專利名稱：使人的體細胞逆向分化產生自體生殖干細胞的方法、試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及領域屬于生物醫學技術領域，具體而言，本發明涉及一種使人的體細胞逆向分化產生自體生殖干細胞的細胞培養方法及其應用。
背景技術：
在哺乳動物中，生殖腺里的生殖干細胞來源于一種從胚胎傳留下來的數量稀少的原始生殖干細胞。胚胎形成及卵巢或睪丸形成的過程中，原始生殖干細胞就只定居卵巢或睪丸。在卵巢或睪丸分化、發育和形成成熟的卵泡及卵子或精子是一個消耗過程。女性一生中，經過400至500次卵泡發育成熟、排卵和月經形成后，卵巢的生殖干細胞原卵細胞就會枯竭，卵巢中就不再有原卵細胞和卵泡細胞，雌激素的主要來源也同時發生枯竭；卵巢萎縮變小，卵巢就衰老了。多數情況下，男性65歲開始睪丸的原始生殖干細胞也會逐漸枯竭。衰老枯竭的卵巢或睪丸使男女性不可避免地走向機體整體衰老的階段，并且，影響男女性的壽命。自然的生殖干細胞不僅能分化形成包括精子和卵子在內的配子，具有生殖功能， 還是一種能夠分化形成多種細胞和組織的多能干細胞，具有再生性修復功能；而且，生殖干細胞還具有一定程度的增殖和傳代能力，是唯一的能夠復制和傳遞遺傳信息的干細胞。所以，自體生殖干細胞在生殖系統的疾病和損傷的治療領域，在男女性不孕不育的修復治療應用領域，在抗衰老保健和延長壽命的應用領域以及建立自體生殖干細胞庫的領域都有著十分重要的價值和意義。現在國際上主要采用兩種方法制備生殖干細胞。一種方法是通過自然的胚胎干細胞體外分化形成異體生殖細胞，應用于研究領域；第二種方法是從睪丸或卵巢分離培養制備自體生殖干細胞，應用不孕不育的治療領域，分離培養耗時困難，生殖細胞來源困難，獲取數量極其稀少。體細胞是干細胞順向分化產生的，具有某些具體功能的子代細胞。體細胞的染色體DNA和干細胞的染色體DNA在基因結構和基因的數量上并不存在差異。體細胞和干細胞之間的最主要的差別可能只是某些功能基因處于不同的活性表達狀態。功能基因表達的差異決定了細胞的具體功能和形態的差異。我們推測，干細胞向體細胞順向分化的程序啟動后，干細胞本身的干細胞特性決定基因的開關就被關閉，隨后，干細胞就分化形成了具有某種特定功能的體細胞；換句話說，在體細胞染色體DNA序列中仍然存在生殖干細胞特性決定基因，例如0ct4、Nanog, C_kit、Dazl和Mvh基因等，這些基因只是處于關閉或靜止狀態。利用某些物質打開體細胞DNA序列中的生殖干細胞特性決定基因0ct4、NanOg、C-kit、 Dazl和Mvh等基因開關，這些體細胞就可能重新逆向分化而形成新的自體生殖干細胞。在本項發明中，從血液單個核細胞等人的體細胞逆向分化，迅速產生百億數量級別的自體生殖干細胞，不僅為疾病的潛在治療和抗衰老保健提供了一種新的獨特的多能干細胞，而且也為每一個不同年齡的人提供了建立自體生殖干細胞庫，永久保存具有獨特遺傳信息的自體生殖細胞的潛在可能性。

發明內容
本發明所要解的技術問題是研發一種新的人的體細胞逆向分化產生自體生殖干細胞的干細胞生產調控技術，在不改變人的體細胞染色體DNA序列，不插入任何外來基因或DNA片段的情況下，應用含有某些植物提取物和蛋白的一系列配方，在體外重新激活體細胞DNA序列中的生殖干細胞特性決定基因開關，使這些體細胞重新逆向分化而形成新的生殖干細胞；另外，經冰凍長期保存植物和蛋白誘導性人自體生殖干細胞，建立個人的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞庫。為了解決上述技術問題，本發明的一個目的是提供使人的體細胞逆向分化產生自體生殖干細胞的方法。本發明的另一個目的是提供采用該方法產生的自體生殖干細胞以及其在制備治療多種疾病的藥物中的應用。本發明的再一個目的是提供在上述方法中所采用的含有植物提取物和蛋白的多種細胞培養液以及該培養液的應用。此外，本發明還提供相應的用于制備自體生殖干細胞的試劑盒。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一方面，本發明提供一種使人的體細胞逆向分化產生自體生殖干細胞的方法，其中，所述方法包括將人的體細胞在細胞培養液Bl中培養2-3天，所述細胞培養液Bl為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物5_100mg/ml、Υ-276321-25 μ Μ、干細胞因子(Stem cell factor) 1-lOOng/ml、白細胞介素 3 (IL-3) 1-lOOng/ml、白細胞介素 6(IL-6) 1-lOOng/ml ；然后換用細胞培養液B2培養6_9天，所述細胞培養液B2為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5_100mg/ ml、促紅細胞生成素(EPO) Ι-lOOng/ml、干細胞因子Ι-lOOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子 (bFGF) l-100ng/ml、Υ-276321-25 μ Μ、白細胞介素 3 l-100ng/ml、白細胞介素 61-100ng/ ml、白細胞介素11 (IL-11) l-100ng/ml，從而獲得植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞。優選地，在5% CO2和37°C條件下進行細胞培養。在上述方法中，所述人的體細胞包括但不限于人的皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞。優選地，在將人的體細胞以細胞培養液Bl培養之前，先以2-5X IO6的密度，在5% CO2和37°C條件下培養M-48小時。優選地，先將細胞在細胞培養液Bl中培養3天，所述細胞培養液Bl為含有淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、干細胞因子10ng/ml、白細胞介素3 10ng/ml、白細胞介素6 10ng/ml的RPMI1640 ；然后換用細胞培養液B2培養6-8天，所述細胞培養液B2為含有淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、促紅細胞生成素10ng/ml、干細胞因子10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子10ng/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細胞介素3 10ng/ml、白細胞介素6 10ng/ml、白細胞介素11 10ng/ml的RPMI 1640，從而獲得植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞。上述方法還包括采用細胞培養液B3對獲得的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞進行擴增和傳代，所述細胞培養液B3為RPMI 1640，并含有鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、激活素A(Activin A) l-lOOng/ml、膠質細胞源性神經營養因子 (⑶NF) l-100ng/ml、促紅細胞生成素(EPO) l-100ng/ml、干細胞因子l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子Ι-lOOng/ml、白細胞介素3 l-lOOng/ml、白細胞介素61-lOOng/ml、白細胞介素 lll-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml ；優選地，當培養植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞至100%密度后，1 3稀釋傳代，繼續用細胞培養液B3培養。優選地，所述細胞的擴增傳代在5% CO2和37°C條件下進行。優選地，采用細胞培養液B3為含有鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、激活素A lOng/ml、膠質細胞源性神經營養因子lOng/ml、促紅細胞生成素lOng/ml、干細胞因子lOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子lOng/ml、白細胞介素3 lOng/ml、白細胞介素6 10ng/ml、白細胞介素 11 10ng/ml、胰島素 10ng/ml 的 RPMI 1640。所述方法還包括冷凍保存使體細胞逆向分化產生的自體生殖干細胞的步驟；優選地，所述冷凍保存方法為將產生的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞以IxIOltVml的細胞密度與10%二甲基亞砜和10%低分子右旋糖酐濃度混合，降溫至-80°C，然后轉移到_186°C液氮中深低溫保存。另一方面，本發明提供由上述方法制備的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞。本發明還提供所述的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞的應用，優選地，本發明提供該自體生殖干細胞在制備用于治療男女性不孕不育的藥物和用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病藥物中的應用；優選地，所述疾病為卵巢衰竭；優選地，本發明提供該自體生殖干細胞在建立自體生殖干細胞庫中的應用。又一方面，本發明提供用于使人的體細胞逆向分化的培養液，所述培養液選自細胞培養液Bi、B2和B3，所述細胞培養液Bl為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物 5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg/ml、Υ-276321-25μΜ、干細胞因子 Ι-lOOng/ml、白細胞介素3 l-100ng/ml、白細胞介素6 Ι-lOOng/ml ；所述細胞培養液B2為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、促紅細胞生成素l-lOOng/ml、干細胞因子l-lOOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子I-IOOng/ ml、Υ-276321-25μΜ、白細胞介素31-100ng/ml、白細胞介素61-100ng/ml、白細胞介素 lll-100ng/ml ；所述細胞培養液B3為RPMI 1640，并含有鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、激活素A l-lOOng/ml、膠質細胞源性神經營養因子l-lOOng/ml、促紅細胞生成素l-lOOng/ml、干細胞因子l-lOOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子l-lOOng/ml、白細胞介素31-100ng/ml、白細胞介素6 Ι-lOOng/ml、白細胞介素11 Ι-lOOng/ml、胰島素 l-100ng/ml。此外，本發明提供所述細胞培養液Bl和B2在培養人的體細胞使之逆向分化產生自體生殖干細胞中的應用。本發明還提供所述細胞培養液B3在自體生殖干細胞擴增和傳代中的應用。再一方面，本發明提供一種用于制備自體生殖干細胞的試劑盒，其中所述試劑盒包括細胞培養液Bl和B2 ；優選地，所述試劑盒進一步包括人的體細胞；所述體細胞包括但不限于人的皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞。
優選地，所述試劑盒進一步包括細胞培養液B3。本發明還提供所述試劑盒在制備自體生殖干細胞和用于治療男女性不孕不育的藥物和用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病藥物中的應用；優選地，所述疾病為卵巢衰竭。本發明還提供所述試劑盒在建立植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞庫的應用。以下是本發明的詳細描述為完成本發明涉及到以下技術問題(1)選用什么樣的人的體細胞作為逆向分化生產植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞的原料細胞；(2)怎樣處理和培養各種原料細胞；(3)怎樣使原料細胞逆向分化生產植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞；(4)怎樣擴增傳代植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞；(5)怎樣檢測生產的人自體生殖干細胞；(6)怎樣冰凍長期保存植物和蛋白誘導性人自體生殖干細胞；(7)怎樣建立植物和蛋白誘導性人自體生殖干細胞庫的系統過程以及方法。因此，本發明的發明目的可以通過下述方法得以實現選用的人的原料體細胞可以是A.臍帶血，B.胎盤，C.細胞專業公司商品化提供的非永生化人的各種體細胞株，D.細胞專業公司商品化提供的永生化人的各種體細胞株， E.常規血庫保存的血液和白細胞懸液，F.新鮮分離制備的人的皮膚細胞、血液有核細胞、 脂肪細胞等等；G.因手術切除而廢棄的部分健康組織器官，如腦、肌肉、肝、脾、腎、骨、和脂肪組織等。選用的人的原料體細胞可以是人的皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞、臍帶血細胞、胎盤細胞。選用的原料體細胞的培養包括以2-5 X IO6的密度，用DMEM等相應的細胞培養液在5% (X)2和37°C條件下培養M-48小時。使原料細胞逆向分化生產人自體生殖干細胞包括將相應的原料體細胞用DMEM 等相應的細胞培養液在5%0)2和371條件下培養M-48小時后，換用細胞培養液B1(RPMI 1640、淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、Y_2763210 μ Μ、干細胞因子10ng/ml、白細胞介素310ng/ml、白細胞介素610ng/ml)繼續在5% CO2和37°C條件下培養2-3天，然后換用細胞培養液B2 (RPMI 1640、淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物 50mg/ml、促紅細胞生成素lOng/ml、干細胞因子lOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子IOng/ ml、Y-27632 10 μ Μ、白細胞介素3 10ng/ml、白細胞介素6 10ng/ml、白細胞介素11 IOng/ ml)繼續在5% CO2和37°C條件下培養6_9天。產生的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞可以采用以下步驟擴增和傳代用細胞培養液B3 (RPMI 1640、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、激活素A 10ng/ml、膠質細胞源性神經營養因子lOng/ml、促紅細胞生成素lOng/ml、干細胞因子lOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子10ng/ml、白細胞介素3 lOng/ml、白細胞介素6 lOng/ml、白細胞介素11 10ng/ml、胰島素lOng/ml)繼續在5% CO2和37°C條件下培養植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞至100%密度后，1 3稀釋傳代，繼續用細胞培養液B3培養；根據本發明的一個實施方案，所獲得的人自體生殖干細胞可以通過以下方法進行
7檢測利用生殖干細胞的特異細胞表型0ct4、Nanog, C_kit、Dazl和Mvh等作為檢測指標， 分別采用流式細胞儀、細胞免疫熒光技術和Westernblot蛋白印跡技術檢測生殖干細胞的生成速度、生成率、生成數量和純度(0ct4、Nanog, C_kit、Dazl和Mvh等作為檢測指標及檢測方法參考王毓斌、陳斌，胚胎干細胞體外分化為生殖細胞的研究進展，生殖與避孕，第 28 卷第 9 期；Lacham-Kaplan 0，Chy H，Trounson A(2006)Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells 24 :266-273 ； Jinlian Hua, Kuldip Sidhu (2008). Recent Advances in the Derivation of Germ Cells from the Embryonic Stem Cells. Stem cells and development 17:399-411)。根據本發明的另一個實施方案，所產生的植物和蛋白誘導性人自體生殖干細胞經冰凍長期保存吹打懸浮貼壁生長的植物和蛋白誘導性生殖干細胞并收集到50ml毫升的離心管內，在離心機內以1500rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。制備的植物和蛋白誘導性生殖干細胞以IXlOicVml和DMSO混合，以10%二甲基亞砜和10%低分子右旋糖酐濃度混合，降溫至_80°C，然后轉移到-186°C液氮中深低溫保存。本發明的技術方法可應用于男女性不孕不育癥的治療，并適用于自體干細胞的抗衰老保健，利用巨額數量的自體生殖干細胞再生性修復全身各組織器官的衰老變性，尤其是衰竭卵巢的再造，可以恢復組織器官的年青結構及生理功能，抗衰老及延年益壽。所產生的自體生殖干細胞的體外誘導分化在避孕藥開發、人口調控、瀕危物種的保存、動物育種和轉基因動物生產方面都有重大作用。與現有技術相比，本發明至少具有以下幾個優點一、本發明不同于已有的利用基因重組技術誘導體細胞逆向分化產生干細胞(iP 干細胞)，提供了一種新的體細胞逆向分化，產生人自體生殖干細胞的生產調控技術，利用植物提取物和蛋白配方技術誘導體細胞逆向分化產生的干細胞(Plants and Proteins induced pluripotent stem cell, PPiPS干細胞)，使得細胞結果接近于自然干細胞，安全性高。具體而言，本發明通過采用人的常規的體細胞，在不改變體細胞染色體DNA序列，不插入任何外來基因或DNA片段的情況下，應用經過篩選優化設計的植物提取物和蛋白配方使體細胞重新逆向分化而形成自體生殖干細胞，為解決不孕不育治療領域目前所存在的困難提供了新的思路和途徑，克服了從睪丸或卵巢分離制備自體生殖干細胞中分離培養耗時困難、生殖細胞來源困難、獲取數量極其稀少的缺陷。二、本發明的方法可以直接采用來自患者的體細胞，使該體細胞逆向分化產生自體生殖干細胞，應用此自體生殖干細胞避免了采用異體/異種干細胞移植帶來的免疫排斥，為臨床應用提供了顯著的便利條件。三、采用本發明的方法制備的生殖干細胞具有正常2倍體的染色體核型；在兩組裸鼠移植試驗中，裸鼠皮下移植注射1 X IO8個植物和蛋白誘導性生殖干細胞或1 X IO8個人自然胚胎干細胞，觀察接種部位有否腫瘤形成，連續觀察90天后，發現采用植物和蛋白誘導性生殖干細胞的試驗組10只裸鼠無一例產生腫瘤，人胚胎干細胞試驗組10只裸鼠全部產生腫瘤，因此本發明的植物和蛋白誘導性生殖干細胞具有較高的安全性。本發明還是一種可以在任何年齡的人個體中生產生殖干細胞的新技術方法。四、已證明采用本發明的方法可以使200ml人周圍血液在2周內產生幾百億數量級別的第1代自體/異體生殖干細胞，生產速度快，產量巨大，純度達到15-50%，可以在任何年齡階段的人個體中，短期內迅速生產巨額數量的自體生殖干細胞。利用生殖干細胞的特異表型作為檢測指標，各種植物和蛋白誘導性人自體干細胞的生產工藝流程可以被嚴格地、多次地、系統地進行流式細胞技術和免疫細胞化學技術檢測，因此，作為自體種子細胞和再生修復細胞，在再生醫學、自體組織器官工程和自體生殖干細胞生產的產業化領域， 植物和蛋白誘導性人自體生殖干細胞可能具有良好的潛在應用前景，還具有大規模工業化和產業化生產自體生殖干細胞的可能性。五、本發明的方法還適用于建立自體生殖干細胞庫，長期永久保存自體生殖干細胞及個人獨特的遺傳信息，是一種可以在任何年齡的人個體中建立自體生殖干細胞庫的新技術方法。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施例，其中圖1中，I-A為血液單個核細胞PBMC(周圍血單個核細胞，即原料細胞)；1_B為植物和蛋白誘導性生殖干細胞 PPiPGC(Plants and Proteins induced primordial germ cell)0圖2為應用細胞免疫熒光化學技術檢測植物和蛋白誘導性生殖干細胞的Nanog、 oct4、Klf4和S0X2特異表型。圖3為應用Western blot蛋白印跡技術檢測植物和蛋白誘導性生殖干細胞的 Nanog、oct4、Klf4和S0X2特異表型，PBMC為周圍血單個核細胞(原料細胞)。圖4為應用流式細胞儀技術檢測植物和蛋白誘導性生殖干細胞的c-kit、 Daz 1、Mvh和Fragi 1 i s特異表型。PPiPGC_P2為第2代植物和蛋白誘導性生殖干細胞 PPiPGC(Plants and Proteins induced primordial germ cell)。圖5中，圖5-A為第3代植物和蛋白誘導性生殖干細胞；5_B為第6代植物和蛋白誘導性生殖干細胞。
具體實施例方式通過下面的詳述，將對本發明的操作方法及特點和優點作進一步說明，當然，應該指出的是盡管本文描述的以下幾種實施例，人們也可以根據本發明的基礎，提出各種變化和個性的形式也是可能的。實施例中采用的培養液為細胞培養液Bl=RPMI 1640，含淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、 Y-27632 1(^] 、干細胞因子101^/1111、白細胞介素3 10ng/ml、白細胞介素6 10ng/ml ；細胞培養液B2 =RPMI 1640,含淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、促紅細胞生成素lOng/ml、干細胞因子lOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子 10ng/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細胞介素3 10ng/ml、白細胞介素6 10ng/ml、白細胞介素11 10ng/ml ；細胞培養液B3 =RPMI 1640，含鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、激活素 A lOng/ml、膠質細胞源性神經營養因子lOng/ml、促紅細胞生成素lOng/ml、干細胞因子10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子lOng/ml、白細胞介素3 lOng/ml、白細胞介素6 IOng/ ml、白細胞介素11 10ng/ml、胰島素10ng/ml。實施例中采用的試劑及其來源淫羊藿提取物、鹿茸提取物和水蛭提取物購自河南天然植物原料廠和鄭州荔諾生物科技有限公司；Y-27632購自Sigma公司；干細胞因子、白細胞介素3、白細胞介素6、白細胞介素11、促紅細胞生成素、堿性成纖維細胞生長因子、激活素A、膠質細胞源性營養因子、 胰島素購自R&D公司。實施例采用周圍靜脈血、臍帶血作為原料細胞，牛產和長期保存棺物和蛋白誘導件牛殖干細胞周圍靜脈血和臍帶血(北京五洲女子醫院、北京安定門醫院、科研人員捐獻等)的無菌采集。采集周圍靜脈血/臍帶血前應征得供血本人或直系親屬的同意，并記錄供血本人及家庭的遺傳和傳染病史以及醫院所有相關的病毒檢查結果。周圍靜脈血/臍帶血常規抗凝，4°C保存。在M小時之內送至干細胞制作生產中心。在中心需要再做相應的病毒檢測后，進入中心電腦登記程序，在記錄相應的條形碼編號后，血液標本進入無菌干細胞生產車間。在干細胞生產車間，血液標示應用Ficoll標準分離技術(《現代免疫學實驗技術》 第十二章第288頁)分離單個核細胞后，進行單個核細胞計數。應用DMEM培養液以2_5 X IO6 的密度，在5% CO2和37°C條件下培養M-48小時；換用細胞培養液Bl繼續在5% CO2和 37°C條件下培養72小時，然后換用細胞培養液B2繼續在5% C02和37°C條件下培養9_15天。對生產的人自體生殖干細胞進行了檢測利用生殖干細胞的特異細胞表型 Nanog、0ct4、Klf4、S0X2、c-kit、Dazl、Mvh和Fragilis等作為檢測指標，在換用細胞培養液 B2繼續培養后的第6、第9和第12天，分別采用流式細胞儀、細胞免疫熒光技術和Western blot蛋白印跡技術(《現代免疫學實驗技術》第六章、第七章、第十八章)檢測生殖干細胞的生成速度、生成率、生成數量和純度。結果發現，200ml周圍靜脈血/80ml臍帶血的單個核細胞在細胞培養液B2培養后的第6-9天，植物和蛋白誘導性生殖干細胞的產量可達 1-2. 5X1011 (其它實驗結果請見附圖1-4)。顯微鏡顯示原料細胞和誘導原料細胞所產生的自體生殖干細胞的細胞形態，分別如圖IA和IB所示。圖2中示出了應用細胞免疫熒光化學技術檢測生產的誘導性生殖干細胞的0ct4和Nanog特異表型。應用flfestern blot蛋白印跡技術檢測植物和蛋白誘導性生殖干細胞(PPiPGC)的0ct4、NanOg、Klf4和S0X2特異表型，并且以原料細胞(周圍血單個核細胞，PBMC)作為對照。由電泳結果可見，PPiPGC干細胞0ct4、Nanog、Klf4和S0X2特異表型陽性，而PBMC原料細胞0ct4、Nanog, Klf4和S0X2特異表型陰性。圖4為應用流式細胞儀技術檢測生產的誘導性生殖干細胞的c-kit、Dazl、Mvh和Fragilis特異表型的結果。 如圖所示，用B2培養液培養第6天，c-kit、Dazl.Mvh和Fragilis特異表型的生成速度分別為 6. 87%,28. 14%,37. 13%和 16. 75%。對產生的植物和蛋白誘導性人自體生殖干細胞進行擴增傳代。用細胞培養液 B3 (Medium)繼續在5% CO2和37°C條件下培養植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞至100% 密度后，1 3稀釋傳代，繼續用細胞培養液B3培養。培養結果請參考圖5，其中圖5-A為
10第3代植物和蛋白誘導性生殖干細胞，圖5-B為第6代植物和蛋白誘導性生殖干細胞。所產生的植物和蛋白誘導性人自體生殖干細胞可以經冰凍長期保存。吹打懸浮貼壁生長的植物和蛋白誘導性生殖干細胞并收集到50ml毫升的離心管內，在離心機內以 1500rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。制備的植物和蛋白誘導性生殖干細胞以IXlOicVml和 DMSO混合，以10%二甲基亞砜和10%低分子右旋糖酐濃度混合，降溫至-80°C，然后轉移到-186°C液氮中深低溫保存，建立植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞庫。實施例2本實施例對實施例1中制備的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞進行裸鼠移植的安全性研究，具體如下。在兩組裸鼠移植試驗中，裸鼠皮下移植注射IX IO8個植物和蛋白誘導性的生殖干細胞或1 X IO8個人自然生殖干細胞(海南醫學院生殖中心贈送)，觀察接種部位有否腫瘤形成。連續觀察90天。結果顯示，植物和蛋白誘導性生殖干細胞試驗組10只裸鼠無一例產生腫瘤，具有較高的安全性；而人自然生殖干細胞試驗組10只裸鼠全部產生腫瘤。
權利要求
1.一種使人的體細胞逆向分化產生自體生殖干細胞的方法，其中，所述方法包括將人的體細胞在細胞培養液Bl中培養2-3天，所述細胞培養液Bl為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物5-100mg mg/ml、Y-27632 1-25 μ Μ、干細胞因子1-lOOng/ml、白細胞介素3 l-lOOng/ml、白細胞介素6 l-100ng/ml ；然后換用細胞培養液B2培養6-9天，所述細胞培養液B2為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、 鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、促紅細胞生成素1-lOOng/ml、干細胞因子l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子l-100ng/ml、Υ-27632 1_25μΜ、白細胞介素3 1-lOOng/ml、白細胞介素6 l-lOOng/ml、白細胞介素lll-lOOng/ml，從而獲得植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞；優選地，在5% CO2和37°C條件下進行細胞培養。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述人的體細胞包括但不限于人的臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞等；優選地，在人的體細胞以細胞培養液Bl培養之前，先以2-5X106的密度，在5% CO2和 37 °C條件下培養M-48小時；優選地，先將細胞在細胞培養液Bl中培養3天，所述細胞培養液Bl為含有淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、Y-27632 10 μ Μ、干細胞因子10ng/ml、白細胞介素3 10ng/ml、白細胞介素6 10ng/ml的RPMI1640 ；然后換用細胞培養液B2培養6-8天，所述細胞培養液B2為含有淫羊藿提取物50mg/ml、鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、促紅細胞生成素10ng/ml、干細胞因子10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子10ng/ml、Y-27632 10 μ Μ、白細胞介素3 10ng/ml、白細胞介素6 10ng/ml、白細胞介素11 10ng/ml的RPMI 1640，從而獲得植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述方法還包括采用細胞培養液B3對獲得的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞進行擴增和傳代，所述細胞培養液B3為RPMI 1640，并含有鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5_100mg/ml、激活素A l-lOOng/ml、膠質細胞源性神經營養因子1-lOOng/ml、促紅細胞生成素1-lOOng/ml、干細胞因子1-lOOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子1-lOOng/ml、白細胞介素3 l-lOOng/ml、白細胞介素6 1-lOOng/ml、白細胞介素 11 l-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml ；優選地，當培養植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞至100%密度后，1 3稀釋傳代，繼續用細胞培養液B3培養；優選地，所述細胞的擴增傳代在5% CO2和37°C條件下進行；優選地，所述細胞培養液B3為含有鹿茸提取物50mg/ml、水蛭提取物50mg/ml、激活素A lOng/ml、膠質細胞源性神經營養因子lOng/ml、促紅細胞生成素lOng/ml、干細胞因子 10ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子lOng/ml、白細胞介素3 lOng/ml、白細胞介素6 IOng/ ml、白細胞介素 11 10ng/ml、胰島素 10ng/ml 的 RPMI 1640。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括冷凍保存使體細胞逆向分化產生的自體生殖干細胞的步驟；優選地，所述冷凍保存步驟包括將產生的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞以 IXlO1Vml的細胞密度與10%二甲基亞砜和低分子右旋糖酐濃度混合，降溫至_80°C，然后轉移到-186°C液氮中深低溫保存。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法制備的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞。
6.如權利要求5所述的植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞在制備用于治療男女性不孕不育的藥物和用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病藥物中的應用；優選地，所述疾病為卵巢衰竭；優選地，所述自體生殖干細胞用于建立自體生殖干細胞庫。
7.用于使人的體細胞逆向分化的細胞培養液，其中，所述培養液選自細胞培養液Bi、 B2和B3，所述細胞培養液Bl為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5-100mg/ml、鹿茸提取物 5-100mg/ml、Υ-276321-25 μ Μ、干細胞因子 1-lOOng/ml、白細胞介素 3 Ι-lOOng/ml、白細胞介素6 l-100ng/ml ；所述細胞培養液B2為RPMI 1640，并含有淫羊藿提取物5_100mg/ ml、鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5_100mg/ml、促紅細胞生成素l-100ng/ml、干細胞因子l-100ng/ml、堿性成纖維細胞生長因子l-100ng/ml、Υ-276321-25 μ Μ、白細胞介素 3 1-lOOng/ml、白細胞介素6 l-lOOng/ml、白細胞介素11 l-lOOng/ml ；所述細胞培養液B3 為RPMI 1640，并含有鹿茸提取物5-100mg/ml、水蛭提取物5-100mg/ml、激活素A I-IOOng/ ml、膠質細胞源性神經營養因子1-lOOng/ml、促紅細胞生成素1-lOOng/ml、干細胞因子 1-lOOng/ml、堿性成纖維細胞生長因子1-lOOng/ml、白細胞介素31-lOOng/ml、白細胞介素 6 l-100ng/ml、白細胞介素 11 l-100ng/ml、胰島素 l-100ng/ml。
8.如權利要求7所述的細胞培養液Bl和B2在培養人的體細胞使之逆向分化產生自體生殖干細胞中的應用。
9.如權利要求7所述的細胞培養液B3在自體生殖干細胞擴增和傳代中的應用。
10.一種用于制備自體生殖干細胞的試劑盒，其中，所述試劑盒包括如權利要求7所述的細胞培養液Bl和B2 ；優選地，所述試劑盒進一步包括人的體細胞；所述體細胞包括但不限于人的臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞；優選地，所述試劑盒進一步包括細胞培養液B3。
11.如權利要求10所述的試劑盒在制備自體生殖干細胞和用于治療男女性不孕不育的藥物以及用于治療涉及器官再生再造和修復的疾病藥物中的應用；優選地，所述疾病為卵巢衰竭。
12.如權利要求10所述的試劑盒在建立植物和蛋白誘導性自體生殖干細胞庫的應用。
全文摘要
本發明提供了一種使人的體細胞逆向分化產生自體生殖干細胞的方法，所述方法包括采用含有不同植物提取物和蛋白成分的培養液分步驟培養人的體細胞，從而使所述體細胞逆向分化產生自體生殖干細胞。本發明的方法在2周內產生幾百億數量級別的第1代自體生殖干細胞。這種植物和蛋白誘導性人自體生殖干細胞具有與人自然生殖干細胞類似的細胞特異表型，并保持有相當強的擴增傳代能力。本發明適用于建立新型的自體生殖干細胞庫，長期永久保存自體生殖干細胞及個體遺傳信息，并在再生醫學的疾病治療和抗衰老保健、自體組織器官工程和自體生殖干細胞生產的產業化領域，本發明的植物和蛋白誘導性人自體生殖干細胞具有良好的潛在應用前景。
文檔編號C12N5/074GK102399739SQ201010288959
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月19日 優先權日2010年9月19日
發明者林雄斌 申請人:林雄斌