃度及其對 應峰面積作圖，得到各個糖的標準曲線。(2)色譜條件。色譜柱Sugar-D (4. 6X 250mm，5 μ m，Nacalai Tesque Inc.，日本)； 柱溫:40°C ；流動相乙腈水=75 25 (ν/ν)；流速1. OmL/min ；進樣量:20μ L。(3)根據糖標樣的標準曲線，計算各種糖含量。3、反應產物Gal-sorbitol的純化與結構鑒定經HPLC分析，Gal-Sorbitol是合成反應的主要產物，由于這是一種新型合成的 物質，無法確定其結構組成。因此對Gal-Sorbitol進行分離純化，純化得到的樣品進行 1H-NMR, 13C-NMR和ESI-TOF-MS分析確定其結構組成。反應進行到4h以后，沸水浴IOmin中止反應。反應液加適量的去離子水稀釋后， 經0.45 μ m濾膜過濾，濾液過活性炭-硅藻土(1 1, w/w)中壓層析柱。層析柱用一系列 線性濃度梯度(0% 40%)的乙醇進行洗脫，洗脫液經苯酚硫酸法初步檢測后，收集其中 含糖的洗脫液，進一步通過HPLC檢測各峰洗脫液中的糖組分。收集Gal-Sorbitol組分，合 并、濃縮、干燥。純化得到的Gal-Sorbitol樣品進行1H-NMRj3C-NMR和ESI-TOF-MS分析， 1H-NMK13C-NMR分析時以D2O為溶劑，四甲基硅烷為內標。
權利要求
一種新型的合成Gal Sorbitol的方法，其特征是利用乳糖和山梨糖醇為底物，在β D 半乳糖苷酶的催化下合成Gal Sorbitol，并分離純化產物Gal Sorbitol。
2.根據權利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于底物的濃度為40%， 而且底物乳糖和山梨糖醇的起始濃度比為1 1。
3.根據權利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于利用β-D-半乳糖苷 酶制備Gal-Sorbitol時，適宜的反應條件為反應溫度40°C，ρΗ為6. 0，酶量為3U/mL，反應 時間為4小時。
4.根據權利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于產物Gal-Sorbitol 的分離純化方法為反應液經沸水浴滅活IOmin后，加適量的去離子水稀釋，經0. 45 μ m 濾膜過濾，濾液過活性炭-硅藻土(1 l，w/V)中壓層析柱。層析柱用一系列線性濃 度梯度(0% 40%)的乙醇進行洗脫，洗脫液經苯酚硫酸法與HPLC法檢測后，收集含 Gal-Sorbitol的洗脫液，并濃縮、干燥，得到白色粉末狀的Gal-Sorbitol。
5.根據權利要求1所述的合成Gal-Sorbitol的方法，其特征在于產物Gal-Sorbitol 的結構鑒定方法為純化得到的Gal-Sorbitol樣品進行1H-NMRj3C-NMR和ESI-TOF-MS分 析。
全文摘要
本發明專利是一種酶法制備Gal-Sorbitol的方法。對于糖醇的合成，工業上采用的是傳統的化學方法。需要在高溫、高壓的環境下進行，造成其在基本建設投資及操作費用上花費較高，同時高壓氫氣易燃易爆容易造成安全隱患，其催化劑在產品安全性方面也存在一定的問題，并且還會造成嚴重的環境污染。本發明以乳糖和山梨糖醇作為底物，由來源于環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或青霉(Penicillium chrysogenum)等的β-D-半乳糖苷酶作為催化劑，通過催化合成、柱層析制備得到乳糖醇的同分異構體——Gal-β-(1→3)Sorbitol。體外發酵實驗表明Gal-Sorbitol具有益生作用。
文檔編號C12P19/14GK101979637SQ201010286820
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月20日 優先權日2010年9月20日
發明者葉紅, 唐淑芬, 孫怡, 曾曉雄, 李偉 申請人:南京農業大學