專利名稱：類單胺氧化酶C類脫水酶MaoC基因克隆及蛋白的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種類單胺氧化酶C類脫水 酶MaoC基因的分離及其編碼的蛋白質(zhì)制備方法，以及其在制備生物降解物質(zhì)聚羥基脂肪 酸酯上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在過去的50年內(nèi)，石油化工塑料已是應(yīng)用最多的材料，主要是因?yàn)檫@類塑料具有 多種結(jié)構(gòu)、多種性能，且原材料價(jià)格低廉。目前這類塑料產(chǎn)量年增長速度為9. 9%，但給人類 帶來了重要的的“能源問題”和“環(huán)境問題”。生物降解塑料是近些年發(fā)展起來的被全球公認(rèn)的一種真正綠色環(huán)保塑料，易于被 環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)代降解，從根本上解決“白色污染”問題。目前全球研發(fā)的生物降解塑料 品種已有幾十種，其中聚羥基脂肪酸酯(PHA)是其中最為活躍的研究熱點(diǎn)。PHA作為一種 “生物可降解塑料”除用于環(huán)境友好型包裝之外，還可用與熱敏膠、壓敏膠和水溶膠及拉成 纖維等。此外，基于PHA具生物可降解和生物相容性，PHA可作為醫(yī)用植入材料和可控藥物 緩釋載體，PHA的寡聚物可作為酮體供體的營養(yǎng)添加劑，PHA的手性單體作為藥物或手性合 成的中間體，PHA膜蛋白可用于某些微量蛋白的分離；PHA合成基因還可用于調(diào)節(jié)微生物的 新陳代謝，調(diào)節(jié)微生物于逆境條件下的生存能力，由此可用于改造工業(yè)微生物菌株，提高微 生物發(fā)酵的效率等。作為生態(tài)環(huán)境友好型塑料，PHA是最具環(huán)保和最具發(fā)展前景的綠色塑料 之一，該類塑料的不斷開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓寬將會(huì)給人類生活帶來極其深遠(yuǎn)的影響。PHA的生物合成是一個(gè)受多種酶參與催化、由不同的代謝途徑控制的復(fù)雜過程。 PHA合成需要酮基硫解酶、乙酰乙酰輔酶A還原酶和PHA聚合酶。此外，(R)_專一的烯 酰輔酶A水合酶(PhaJ)能通過脂肪酸的氧化提供合成PHA的前體物，它的使用為脂肪 酸在重組菌株中合成PHA提供了有力的工具。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述的原因，本發(fā)明提供了 1個(gè)克隆自辣椒疫霉菌的類單胺氧化酶C類脫水 酶(MaoC-like dehydratase, MaoC)基因MaoC及其蛋白質(zhì)制作技術(shù)，以及應(yīng)用該基因編碼 的類單胺氧化酶C類脫水酶在制備生物降解物質(zhì)聚羥基脂肪酸酯上的應(yīng)用，該基因有897 個(gè)堿基，編碼一種含有298個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為33kDa，無信號肽序列，無內(nèi)含子， 通過特異性酶活測定實(shí)驗(yàn)，證明了該基因編碼的蛋白質(zhì)具有合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)的 生物活性，酶活力達(dá)到58. lU/mg。因此，該基因可有效合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)，為進(jìn)一 步應(yīng)用可生物降解物質(zhì)即綠色塑料聚羥基脂肪酸酯(PHA)提供了一定的技術(shù)儲(chǔ)備。本發(fā)明所提供的類單胺氧化酶C類脫水酶基因，其特征在于其基因序列如Seq ID No 1所示；其蛋白質(zhì)氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示。該基因有897個(gè)堿基，編碼一種含有298個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為33kDa，無信號肽序列，無內(nèi)含子。類單胺氧化酶C類脫水酶(MaoC-like dehydratase, MaoC)是最近發(fā)現(xiàn)的一種新 乙酰輔酶A脫水酶(Enoyl-CoA hydratase)，該酶在脂肪酸0 -氧化至PHA的合成過程中提 供(R)_專一的羥烷基輔酶A(R-3-hydr0XyaCyl-C0A)。MaoC已經(jīng)被證明對底物巴豆酰輔酶 A(Crotonyl-CoA)具烯醇基輔酶A水解酶(Enoyl-CoA)的活性。MaoC因具乙酰輔酶A脫水 酶(Enoyl-CoA hydratase)活性而成為與PHA合成相關(guān)的眾多酶類成員之一。而本發(fā)明所提供的MaoC基因與JGI(jgi/phyCaf7/20609)中的辣椒疫霉全基因組 序列中的MaoC基因氨基酸序列比對，同源性達(dá)99. 33%，核苷酸序列有14個(gè)堿基的差異，氨 基酸序列有2個(gè)氨基酸的差異，這種差異與菌株來源的不同有關(guān)，因此本發(fā)明所分離獲得 的MaoC基因是一個(gè)新的聚羥基脂肪酸酯合成酶基因，本發(fā)明提供的有關(guān)MaoC基因具有聚 羥基脂肪酸酯(PHA)合成酶功能特性的信息具鮮明的原創(chuàng)性。為了能夠更好的將其應(yīng)用，發(fā)明人提供了一種制備本發(fā)明所述MaoC基因及蛋白 的分離制備方法1、基因克隆具體步驟A 采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因組DNA，備用；B:根據(jù)2008年由美國能源部基因研究所(U.S.D印artment of Energy Joint Genomelnstitute-DOE JGI)公布的辣椒疫霉全基因組草圖序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得 目的基因(MaoC)序列，設(shè)計(jì)特異引物(其序列如Seq ID No :3及Seq ID No :4所示)經(jīng) PCR克隆獲得基因全長；2、制備蛋白質(zhì)及酶活測定步驟A :MaoC基因原核表達(dá)載體構(gòu)建，目的基因克隆至pET28a(+)載體中；B 將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli (BL21 (DE3))感受態(tài)細(xì)胞，異 丙基硫代-D-半乳糖苷(Isopropylthio-0 -D-galactoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)；C 表達(dá)產(chǎn)物酶活檢測、SDS-GAGE分析及純化。本發(fā)明所用的載體和宿主菌均常見，pET28a(+)為MaoC基因表達(dá)載體，E. coli BL21(DE3)為該基因的表達(dá)宿主菌。其中由于BL21(DE3)是本領(lǐng)域的慣常寫法，因此在權(quán)利 要求中未對(DE3)中的括號進(jìn)行刪除，以免造成指代不明確，通過上述方法克隆的基因及其制備的蛋白質(zhì)，為研究該類基因的功能及其編碼的 蛋白質(zhì)酶活，乃至為聚羥基脂肪酸酯(PHA)合成提供了一個(gè)重要基因及其操作技術(shù)，為了 驗(yàn)證其性質(zhì)，發(fā)明人對該基因編碼的蛋白質(zhì)酶活進(jìn)行了測定，其方法如下MaoC酶活測定是通過測定對底物巴豆酰輔酶A(Cr0t0nyl-C0A)的水解程度， 測定底物的消耗量即263nm波長下紫外吸收值的降低值，活力單位定義為每分鐘消耗 lu molcrotonyl-CoA所需的蛋白酶液量(mg)，蛋白酶液濃度測定采用Bradford法。經(jīng) 過這種方法的檢測，結(jié)果證明酶活力達(dá)到58. lU/mg，證實(shí)了其可以對對底物巴豆酰輔酶 A(Crotonyl-CoA)具烯醇基輔酶A水解酶(Enoyl-CoA)的活性，進(jìn)而可以作為成為與聚羥基 脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate^HA)合成相關(guān)的眾多酶類成員?；谶@種原因，發(fā)明人 將其應(yīng)用于PHA的生物合成。綜上所述，本發(fā)明提供1個(gè)克隆自辣椒疫霉菌的類單胺氧化酶C類脫水酶 (MaoC-likedehydratase)基因MaoC及其蛋白質(zhì)制作技術(shù)。立足于基因和蛋白水平，通過特異性酶活測定實(shí)驗(yàn)，證明了該基因編碼的蛋白質(zhì)具有合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)的生物活 性，酶活力達(dá)到58. lU/mg。因此，該基因可有效合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)，為進(jìn)一步應(yīng)用 可生物降解物質(zhì)即綠色塑料聚羥基脂肪酸酯(PHA)提供了一定的技術(shù)儲(chǔ)備。


圖1. MaoC基因重組表達(dá)載體示意中Kan為卡那抗性，MCS為多克隆位點(diǎn)，BamH I和EcoR I為雙酶切位點(diǎn)，MaoC 為目的基因；圖2. MaoC基因PCR擴(kuò)增示意中1為核酸Marker ；2為擴(kuò)增出的MaoC基因；圖3. MaoC原核表達(dá)誘導(dǎo)蛋白示意中 1 為 pET28a (+) -MaoC 重組菌 IPTG 誘導(dǎo)前；2-7 為 pET28a (+) -MaoC 重組菌 IPTG誘導(dǎo)后，誘導(dǎo)出36KDa大小的目的蛋白；8為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ；圖4. MaoC原核表達(dá)產(chǎn)物純化示意中1為MaoC誘導(dǎo)前陰性對照；2為MaoC誘導(dǎo)后蛋白液超聲后上清；3為MaoC誘 導(dǎo)后蛋白液超聲后沉淀；4為M-NTA親和純化后穿過液；5為純化后的洗脫蛋白；6為標(biāo)準(zhǔn) 蛋白 Marker o
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所提供的實(shí)施例，均按照常規(guī)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(New York Go Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper, J 等(Blac-kwell 禾斗學(xué)出 版社，1988)所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。實(shí)施例1 (基因克隆及測序)根據(jù)2008年由美國能源部基因研究所(U. S.D印artment of Energy Joint Genomelnstitute-DOE JGI)公布的辣椒疫霉全基因組草圖序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得 目的基因(MaoC)序列，設(shè)計(jì)特異引物(其序列如Seq ID No :3及Seq ID No :4所示)，以 辣椒疫霉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增步驟如下PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C lOmin ；94°C lmin, 55°C lmin, 72°C lmin,共 35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。反應(yīng)體系為:ddH20(32. 5 u L), 10X buffer (5 u L), MgCL2 (4 u L), dNTP (4 u L), MaoC-F (1 u L)，MaoC-R (1 u L)，DNA (2 u L), TaqE (0. 5 ii L)。取10 y L反應(yīng)產(chǎn)物電泳，確定含有目基因單克隆，送上海博亞生物有限公司測序。 測序結(jié)果與辣椒疫霉基因組全序列中的MaoC序列比對，確定目的基因。根據(jù)基因全長序列 推測獲得相應(yīng)的氨基酸序列。實(shí)施列2 (基因表達(dá))提取表達(dá)載體pET28a(+)質(zhì)粒備用；經(jīng)PCR擴(kuò)增后的基因通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行純化回收后待用。將基因和載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切體系為
權(quán)利要求
類單胺氧化酶C類脫水酶基因，其特征在于其基因序列如Seq ID No1所示；其蛋白質(zhì)氨基酸序列為SEQ ID NO2所示。
2.如權(quán)利要求1所述類單胺氧化酶C類脫水酶基因分離克隆及其蛋白質(zhì)制備方法，其 步驟如下1)MaoC基因分離克隆的具體步驟A 采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因組DNA，備用；B 根據(jù)已公布的辣椒疫霉全基因組草圖序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析獲得目的基因MaoC 的序列，設(shè)計(jì)特異引物，其序列如Seq ID No :3及Seq ID No :4所示，經(jīng)PCR克隆得到MaoC 基因全長序列；2)制備蛋白質(zhì)的具體步驟A 將MaoC基因原核表達(dá)載體構(gòu)建，目的基因克隆至pET28a(+)表達(dá)載體中； B 將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，異丙基硫代-0 _D_半乳糖苷 誘導(dǎo)表達(dá)。；C 表達(dá)產(chǎn)物酶活性檢測、SDS-GAGE分析及純化。
3.類單胺氧化酶C類脫水酶基因，應(yīng)用于制備生物降解物質(zhì)聚羥基脂肪酸酯。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了1個(gè)克隆自辣椒疫霉菌的類單胺氧化酶C類脫水酶(MaoC-like dehydratase，MaoC)基因MaoC及其蛋白質(zhì)制作技術(shù)，以及應(yīng)用該基因編碼的類單胺氧化酶C類脫水酶在制備生物降解物質(zhì)聚羥基脂肪酸酯上的應(yīng)用，該基因有897個(gè)堿基，編碼一種含有298個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量為33kDa，無信號肽序列，無內(nèi)含子。
文檔編號C12N15/70GK101979589SQ20101029597
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者張修國 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)