檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的TaqMan探針實時熒光引物及其應用的制作方法
【專利摘要】本方法基于該病原的尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的特異保守引物和TaqMan探針建立了一種實時熒光PCR定性檢測方法，能夠在1.5小時內同時分別對尖孢鐮刀菌古巴專化型1號生理小種進行準確高效的定性和定量檢測，具有高特異性和高靈敏度，較之前的普通PCR檢測研究提高了檢測靈敏度達1－2個數量級，且能夠進行定量檢測和多重檢測，突破了SYBRGREEN熒光染料法不能進行兩重或多重檢測的限制。該實時熒光PCR定性檢測方法行準確高效，能夠用于加強該病害防控檢測和檢疫工作。
【專利說明】檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的TaqMan探針實時熒光引物及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種快速鑒定與定量檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的TaqMan探針實時熒光引物及其檢測方法。
【背景技術】
[0002]由尖抱鍵刀菌I 號(Fusarium oxysporum f.sp.cubense racel, FOCl)和 4 號生理小種(F.0xysporum f.sp.cubense race4, F0C4)引起的香蕉鐮刀菌枯萎病,是世界上香蕉的毀滅性病害，給世界的香蕉產業帶來巨大的危害。香蕉主要集中于非洲、南美洲和亞洲，年產量近一億噸，是世界第二大水果作物，同時為近5億人口的主要糧食之一，是繼水稻、小麥和玉米之后的第四大糧食作物。日前共有120個國家和地區生產香蕉。近年來我國香蕉生產發展迅猛，居全球第二。香蕉業己成為我國熱帶地區農業的支柱產業。但是，隨著香蕉種植面積逐年增加，香蕉病害的危害也日益嚴重，尤其是香蕉枯萎病給香蕉生產帶來極大的威脅。1876年,Joseph Bancroft在澳大利亞首次報道了香蕉枯萎病。1904年在美國夏威夷也發現此病，1910年，巴拿馬因香蕉枯萎病大發生，造成慘重損失，因而香蕉枯萎病又稱為香蕉巴拿馬病。同年，由Erwin F.Smith在古巴從香蕉病組織中分離到該病的病原菌，并將其命名為 Fusarium oxysporum f.cubenseE.F.Smith。1913 年 Ashby 對該病害及其病原菌首次做了詳細的描述，Brandes于1919年首次確證了該病菌的致病性，1940年由 Snyder 和 Hansen 建議將該病菌正式命名為 F.0xysporum Schlecht.f.sp.cubense (E.F.Smith)Snyder et Hansen。{Moore, 1999#67}
[0003]目前，該病害已廣泛分布于亞洲、非洲、澳大利亞、南太平洋及熱帶美洲的香蕉產區。該病(I號小種)于1940—1950在中南美洲國家爆發感染，使風糜世界的國際貿易香蕉品種大蜜哈(Gros Michel)退出歷史舞臺。1967年我國臺灣省發生香蕉枯萎病，20世紀70年代后流行，使臺灣的香蕉面積從最高峰時期的50000公頃降至近年的5000公頃，而且其中的一半仍受到枯萎病的影響。菲律賓、澳大利亞、馬來西亞、非洲等國家和地區的香蕉也相繼局部發生枯萎病。
[0004]在中國于十九世紀五六十年代在廣東、廣西、海南發現該病侵染為害粉蕉，1996年廣東番禹萬頃沙鎮的巴西及廣東2號香蕉出現枯萎病，現已通過種苗和流水等傳染途徑擴散至中山、珠海、東莞、肇慶、信宜、高州和湛江(雷州半島)等地，該病每年以30— 50公里速度傳播，使許多蕉園不能種植香蕉，目前已有1000多公頃蕉園棄耕。現廣東、廣西(如南寧、百色)、福建(如漳州)、海南(如文昌、萬寧、儋州、安定、澄邁)、云南(如河口、景洪)和臺灣均有分布，對我國香蕉種植業構成嚴重威脅。
[0005]該菌因生理小種不同而危害不同品種的香蕉，世界上已報道有3個生理小種，其中I號小種世界性分布，感染粉蕉、香蕉的栽培品種大蜜哈(AAA)和Apple(AAB)、Silk(AAB)、Taiwan Latundan (AAB)和IC2 (AAAA)等香蕉品系；2號小種在中美洲洪都拉斯、薩爾瓦多、波多黎哥、多米尼加和維爾京群島分布，僅感染雜種三倍體Bluggoe(ABB)及其近緣品種和某些Jamaica四倍體(AAAA)蕉；4號小種主要分布在澳大利亞、非洲以及菲律賓(卡拉雷群島)等部分亞洲國家，可感染大蜜哈(AAA)、TaiwanLatundan (AAB)、PisangLilin(AA)、野蕉(BB)等所有香蕉和大蕉品種及對其他小種有抗性的香牙蕉(AAA)，故危險性和毀滅性最大，引起世界各香蕉種植國家的高度關注。目前中國以小種4號和I號危害最為嚴重。
[0006]目前該病害沒有好的防治措施，而且危害的區域在不斷擴大，且對于粉蕉更存在復合侵染的現象。粉蕉經濟價值高，且隨著種植面積的增大，病害發生也日趨嚴重，對于粉蕉苗的檢測和發病初期的早期檢測而言，需要更為靈敏和準確有效的檢測方法。對香蕉枯萎病及其病原的檢測鑒定和監控防疫工作是解決香蕉枯萎病問題的前提和基礎，檢測方法的建立和應用對于阻止病害蔓延和發生具有重要的意義。
[0007]國內的檢測鑒定研究，如王國芬等根據香蕉枯萎病菌ITS序列設計合成的三條引物:FusFl(5' AACCCCTGTGAACATACCACTTG3' )、FusRl(5' GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3')和 FusR2(5' GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3')構成引物對 A (FusFl/Rl)和 B (FusFl/R2)，對尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌進行了有效的PCR特異擴增試驗。
[0008]對于生理小種檢測鑒定方面主要集中在4號生理小種，如臺灣Lin Yinghong等建立了針對F0C4特異性404bp序列的普通PCR檢測引物，并應用SYBR GREEN熒光染料進行了實時熒光PCR檢測。福建Li等建立了針對F0C4特異性404bp序列的LAMP方法檢測4號生理小種。
[0009]近年來，有研究報道解決了兩個生理小種的普通PCR鑒定問題。如劉景梅等嘗試用RAPD技術區分生理小種，經過隨機引物篩選出4個RAPD標記成功地轉化為SCAR標記，其中Racel — SCAR標記I個、Race4 — SCAR標記2個、同時能鑒定出2個小種的SCAR標記I個。應用這4個SCAR標記同時對采自田間的9個病菌分離物進行檢測，能夠準確地鑒定出廣東蕉區的尖孢鐮刀菌古巴專化型Racel和Race4。2012年李敏慧等已建立了能夠區分兩個生理小種的普通PCR分子檢測體系。但田間樣品病菌含量低，干擾物質多，內生真菌、細菌和土壤中放線菌等分布廣泛，對檢測的靈敏度和特異性均構成了極大的干擾，造成現有檢測方法往往因為靈敏度和特異性的限制而呈現檢測結果不穩定的現象，對病害的早期檢測帶來了一個巨大的障礙。
[0010]實時熒光PCR技術是使用實時熒光擴增裝置實時監測PCR擴增產物并進行分析的方法。該方法較普通PCR方法更為靈敏可靠，較環介導等溫擴增方法更穩定，不易污染，且可以實現多重檢測，是現在通行靈敏并且可靠的檢測方法，應用廣泛。尤其是探針法實時熒光PCR技術因其特異性高、可多重檢測，故常用于SNP解析，病毒、病原菌檢測。但目前尚未有探針法實時熒光PCR檢測尖孢鐮刀菌的報道，更缺乏專門針對尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的實時熒光PCR檢測方法。
[0011]本方法建立了能夠準確高效區分尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的TaqMan探針實時熒光PCR檢測方法。希望能夠通過該方法的建立，解決含量低、干擾多的難題；同時，建立了一種能夠定量檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的方法以應用于菌含量的對比研究。
[0012]本方法能用于同時實時熒光PCR法檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種，且更穩定，靈敏度較高，符合“快、準、穩、省”的檢測一般要求。相對于其他更靈敏的方法如LAMP方法更為穩定，不易污染，相對傳統PCR方法和接種鑒定生理小種方法更為靈敏和快速，可以在幼苗期進行檢測，對于香蕉生產上意義重大。因為香蕉屬于三倍體作物，不能通過傳統的雜交育種來繁殖，生產上采用組培苗來做田間種植，所以對于田間香蕉枯萎病的控制主要在種苗的監測上，而種苗中的含菌量是很低的，需要靈敏度較高的檢測方法，而本研究建立的方法能夠較好地解決這一問題，應用前途廣泛。而且，由于F0C4在中國境內危害日益嚴重，田間調查發現F0C4的危害有進一步擴大的趨勢。本方法首次針對F0C4建立了 TaqMan探針實時熒光檢測方法，同時可用于配合其它生理小種TaqMan熒光檢測引物進行雙重或多重熒光PCR定量檢測尖鐮孢屬古巴專化型的菌含量(拷貝數)。對于監控和防止該生理小種的進一步蔓延有重大意義。
[0013]本方法基于該病原的尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的特異保守引物和TaqMan探針建立了一種實時熒光PCR定性檢測方法，能夠在1.5小時內同時分別對尖孢鐮刀菌古巴專化型I號生理小種進行準確高效的定性和定量檢測，具有高特異性和高靈敏度，較之前的普通PCR檢測研究提高了檢測靈敏度達I 一 2個數量級，且能夠進行定量檢測和多重檢測，突破了 SYBRGREEN熒光染料法不能進行兩重或多重檢測的限制。該實時熒光PCR定性檢測方法行準確高效，能夠用于加強該病害防控檢測和檢疫工作。

【發明內容】

[0014]本發明的首要目的是克服現有技術的缺點與不足之處，提供一種快速準確靈敏的檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的TaqMan探針引物及其檢測方法。
[0015]本發明的另一目的在于提供所述檢測方法的應用。
[0016]本發明是采用以下方案實現的:一種快速檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的TaqMan探針檢測方法，包含以下步驟:
[0017]1.引物和探針
[0018]引物采用PrimerExpress3.0軟件設計，由大連TAKARA公司合成。
[0019]F0C4所用弓丨物和探針如下:
[0020]Foc4-0422F25’ GGCTTCCAGACCGACAAGATAT3 ’
[0021]Foc4-0422R25’ TGCTTGGCCTTGATTCTGACT3 ’
[0022]Foc4-0422P25’ FAM-ATAATCGAACAGTTTGCG-BHQ 13J
[0023]2.DNA提取和濃度測量
[0024]樣品DNA提取采用CTAB兩步法，提取前用液氮充分研磨，提取后用NanoDroplOOO型核酸微量測定儀測定核酸濃度。具體提取步驟如下:
[0025]稱取Ig樣品(根據樣品的DNA含量，可以調整樣品量)，加入到50mL的離心管中；加入5mLCTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻。65°C孵育30min，不時振蕩；65°C過夜后，8000r/min室溫離心IOmin,取Iml上清液入2ml離心管中；加入700 μ L氯仿后用力振蕩，13000 X g離心lOmin，轉移上清液600 μ L到新的2ml離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀溶液顛倒數次后室溫靜置60min，13000 Xg離心lOmin，棄去上清，加入350 μ LNaCl溶液將沉淀進行懸浮，再加入350 μ L氯仿，渦旋振蕩進行混勻，13000 Xg離心lOmin，轉移上清后加入0.8倍體積的異丙醇用來沉淀核酸,室溫放置20min, 13000 X g離心IOmin,棄去上清，加入500 μ L70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于50 μ LTE溶液中。[0026]3.實時熒光PCR檢測方法特異性驗證
[0027]使用熒光探針Foc4-0422P2及引物Foc4-0422F2/Foc4_0422R2進行實時熒光PCR，共同檢測香蕉串珠鐮刀菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌、火龍果枯萎病菌等鐮刀菌屬內近似種及鐮刀菌屬外青霉屬。擴增試劑盒采用ABI試劑盒2XTaqManUniversal PCR Master Mix II。
[0028]實時熒光PCR反應體系如下:
[0029]
【權利要求】
1.一種檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種iFusarium oxysporum f.sp.cubense race 4)的TaqMan引物和探針,其中，所述的引物序列為:上游引物Foc4_0422F25，GGCTTCCAGACCGACAAGATAT3，，下游引物 Foc4_0422R2 5，TGCTTGGCCTTGATTCTGACT3，，探針序列為5’熒光標記，3’淬滅劑標記的DNA序列，所述的序列為:Foc4-0422P25’ Dye-ATAATCGAACAGTTTGCG-Quen 3’。
2.根據權利要求1所述的探針，其中所述的突光劑選自Biotin、Cy3、Cy5、Digoxin、FAM、HEX、JOE、ROX, TAMRA, Amino、Phosphorylation、ROX, SHC6、SIMA(HEX)、TET。
3.根據權利要求1所述的探針，其中所述的淬滅劑選自JOE、BHQl、BHQ2、ROX、BHQ3、TAMRA> Biotin、BiotinTEG、Dabcyl> Dabsyl> TET、Digoxin、Amino、diThiol、Eclipse、FAM、HEX、Phosphorylation, SHC6、SHC3。
4.如權利要求1所述的引物和探針，其中所述的探針的為Foc4-0422P25’ FAM-ATAATCGAACAGTTTGCG-BHQI 3’。
5.一種檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種iFusarium oxysporumf.sp.cubense race 4)的試劑盒，其特征在于包括引物和探針，所述的引物和探針的序列為:上游引物 Foc4-0422F2 5’ GGCTTCCAGACCGACAAGATAT3 ’，下游引物 Foc4-0422R2 5 ’ TGCTTGGCCTTGATTCTGACT3’，探針序列為:Foc4_0422P25’ FAM-ATAATCGAACAGTTTGCG-BHQI 3’。
6.如權利要求5所述的檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的試劑盒，其特征在于還包括實施熒光定量PCR所需要的其他試劑，具體為TaqMan Universal PCR MasterMix，包含尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種DNA片段的質粒模板，TE緩沖液。
7.—種檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種的方法，其特征在于，利用權利要求1所述的探針和引物進行TaqMan熒光定量檢測，具體方法包括: 1)樣品DNA提取采用CTAB兩步法，提取前用液氮充分研磨，提取后用NanoDroplOOO型核酸微量測定儀測定核酸濃度。具體提取步驟如下: 稱取Ig樣品(根據樣品的DNA含量，可以調整樣品量)，加入到50mL的離心管中；加入5mLCTAB提取液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻。65°C孵育30min，不時振蕩；65°C過夜后，8000r/min室溫離心IOmin,取Iml上清液入2ml離心管中；加入700 μ L氯仿后用力振蕩，13000Xg離心lOmin，轉移上清液600 μ L到新的2ml離心管中；加入2倍體積的CTAB沉淀溶液顛倒數次后室溫靜置60min，13000 Xg離心lOmin，棄去上清，加入350 μ LNaCl溶液將沉淀進行懸浮，再加入350 μ L氯仿，渦旋振蕩進行混勻，13000 Xg離心lOmin，轉移上清后加入0.8倍體積的異丙醇用來沉淀核酸,室溫放置20min, 13000 X g離心IOmin,棄去上清，加入500 μ L70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于50 μ LTE溶液中； 2)實時熒光PCR檢測方法特異性驗證 使用熒光探針Foc4-0422P2及引物Foc4-0422F2/Foc4_0422R2進行實時熒光PCR，共同檢測香蕉串珠鐮刀菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌、火龍果枯萎病菌等鐮刀菌屬內近似種及鐮刀菌屬外青霉屬。擴增試劑盒采用ABI試劑盒2XTaqMan UniversalPCR Master Mix II， 實時熒光PCR反應體系如下:
【文檔編號】C12N15/11GK103789417SQ201410011302
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月9日
【發明者】楊雷亮, 孫麗霞, 邱德義, 陳定虎, 李華平, 管維, 王章根 申請人:中華人民共和國中山出入境檢驗檢疫局