專利名稱：一種鐮刀菌單端孢霉烯族a類毒素的分子鑒定方法
技術領域：
本發明屬于植物檢驗檢疫技術領域，具體地涉及一種鐮刀菌單端孢霉烯族A類毒素的分子鑒定方法。
背景技術：
由鐮刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是世界范圍內危害小麥、大麥、玉米等作物的一種重要病害，不僅嚴重影響作物產量，而且鐮刀菌可以產生多種對人畜有毒害作用的單端孢霉烯族毒素，使糧食或飼料的品質降低。鐮刀菌毒素穩定性高、 不易降解，可隨食品、飼料加工過程進入食物鏈，進而威脅人畜健康。這些毒素可抑制真核生物細胞蛋白質合成，破壞人和動物的免疫系統，中毒后常伴有嘔吐、腹瀉、頭暈等癥狀，有的毒素甚至可能致癌。單端孢霉烯族毒素是最重要的鐮刀菌毒素，主要包括A、B兩類。T-2 毒素屬A類單端孢霉烯毒素，是最受關注的鐮刀菌毒素，具有很大的威脅，被認為是一種真正的生化武器。在小麥、玉米等糧食或飼料中T-2毒素的檢出率非常高。產T-2毒素的鐮刀菌主要有 Fusarium Poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium kyushuense, Fusarium langsethiae 4 禾中。其中，Fusarium poae 禾口 Fusarium sporotrichioides 在世界各地均有分布，但Fusarium poae中只有一部分菌株產T-2毒素。之前，Fusarium kyushuense僅在日本有報道，現在中國也發現有這類菌株存在。目前，沒有在中國發現Fusarium langsethiae 菌種，該菌種廣泛分布于歐洲各國。由于T-2毒素對人畜健康、食品及飼料安全形成嚴重威脅，各國政府檢驗檢疫部門均十分重視這種毒素的檢測監控研究，加強檢驗檢疫以防止外來病原菌入侵我國勢在必行。目前，鐮刀菌毒素的檢測方法主要是化學測定法，但其提取純化程序費時、復雜， 需要昂貴的儀器設備，且操作過程中毒素樣品對操作者有一定的潛在威脅。免疫化學法如酶聯免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)也用于鐮刀菌毒素測定， 主要應用于糧食樣品中真菌毒素的檢測。由于A、B兩類單端孢霉烯族毒素結構相似，在用 ELISA試劑盒進行檢測時容易相互干擾，導致測定的結果往往偏高，而且容易出現假陽性。 隨著國際貿易中各國之間糧食進出口規模不斷擴大，各國口岸加強了對小麥和玉米的出入境管理，檢疫實踐中急需一種快速、靈敏、準確地檢測出進口糧食中是否帶有產A類毒素的病原菌或存在A類毒素污染，以判斷其是否合格，能否進關。近年來，隨著鐮刀菌分子生物學研究的快速發展，對單端孢霉烯族毒素的合成、毒素基因表達調控方面已經取得了一些十分有意義的結果，A類毒素生物合成的分子特點逐漸清晰，許多基因及在毒素合成代謝途徑中的作用已被證實。因此，基于這些最新的分子生物學研究結果和相關基因序列信息，建立一種簡單、快速、低成本地鑒定出這些毒素及其產毒病原菌的方法成為可能。近幾年，不同國家的研究人員做了一些有益的嘗試。但到目前為止，有關A類單端孢霉烯毒素分子鑒定的研究非常少，Nicholson等通過Tri4基因序列信息，檢測了鐮刀菌屬13個種共14個菌株產A類或B類毒素的情況(Nicholson et al. Detection anddifferentiation of trichothecene and enniatin-producingFusarium species on small-grain cereals. Eur. J.Plant Pathol. , 2004,110 :503-514), 部分菌株經兩對引物檢測結果的結果不能相互吻合，且各菌株的產毒種類沒有經過化學分析驗證，可信度不高。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術存在的缺限和不足，研制出能夠快速準確檢測一種鐮刀菌單端孢霉烯族A類毒素的分子鑒定方法，以達到準確、快速、低成本的檢測出A類鐮刀菌毒素(即T-2毒素)的目的。本發明是這樣實現的利用NCBI數據庫中已經公開發表的擬枝孢鐮刀菌(Fusarium sporotrichioides)的毒素合成基因 Tri 13 序列(http //www, ncbi. nlm. nih. rov),設 對特異性引物，可從產Τ-2毒素的菌株基因組中擴增出單一的片段，而從不產Τ-2毒素的菌株基因組中擴不出任何條帶。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據條帶的有無快速鑒定 Τ-2毒素。具體步驟如下一種產A類單端孢霉烯毒素(T-幻鐮刀菌(Fusarium sporotrichioides)Tril3 基因的特異片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，序列全長為470bp。用于擴增上述鐮刀菌毒素τ-2的基因片段的引物，它們的核苷酸序列如序列表 SEQ IDNO 2 和 SEQ ID NO 3 所示所示。 一種檢測一種鐮刀菌單端孢霉烯族a類毒素的分子鑒定方法，其步驟分別如下(1)分離、純化鐮刀菌，鑒定后保存；(2)將步驟(1)得到的菌株置于鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上25°C、黑暗條件下培養7天，收集的菌絲在液氮中研磨成粉末，用常規的CTAB法抽提菌絲總DNA ；(3)取0. 5g左右待檢測的生物樣品在液態氮中磨碎后，用常規的ctab法提取 dna，用 50ul te 溶解，加 2ul 10mg/ml rna 酶，37°C水浴 30min 后，用體積比為 25 24 1 的苯酚氯仿異戊醇溶液純化dna，重復沉淀dna —次，最后再用50ul te溶解dna，其中待檢測的生物樣品是受鐮刀菌毒素污染的籽粒、飼料或食品，或是受鐮刀菌毒素病菌侵染的植物的植株和組織；(4)用序列表seq id no :2和seq id no :3所示的引物對進行pcr擴增，得到如序列表SEQ ID NO 1所示的基因片段或無擴增產物；(5)用步驟( 和( 得到的基因片段檢測所述的鐮刀菌菌株是否可產單端孢霉烯族A類毒素(T-幻或/和被測生物材料是否存在所述的單端孢霉烯A類毒素(T-2)；其中單端孢霉烯A類毒素(T-2)的特異性帶長度為470bp。上述步驟(4)所說的pcr具體步驟是1)擴增反應體系在20ul PCR反應液中，含有80ng模板DNA，2ullOXPCR緩沖液 (配方20mM Tri-HCl, pH 8. 4,200mM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgSO4)，2ull. 25mMdNTPs， 0. 5ul Primer Pl (10 μ M)，0. 5ul Primer P2(10yM),lU Taq DNA 聚合酶；2) PCR 反應條件94°C 5min ；94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 40s，33 個循環；及終延伸 72 °C 8min ；
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3)反應完成后，取如1 PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統中紫外燈下照相，根據擴增產物的有無及大小判定結果。本發明的有益的效果利用已公布的毒素生物合成關鍵基因Tril3序列信息，設計了一對特異引物， 經PCR擴增，即可簡單快速可靠地鑒定出某種鐮刀菌是否可產生A類單端孢霉烯毒素 (T-2)。通過對38個不同種類的鐮刀菌菌株(表1和表2~)進行GC/MS化學分析，結果顯示 Fusariumlangsethiae和梨孢鐮刀菌(Fusarium poae)可以產生T-2毒素。從圖2可以看出，利用設計的引物進行擴增，Fusarium Iangsethiae和梨孢鐮刀菌(Fusarium poae)產生了一條470bp的片段，而不能產生T-2毒素的菌株都沒有擴增出任何條帶，該鑒定結果與化學分析的結果完全吻合，也與國際公認的產A類單端孢霉烯毒素(T-2)的結果一致，說明該分子鑒定方法準確度高，可以簡單快速地檢測出糧食、飼料和食品安全中A類毒素的污染狀況。目前有關A類單端孢霉烯毒素分子鑒定的研究很少且進展停滯不前，本發明首次基于Tril3基因序列信息來鑒定A類單端孢霉烯毒素(T-2)的產生情況，所以本發明在具有巨大危害作用的A類毒素分子檢測領域邁出了具有重要意義的一步，擴大了毒素合成基因在毒素分子生物學檢測方面的應用范圍。


SEQ ID NO=I是本發明鐮刀菌毒素T_2的特異性基因片段，片段全長為470bp。SEQ ID NO 2和3是發明設計的弓|物序列。圖1，是本發明的技術流程圖。圖2，是本發明中應用特異性引物經PCR擴增的不同種鐮刀菌基因組DNA的電泳結果。泳道M為IOObp的分子量標記；泳道1為陰性空白對照，無模板DNA ；泳道2 17對應的菌株依次為:Fusarium langsethiae, Fusarium poae, Fusarium tricinctum, Fusarium equiseti, Fusarium sambucinum, Fusarium acuminatum, Fusarium nivale, Fusarium solani, Fusariumverticillioides, Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Fusarium heteroporum, Fusariumsemitectum, Fusarium subglutinans, Fusarium proliferatum, Fusarium graminearum，本發明試驗各菌株來源編號見表1和表2。
具體實施例方式1.檢測用相關菌株的收集從中國不同地區收集的小麥、大麥和玉米赤霉病病穗樣品，經過組織分離和單孢純化培養，經形態標準程序鑒定后，得到的鐮刀菌菌株如表1所示，本發明使用的鐮刀菌見表1。表1本發明所采用的鐮刀菌菌株
權利要求
1.一種鐮刀菌毒素T-2的基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，序列全長為470bp。
2.用于擴增權利要求1所述的基因片段的引物，其核苷酸序列分別如下所示PlCGGAGGTTTCGACACAACAAGTA ；P2 CTTCTCMCTGTTGTTTRACGG
3.一種鐮刀菌單端孢霉烯族A類毒素的分子鑒定方法，其步驟包括(1)從被測的生物材料中抽提總DNA，得到DNA樣品；(2)用權利要求2中Pl和P2所示的引物對步驟⑴所述的DNA樣品進行PCR擴增，得到如序列表SEQ ID NO 1所示的基因片段；(3)用步驟( 得到的基因片段，檢測所述的生物材料中是否存在所述的鐮刀菌單端孢霉烯族A類毒素，其中步驟( 所述的PCR擴增步驟包括1)擴增反應體系在20ulPCR反應體系中，含有約80ng模板DNA，2ullOXPCR緩沖液， 2ull. 25mM dNTPs，0. 5ul 引物 Pl (10 μ Μ)，0. 5ul 引物 Ρ2 (10 μ Μ)和 IU Taq DNA 聚合酶；2)PCR反應條件94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 40s, 33 個循環；最后 72°C延伸 8min ；3)電泳檢測反應完成后，取如1PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統中紫外燈下照相，根據擴增產物的有無和大小判定結果，其中步驟 1)的緩沖液組成如下20mM Tri-HCl, pH 8. 4,200mM KCl, IOOmM(NH4)2SO4, 20mM MgSO4。
4.權利要求3所述的方法在檢測鐮刀菌毒素中的應用，其中包括在檢測谷物籽粒、飼料或食品中的鐮刀菌毒素中的應用。
5.權利要求1所述的基因片段在檢測鐮刀菌毒素中的應用。
6.權利要求2所述的引物在鑒定鐮刀菌產毒類型中的應用，其中包括在在檢測谷物籽粒、飼料或食品中的鐮刀菌毒素中的應用。
全文摘要
本發明屬于植物檢驗檢疫技術領域，具體地涉及一種鐮刀菌單端孢霉烯族A類毒素的分子鑒定方法。其特征是，針對單端孢霉烯A類毒素，通過Tri13基因信息設計一對特異性引物，從產鐮刀菌A類毒素的鐮刀菌中分離得到T-2毒素的特異性片段(其長度為470bp)，而不產鐮刀菌A類毒素的鐮刀菌中不能擴增到該特異片段，采用PCR反應，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測產物，直接根據產物片段的有無及大小，即可確定某一鐮刀菌是否產T-2毒素。本發明可用于谷物、飼料和食品安全中鐮刀菌單端孢霉烯族A類毒素的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102443590SQ20101050609
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月9日 優先權日2010年10月9日
發明者廖玉才, 張靜柏, 李和平, 王建華, 黃濤 申請人:華中農業大學