制備自體造血干細胞的方法、試劑盒、干細胞及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種制備自體造血干細胞的方法，該方法包括：將體細胞在細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-6天，收集生成的自體造血干細胞，其中，所述細胞培養(yǎng)液是RPMI1640培養(yǎng)液，其中含有1-100μM的Y-27632（C14H21N3O·2HCl）；1-100ng/mL的干細胞因子；1-100ng/mL的白細胞介素3；1-100ng/mL的白細胞介素6；1-100ng/mL的白細胞介素11；1-100ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）；1-100ng/mL的粒細胞集落刺激因子（G-CSF）；1-100μg/mL的巖藻多糖；1-100μg/mL的硫酸葡聚糖；1-100nM的AMD3100（1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11-四氮雜環(huán)十四烷）；1-100μM的M-阿侖膦酸鈉(Malendronate sodium trihydrate)；1-100μM的帕米膦酸二鈉。由此，本發(fā)明提供了一種制備自體造血干細胞的方法、試劑盒、干細胞及應用，并且本發(fā)明提供的蛋白誘導性自體造血干細胞的生產(chǎn)方法在產(chǎn)量、純度、生產(chǎn)速度及安全性方面具有顯著優(yōu)勢。
【專利說明】制備自體造血干細胞的方法、試劑盒、干細胞及應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，具體來說，涉及制備自體造血干細胞的方法、試劑盒、干細胞及應用。

【背景技術(shù)】
[0002]干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據(jù)干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞是一類具備無限自我更新和分化潛能的早期胚胎細胞，是當受精卵分裂發(fā)育成囊胚時內(nèi)層細胞圖案的細胞，其具有可以向各胚層范疇的細胞分化的能力。成體細胞是指存在于人和哺乳動物特定組織或器官中(包括骨髓、神經(jīng)、肌肉、表皮、睪丸或腎臟等)的具有修復和再生能力的干細胞，在特定條件下，成體干細胞產(chǎn)生新的干細胞或按一定的程序分化形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡，與胚胎干細胞不同的是，成體干細胞只可以向其定居的組織類型分化。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學界稱為“萬用細胞”。
[0003]幾十年來，造血干細胞在臨床上應用于血液系統(tǒng)疾病的治療，被證明是治療惡性血液疾病的有效方法。造血干細胞還被證明具有橫向分化能力，具有分化形成骨細胞、神經(jīng)細胞和心肌細胞等多種細胞的潛能。所以，自體造血干細胞還被廣泛應用于再生醫(yī)學和修復醫(yī)學領(lǐng)域的多種疾病的再生性修復治療。
[0004]由于異體或異種干細胞移植會不可避免地產(chǎn)生免疫排斥反應，自體干細胞已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學發(fā)展的最重要的領(lǐng)域之一。人和動物出生后，機體內(nèi)存留的造血干細胞數(shù)量極其稀少。因此，自體干細胞的來源困難和生產(chǎn)數(shù)量不足，一直是困擾著現(xiàn)代再生醫(yī)學和自體組織器官工程的進一步發(fā)展。如何獲得巨額數(shù)量的自體造血干細胞是當前國際干細胞疾病治療的一個重大技術(shù)瓶頸。
[0005]近年來，應用基因重組技術(shù)已經(jīng)證明，體細胞可以被重新編碼而逆向分化，產(chǎn)生被稱為誘導性自體多能干細胞(111(11106(1 ￠1111-11)01:6111: 8丨611111，1？3干細胞)，為自體干細胞的生產(chǎn)技術(shù)提供了新的途經(jīng)。因此，利用體細胞逆向分化產(chǎn)生自體多能干細胞已經(jīng)成為干細胞技術(shù)研發(fā)的熱點。
[0006]目前造血干細胞的來源可分為三類:骨髓造血干細胞，動員周圍血干細胞和臍帶血干細胞。骨髓造血干細胞和動員周圍血干細胞一般有核細胞數(shù)只達到5-10X107X8，0)34+細胞只達到1-5^1(^/? ；801111臍帶血干細胞數(shù)量更少，⑶34+細胞只達到1-5父106。研究顯示，在非血液病領(lǐng)域的疾病和創(chuàng)傷的修復治療中，造血干細胞的用量與組織器官疾病及損傷修復的效果大小成正相關(guān)。以上三種造血干細胞的數(shù)量，還遠遠滿足不了重大實質(zhì)性組織器官疾病，如心臟病、大腦神經(jīng)疾病和損傷、肝病、腎衰竭等等疾病的再生和修復治療的需要，其療效明顯不足。
[0007]因此，有必要研究和開發(fā)出新的造血干細胞來源。此外，如何獲得足夠數(shù)量、高安全性的自體造血干細胞，是一個有待研發(fā)的醫(yī)學生物學難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對現(xiàn)有技術(shù)中自體造血干細胞來源不足、可獲取的數(shù)量少、和安全性低的問題，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種制備自體造血干細胞的方法，該方法包括:
[0009]采集人或動物的體細胞。獲得的體細胞以5父106的密度接種于細胞培養(yǎng)皿中，換上細胞培養(yǎng)液。
[0010]優(yōu)選地，采集人或動物的周圍血液和/或骨髓液，應用常規(guī)？1(3011離心分離技術(shù)，離心、分離和獲取血液單個核細胞。獲得的單個核細胞以5X106的密度接種于細胞培養(yǎng)皿中，換上細胞培養(yǎng)液。
[0011]在制備自體造血干細胞的方法中，體細胞來源于人或動物的離體組織，包括血液、骨髓液、皮膚和脂肪中的一種或多種。
[0012]在制備自體造血干細胞的方法中，體細胞包括臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞和丨或脂肪細胞。
[0013]在371和5%的(?的環(huán)境中，將體細胞在細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-6天，所述培養(yǎng)液為1？？111640培養(yǎng)液。其中，培養(yǎng)液中含有:
[0014]1-100 9 1 的丫-27632.2此1),優(yōu)選值為 10 9 1 ；
[0015]1-100118加[的干細胞因子，優(yōu)選值為川叩/此；
[0016]1-10011^/1111的白細胞介素3，優(yōu)選值為川叩/此；
[0017]1-10011^/1111的白細胞介素6，優(yōu)選值為川叩/此；
[0018]1-10011^/1111的白細胞介素11，優(yōu)選值為川叩/此；
[0019]1-10011^/1111的巨噬細胞集落刺激因子(1-(:310,優(yōu)選值為川叩/此；
[0020]1-10011^/1111的粒細胞集落刺激因子優(yōu)選值為川叩/此；
[0021]1-100 9 的巖藻多糖，優(yōu)選值為10 9 ；
[0022]1-100 9 的硫酸葡聚糖，優(yōu)選值為10 ；
[0023]1-100=1 的艦03100 (1, 1, -[1, 4-亞苯基二(亞甲基)〕-二-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四燒)，優(yōu)選值為10118加1 ；
[0024]1-100 0 1 的 1-阿侖勝酸鈉80(1111111 1:1-1117(111^6)，優(yōu)選值為10111 ；
[0025]1-100 ^ I的帕米膦酸二鈉，優(yōu)選值為10 9 1。
[0026]輕輕吹打培養(yǎng)的細胞，使細胞完全懸浮后，收集細胞于離心管中，進行離心-生理鹽水懸浮的細胞清洗操作，重復3次后，用生理鹽水懸浮蛋白誘導性自體造血干細胞，得到自體造血干細胞。
[0027]將制備得到的自體造血干細胞冷凍保存，冷凍保存的方法為:將得到的自體造血干細胞以1 X 105個加1至1 X 106個加1的細胞密度與等體積的二甲基亞砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，將混合物降溫至-801，然后轉(zhuǎn)移到-1861的液氮中深低溫保存。
[0028]在上述方法中，優(yōu)選地，所使用的即11164培養(yǎng)液中含有:10^1的卜27632((^4?具0 -21101)510118/1111的干細胞因子；1011^此的白細胞介素3的白細胞介素6 ^10118/1111的白細胞介素11 ^10118/1111的巨噬細胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒細胞集落刺激因子9 8/此的巖藻多糖；10 9 8/此的硫酸葡聚糖；10111的艦03100(1, 1, -〔1，4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷)；10 9 1的(1-阿侖勝酸鈉)14611(11*011社6 80(1111111廿1117辦社一；10 4 1的帕米勝酸二鈉。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，還提供了一種用于制備自體造血干細胞的試劑盒。試劑盒包含一種細胞培養(yǎng)液(1^111640培養(yǎng)液),其中含有:
[0030]1-100 9 1 的 1-27632 (⑶⑶。.優(yōu)選值為 10 1 ；
[0031]1-10011^/1111的干細胞因子，優(yōu)選值為川叩/此；
[0032]1-10011^/1111的白細胞介素3，優(yōu)選值為川叩/此；
[0033]1-10011^/1111的白細胞介素6，優(yōu)選值為川叩/此；
[0034]1-10011^/1111的白細胞介素11，優(yōu)選值為川叩/此；
[0035]1-10011^/1111的巨噬細胞集落刺激因子(1-(:310,優(yōu)選值為川叩/此；
[0036]1-10011^/1111的粒細胞集落刺激因子優(yōu)選值為川叩/此；
[0037]1-100 9 的巖藻多糖，優(yōu)選值為10；
[0038]1-100 9 的硫酸葡聚糖，優(yōu)選值為10；
[0039]1-100=1 的艦03100 (1, 1, -[1, 4-亞苯基二(亞甲基)〕-二-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四燒)，優(yōu)選值為10118加1 ；
[0040]1-100 0 1 的 1-阿侖勝酸鈉80(1111111 1:1-1117(111^6)，優(yōu)選值為10111 ；
[0041]1-100^1的帕米膦酸二鈉，優(yōu)選值為10 9 1。
[0042]優(yōu)選地，上述試劑盒中的細胞培養(yǎng)液(1^111640培養(yǎng)液)含有:10^1的卜27632((^4?具0 -21101)510118/1111的干細胞因子；1011^此的白細胞介素3的白細胞介素6 ^10118/1111的白細胞介素11 ^10118/1111的巨噬細胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒細胞集落刺激因子0 8/此的巖藻多糖的硫酸葡聚糖；10111的艦03100(1, 1, -〔1，4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷)；10^1的1-阿侖勝酸鈉80(1111111 廿丨]!#!'社一)；10 4 1 的帕米勝酸二鈉。
[0043]在上述方法中，應用多種蛋白組成的細胞培養(yǎng)液，使人或小鼠的自體血液單個核細胞逆向分化，生產(chǎn)蛋白誘導性自體造血干細胞，我們稱之為:蛋白誘導性自體造血干細胞(^1-01:6111 111(11106(1 11611181:010^10 81:6111
[0044]根據(jù)本發(fā)明提供的方法可以制備自體造血干細胞。自體造血干細胞可以用于建立自體造血干細胞庫、制備抗衰老藥物或保健品以及制備涉及器官再生再造和修復的疾病的藥物。本發(fā)明提供的試劑盒可用于建立自體造血干細胞庫。
[0045]本發(fā)明提供了一種制備自體造血干細胞的方法、試劑盒、干細胞及應用，并且本發(fā)明提供的蛋白誘導性自體造血干細胞的生產(chǎn)方法在產(chǎn)量、純度、生產(chǎn)速度及安全性方面具有顯著優(yōu)勢。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1八至圖10是從人血液單個核細胞逆向分化生產(chǎn)的人自體造血干細胞的形態(tài)及0)34和0)133特異表型鑒定圖；
[0047]圖12至圖1?是從小鼠血液單個核細胞逆向分化生產(chǎn)的小鼠自體造血干細胞的形態(tài)及⑶34和⑶133特異表型鑒定圖；
[0048]圖1I至圖1？是小鼠血液單個核細胞、小鼠自體造血干細胞的⑶34和⑶133特異表型鑒定比較圖；
[0049]圖2八是從人血液單個核細胞(9180逆向分化生產(chǎn)的人自體造血干細胞的流式細胞儀測視圖；
[0050]圖28是從人血液單個核細胞(9180逆向分化生產(chǎn)的人自體造血干細胞的轉(zhuǎn)化率的曲線圖；
[0051]圖2(:是從小鼠血液單個核細胞(9180逆向分化生產(chǎn)的小鼠自體造血干細胞的轉(zhuǎn)化率的曲線圖；
[0052]圖3八是此化八裸鼠靜脈移植誘導性自體造血干細胞105天后的照片；
[0053]圖38是84 V。裸鼠靜脈移植816腫瘤細胞105天后的照片；
[0054]圖3(:是此化八裸鼠皮下移植+靜脈移植誘導性自體造血干細胞后105天的照片；
[0055]圖30是此化八裸鼠皮下移植816腫瘤細胞105天后的照片；
[0056]圖32是此化八裸鼠靜脈移植816腫瘤細胞21天后產(chǎn)生的肺腫瘤的解剖圖；
[0057]圖3？是各試驗組和對照組的腫瘤發(fā)生率柱狀圖。

【具體實施方式】
[0058]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0059]實施例1試劑盒的制備
[0060]在10-100級潔凈度的安全操作臺里操作，4-10度的低溫條件下配制。在50001的醫(yī)1640培養(yǎng)液中，分別加入:10 4 1的1-27632 (0141121^30.的干細胞因子的白細胞介素3 的白細胞介素6 的白細胞介素11:10^/1111的巨噬細胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒細胞集落刺激因子):10^/III[的巖藻多糖；10?/此的硫酸葡聚糖；10=1的艦03100 (1,1, -〔1，4-亞苯基二(亞甲基)〕-二 -1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四燒)；10 4 1 的 1-阿侖膦酸鈉(1511611(11*011511:6 80(1111111廿土七辦社一)；10 4 1的帕米膦酸二鈉。
[0061]充分混合，溶解，然后經(jīng)0.22微米孔徑的濾器過濾、消毒，配制成細胞培養(yǎng)液。
[0062]將細胞培養(yǎng)液置于試劑盒內(nèi)，從而制成用于制蛋白誘導性自體造血干細胞的試劑盒。
[0063]實施例2小鼠的蛋白誘導性自體造血干細胞的制備
[0064]選擇3-5月齡的此11^雄性小鼠(購買自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學院(天津),動物合格證號:30? (津)2010-0002),采集其所有血液，使用常規(guī)？化011離心分離技術(shù)對血液進行離心、分離從而獲取血液單個核細胞。將獲得的單個核細胞以5X10^個加1的密度，接種于細胞培養(yǎng)皿中，并向其中加入實施例1中配制的細胞培養(yǎng)液，在371和5%的(?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天從而獲得蛋白誘導性自體造血干細胞。輕輕吹打培養(yǎng)的細胞，使細胞完全懸浮后，收集細胞于離心管中，進行離心-生理鹽水懸浮的細胞清洗操作，重復3次后，用生理鹽水懸浮蛋白誘導性自體造血干細胞，得到蛋白誘導性自體造血干細胞。將得到的自體造血干細胞以1X10^個/01至1X10^個加1的細胞密度與等體積的二甲基亞砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，將混合物降溫至-801，然后轉(zhuǎn)移到-1861的液氮中深低溫保存。
[0065]實施例3人的蛋白誘導性自體造血干細胞的制備
[0066]采集人體的外周血液5001，使用常規(guī)離心分離技術(shù)對血液進行離心、分離從而獲取血液單個核細胞。將獲得的單個核細胞以〖X 106個加1的密度，接種于細胞培養(yǎng)皿中，并向其中加入實施例1中配制的細胞培養(yǎng)液，在371和5%的002的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天從而獲得蛋白誘導性自體造血干細胞。輕輕吹打培養(yǎng)的細胞，使細胞完全懸浮后，收集細胞于離心管中，進行離心-生理鹽水懸浮的細胞清洗操作，重復3次后，用生理鹽水懸浮蛋白誘導性自體造血干細胞，得到蛋白誘導性自體造血干細胞。將得到的蛋白誘導性自體造血干細胞以1父105個加1至1父106個加1的細胞密度與等體積的二甲基亞砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，將混合物降溫至-801，然后轉(zhuǎn)移到-1861的液氮中深低溫保存。
[0067]通過以下試驗對實施例2及實施例3制得的進行類型性鑒定及安全鑒定。
[0068]試驗1細胞特異表型鑒定
[0069]用已預先制得的聚-0-賴氨酸的載玻片，選擇實施例2和實施例3中制備的非睪丸源性蛋白誘導性雄性自體生殖干細胞的最佳的細胞懸浮液濃度，用細胞制片離心機在1800%？下轉(zhuǎn)動拋片2分鐘制成玻片并做好標記，拋片上細胞密度(細胞均勻，密度適當兄拋片晾干后存放于-20度冰箱中凍存。從-20度冰箱中取出細胞玻片在室溫晾干，在反面用記號筆劃定區(qū)域。然后將實施例2制備的蛋白誘導性自體造血干細胞生理鹽水懸浮液分別使用4%多聚甲醛(用？83配置，購自801^11^10公司，產(chǎn)品編號為？1010)固定，經(jīng)過0.2%11~ 1^011 ^-100打孔10分鐘以及磷酸鹽緩沖液(983)的清洗后，使用10%正常山羊血清在室溫的條件下封閉1小時，得到樣品。重復進行樣品制作步驟，使用實施例2中獲得的蛋白誘導性自體造血干細胞制得樣品八及樣品8，使用實施例3中獲得的蛋白誘導性自體造血干細胞制得樣品及樣品0。將第一抗體試劑兔抗鼠0)34加入樣品4中；將第一抗體試劑兔抗人⑶34加入樣品中；將第一抗體試劑兔抗鼠0)133加入樣品8中；將第一抗體試劑兔抗人0)133加入樣品0中。在41的條件下使四個樣品中的抗原分別與第一抗體反應12小時(或過夜然后在使用磷酸鹽緩沖液$83)清洗樣品后，將第二抗體分別加入到四個樣品中，第二抗體為使用？1扣標記的羊抗兔I姊(1:200 ；購買自⑶II公司，產(chǎn)品編號為八?1320。在室溫的條件下使四個樣品中的第一抗體分別與第二抗體反應1小時。然后，用0八?I (1:1000)進行染核，室溫條件下進行1分鐘。在使用磷酸鹽緩沖液？83清洗后，對樣品進行甘油封片操作，所使用封邊劑為甘油外83封片劑(甘油#83=1:9, 1)118.0-8.5，美工生物公司制造最后使用尼康熒光顯微鏡觀察拍照，在6-8小時內(nèi)完成各種拍照。
[0070]試驗結(jié)果見圖1八至圖1？，1八至圖1？示出了細胞特異表型鑒定圖，圖1八至圖10依次示出了從人血液單個核細胞逆向分化生產(chǎn)的人自體造血干細胞的形態(tài)及⑶34和0)133特異表型鑒定圖；圖12至圖1?依次示出了從小鼠血液單個核細胞逆向分化生產(chǎn)的小鼠自體造血干細胞的形態(tài)及⑶34和⑶133特異表型鑒定圖；圖1I至圖1？示出了小鼠血液單個核細胞、小鼠自體造血干細胞的⑶34和⑶133特異表型鑒定比較圖。
[0071]其中，圖1八和圖18示出了未轉(zhuǎn)化的人血液單個核細胞。
[0072]圖X示出了實施例3制得的細胞在與一抗(兔抗人⑶34)及二抗(”扣標記的羊抗兔1^)反應后，可以在熒光顯微鏡觀察到熒光部分(亮色區(qū)域),從而說明實施例3中所制得的細胞為人自體造血干細胞。
[0073]圖10示出了實施例3制得的細胞在與一抗(兔抗人⑶133)及二抗(”扣標記的羊抗兔1^)反應后，可以在熒光顯微鏡觀察到熒光部分(亮色區(qū)域),從而說明實施例3中所制得的細胞為人自體造血干細胞。
[0074]圖12和圖1示出了未轉(zhuǎn)化的小鼠血液單個核細胞。
[0075]圖％示出了實施例2制得的細胞在與一抗(兔抗人⑶34)及二抗(”扣標記的羊抗兔1^)反應后，可以在熒光顯微鏡觀察到熒光部分(亮色區(qū)域),從而說明實施例2中所制得的細胞為小鼠自體造血干細胞。
[0076]圖1?示出了實施例2制得的細胞在與一抗(兔抗人⑶133)及二抗(”扣標記的羊抗兔1^)反應后，可以在熒光顯微鏡觀察到熒光部分(亮色區(qū)域),從而說明實施例2中所制得的細胞為小鼠自體造血干細胞。
[0077]試驗2自體造血干細胞轉(zhuǎn)化率的測定
[0078]方法一:流式細胞儀測定自體造血干細胞的轉(zhuǎn)化率
[0079]試驗原理:使用熒光免疫技術(shù)來標記⑶34、⑶133陽性細胞，通過檢測標記的⑶34、⑶133陽性細胞來確定自體造血干細胞轉(zhuǎn)化率(生產(chǎn)率)。
[0080]試驗步驟:
[0081]1)解凍細胞:將實施例2及實施例3中制成并低溫保存的人血液單個核細胞(^810及人自體造血干細胞以及小鼠血液單個核細胞(9810及小鼠自體造血干細胞的4份樣品分別放入37度水浴鍋中解凍。
[0082]2)將人體和老鼠的？810、人體和老鼠的分別轉(zhuǎn)移到2？管中，在2500%？下常溫下離心5111111。
[0083]3)除去上清液，每管加入400 9 I的封閉液1%8^用？83稀釋)重懸浮細胞沉淀。
[0084]4)在 2500107 下常溫下離心 5111111。
[0085]5)除去上清液，每管加入50 4 I的封閉液，重懸浮細胞沉淀。
[0086]6)管中加入20 4 [的⑶34抗體試劑。混勻之后放在黑暗處孵育30111111，之后進行流式細胞儀(美國801—10分析，自動計算標本中的⑶34陽性細胞數(shù)量及百分比。
[0087]試驗結(jié)果見圖2八，如圖2八所示，圖2八是從人血液單個核細胞(9180逆向分化生產(chǎn)的人自體造血干細胞的流式細胞儀測視圖。通過流式細胞儀測定的自體造血干細胞的轉(zhuǎn)化率可達38%。
[0088]方法二:免疫熒光技術(shù)檢測⑶34、⑶133陽性細胞及計數(shù)
[0089]試驗步驟:1)按照實施例2的制備方法制備？細胞，不同之處在于，培養(yǎng)時間分別為1天、2天、3天、4天、5天。制備得到5組小鼠的？樣品。按照實施例3的制備方法制備？1即3細胞，不同之處在于，培養(yǎng)時間分別為1天、2天、3天、4天、5天。制備得到5組人的樣品.
[0090]2)然后按照試驗1的分組和方法進行細胞特異表型鑒定。在尼康熒光顯微鏡下，？110標記為綠色而0八？1標記為藍色，計算十個境下視野的⑶34、⑶133特異染色細胞的平均數(shù)除予十個境下視野的細胞核①八?〗上色)的平均數(shù)，等于陽性細胞百分比。
[0091]試驗結(jié)果
[0092]如圖28和圖2(:所示，圖28是從人血液單個核細胞(9180逆向分化生產(chǎn)的人自體造血干細胞的轉(zhuǎn)化率的曲線圖；圖2(:是從小鼠血液單個核細胞(9180逆向分化生產(chǎn)的小鼠自體造血干細胞的轉(zhuǎn)化率的曲線圖。由圖28和圖2(:可知，在第1天至第5天的培養(yǎng)期間，自體造血干細胞轉(zhuǎn)化率具有上升的趨勢，在第5天左右，轉(zhuǎn)化率達到最高點，此時，樣品的轉(zhuǎn)化率均處于20%至40%之間。從圖中還可以看出，通過⑶34、⑶133抗體表征的樣品的轉(zhuǎn)化率基本上是相同的，且180的轉(zhuǎn)化率均處于20%至40%之間。
[0093]試驗3自體造血干細胞的安全性鑒定
[0094]取1月齡裸鼠50只，雌雄各半，飼養(yǎng)于普通級環(huán)境中。將小鼠隨機分為三組，其中自體造血干細胞組20只，腫瘤細胞組20只，空白對照組10只。
[0095]將自體造血干細胞組的20只小鼠隨機分成兩組(第一組和第二組),每組10只。第一組小鼠采取尾靜脈移植的方式:將實施例2中制備的蛋白誘導性自體生殖造血干細胞以1 X 107個細胞/只的計量從尾部靜脈注射入小鼠體內(nèi)。第二組小鼠采取尾靜脈注射與皮下注射同時進行的方式:將實施例2中制備的蛋白誘導性自體生殖造血干細胞以1乂107個細胞/只的計量通過尾靜脈注射+頸背部皮下注射的方式注射入小鼠體內(nèi)。
[0096]將腫瘤細胞組的20只小鼠隨機分成兩組(第三組和第四組),每組10只。第三組小鼠采用尾靜脈移植的方式:將黑色素瘤(816)細胞以1 X 107個細胞/只的計量從尾部靜脈注射入小鼠體內(nèi)。第四組小鼠以皮下注射的方式:將黑色素瘤(816)細胞以1X10:個細胞/只的計量從頸背部注射入小鼠體內(nèi)。
[0097]空白對照組的小鼠為第五組小鼠，將與以上各組體積相等的生理鹽水以尾靜脈注射+頸背部皮下注射的方式注射入小鼠體內(nèi)。
[0098]注射完成后，將不同組別的小鼠分開飼養(yǎng)，并每日觀察有無結(jié)節(jié)和腫瘤的形成。21天后處死半數(shù)小鼠，并進行病理檢查。繼續(xù)飼養(yǎng)剩余小鼠，觀察12周后處死并作病理檢查。
[0099]試驗結(jié)果見圖3八至圖3？，圖3八是84 V。裸鼠靜脈移植誘導性自體造血干細胞后105天的照片；圖38是84 V。裸鼠靜脈移植816腫瘤細胞105天的照片；圖30是8處八裸鼠皮下移植+靜脈移植誘導性自體造血干細胞后105天的照片；圖30是8413八裸鼠皮下移植816腫瘤細胞后105天的照片；圖32是此化八裸鼠靜脈移植816腫瘤細胞21天后產(chǎn)生的肺腫瘤的解剖圖；圖3？是各試驗組和對照組的腫瘤發(fā)生率柱狀圖。
[0100]通過上述安全性試驗，第一組、第二組及第五組小鼠在注射21天后以及12周后未發(fā)現(xiàn)一例具有瘤變跡象。而第三組及第四組小鼠在注射21天后部分部位發(fā)生瘤變，注射12周后，全部發(fā)現(xiàn)瘤變跡象。同時，接合柱狀圖可以看出，第一組和第二組注射自體造血干細胞后，發(fā)生腫瘤的概率為0，而第三組及第四組在注入816腫瘤細胞后，發(fā)生腫瘤的概率為100%。因此，使用本發(fā)明的方法制得的具有較高安全性。
[0101]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種制備自體造血干細胞的方法，包括: 將體細胞在細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-6天，收集生成的自體造血干細胞，其中，所述細胞培養(yǎng)液是醫(yī)11640培養(yǎng)液，其中含有1-100 9 1的1-27632 ((^?具0.2抝1) ； 1-100叩加1的干細胞因子的白細胞介素3:1-100118/1^的白細胞介素6 ； 1-1001^/4的白細胞介素11的巨噬細胞集落刺激因子(1-(:%)的粒細胞集落刺激因子(「(^?) ；1~100 11 的巖藻多糖；1-100化/此的硫酸葡聚糖；1-100111的艦03100(1, 1, -〔1，4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷)；1-100 9 1的1-阿侖勝酸鈉80(1111111 廿丨]!#!'社6) ； 1-100 4 1 的帕米勝酸二鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，在即111640培養(yǎng)液中含有10^ 1的卜27632((^?具0 -2^01)^10118/1111的干細胞因子；1011^此的白細胞介素3 的白細胞介素6 ^10118/1111的白細胞介素11 ^10118/1111的巨噬細胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒細胞集落刺激因子9 8/此的巖藻多糖；10 9 8/此的硫酸葡聚糖；10111的艦03100(1, 1, -〔1，4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷)；10^1的1-阿侖勝酸鈉80(1111111 廿丨]!#!'社一)；10 4 1 的帕米勝酸二鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在所述細胞培養(yǎng)液中的培養(yǎng)條件為:溫度為371和5%的(?環(huán)境。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述體細胞來源于人或動物的離體組織，包括血液、骨髓液、皮膚和脂肪中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述體細胞包括臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞和丨或脂肪細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，進一步包括:將制備得到的自體造血干細胞冷凍保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述冷凍保存包括:將得到的自體造血干細胞以IX 105個加1至IX 106個加1的細胞密度與等體積的二甲基亞砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，降溫至-801，然后轉(zhuǎn)移到-1861的液氮中深低溫保存。
8.一種用于制備自體造血干細胞的試劑盒，包括: 細胞培養(yǎng)液，所述細胞培養(yǎng)液是即111640培養(yǎng)液，其中含有1-100 ^ 1的卜27632.21101) ；1-100耶姐的干細胞因子；1-100耶姐的白細胞介素3 ； 1-100^/III[的白細胞介素6 ； 1-100118/1111的白細胞介素11 ； 1-100118/1111的巨噬細胞集落刺激因子(1-(:%) ； 1-10011^/1111的粒細胞集落刺激因子； 1-100 ^ 8/此的巖藻多糖；1-100 9 8/此的硫酸葡聚糖；1-100=1的艦03100 (1, 1 1 -〔1，4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4，8，11-四氮雜環(huán)十四燒〉；1-100 9 1 的 1-阿侖勝酸鈉80(1111111； 1-100 4 1 的帕米膦酸二鈉。
9.一種用于制備自體造血干細胞的試劑盒，包括: 細胞培養(yǎng)液，所述細胞培養(yǎng)液是即111640培養(yǎng)液，其中含有10 ^ 1的卜27632((^?具0 -2^01)^10118/1111的干細胞因子；1011^此的白細胞介素3的白細胞介素6 ^10118/1111的白細胞介素11 ^10118/1111的巨噬細胞集落刺激因子(1-(:%) ^10118/1111的粒細胞集落刺激因子9 8/此的巖藻多糖；10 9 8/此的硫酸葡聚糖；10111的艦03100(1, 1, -〔1，4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷)；10^1的1-阿侖勝酸鈉(Malendronate sodium trihydrate) ;10 μ M 的帕米勝酸二鈉。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的試劑盒在建立自體造血干細胞庫中的應用。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項所述的方法制備的自體造血干細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的自體造血干細胞在建立自體造血干細胞庫中的應用。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的自體造血干細胞在制備抗衰老藥物或保健品中的應用。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的自體造血干細胞在制備涉及器官再生再造和修復的疾病的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K35/28GK104419660SQ201310361684
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】林雄斌, 林柳吟 申請人:林雄斌