專利名稱：一種細菌檢測方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及樣本檢測，尤其是一種樣本中細菌的檢測方法及裝置。
背景技術：
地表水、地下水，甚至雨水中含有多種細菌。當水體受到人畜糞便、生活污水或某 些工農業廢水污染時，水體中的細菌大量增加。因此，對水的細菌學檢驗，特別是腸道細菌 的檢驗，在衛生學上具有重要的意義。通過檢驗水體中特定種類的細菌數量，可以判斷水體 的衛生學質量。在現有的水體細菌檢測方法中，一般是將在現場采集的大體積水樣帶回實驗室進 行分析。該方式由于從采樣到檢測有一定的時間間隔，則若有效實現對水體細菌的檢測，需 要滿足以下條件常溫條件下，水樣從采樣到檢驗不能超過2小時；若采用10攝氏度以下 冷藏保存也不得超過6小時。這就需要采樣以后及時將水樣送至實驗室進行檢測，但由于 水樣的采樣體積大，不方便運輸及冷藏保存，這就給江河、湖庫、泳池、景觀場所的水體細菌 日常監測帶來很大不便。在細菌實驗室檢測中，基于酶底物的培養檢測法易于觀察識別和實現自動化，在 地表水、飲用水檢測中被廣泛采用。但被測水體中在含有目標細菌的同時往往還含有大量 其他其他微生物，在對水體中的細菌進行培養的過程中，目標細菌和其他微生物將大量繁 殖，使培養液的濁度發生顯著變化。菌濁的增加將嚴重干擾光電檢測儀器對酶底物的檢測， 從而影響水樣細菌濃度檢測結果的準確性。此外，被測水樣中可能還會含有其他諸如抗生 素、氧化劑等其他化學物質。在現有的方法中，不對水樣進行分離處理，而直接進行培養檢 測，前述化學物質將抑制細菌的增殖，從而延長了細菌培養生長時間，最終影響水樣細菌濃 度檢測結果的準確性。

發明內容
為解決現有技術中的上述不足，本發明提供了一種能夠消除共存微生物干擾功能 的細菌檢測方法及裝置。為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案一種細菌檢測方法，包括以下步驟a、采樣步驟待測樣本通過過濾器，樣本中的細菌在過濾器內積累；計量通過過濾器的樣本總體積；b、培養及檢測步驟將積累有細菌的過濾器放入培養液中，細菌被限制在過濾器內生長繁殖并產生代 謝物，目標細菌產生的代謝物與培養液中的底物發生特異性反應；檢測培養液的信息，得到被測樣本中目標細菌的信息。進一步，所述樣本為水樣。
作為優選，在現場進行步驟a，再將積累有細菌的過濾器帶回實驗室，再進行步驟 b。進一步，檢測培養液中對目標細菌代謝物具有特異性的底物變化信息。作為優選，在步驟b中，檢測培養液的吸光度或透光度或熒光強度。進一步，在步驟b中，根據檢測得到的培養液的信息，判斷樣本中是否含有細菌；或根據連續檢測得到的培養液的信息隨時間變化的關系，得出細菌的濃度。本發明還提供了一種細菌檢測裝置，包括培養單元、檢測單元和分析單元，其特點 是所述檢測裝置還包括過濾器；所述過濾器用于截留樣本中的細菌；所述過濾器放置在 培養單元中時，所述培養單元中的培養液和細菌代謝物能夠透過所述過濾器。進一步，所述樣本為水樣。進一步，所述檢測裝置還包括驅動泵，以驅動樣本進入過濾器。進一步，所述檢測裝置還包括冷藏箱，對截留細菌后的過濾器冷藏。與現有技術相比，本發明具有以下優點1、采樣方便在現場采用特殊設計的過濾器過濾水樣，將大體積水樣中的細菌富集在小體積的 過濾器內，然后將積累有細菌的小體積過濾器在現場或帶回實驗室進行培養檢測，從而解 決了大體積水樣運輸及存儲不便的問題；2、消除水體基體干擾通過特殊設計的過濾器過濾水樣，將細菌與基體未知的水樣分離，且截留后放入 已知組分的培養液中培養，避免了原水樣未知基體對細菌生長可能的干擾，從而提高了檢 測結果的準確性；3、消除細菌生長形成的濁度干擾細菌及其共存微生物被限制在過濾器內培養生長，僅培養液及細菌代謝物能夠透 過過濾器，避免了細菌繁殖形成的菌濁對光學法檢測的干擾，從而提高了檢測結果的準確 性和可靠性；4、方法分析過程簡便，便于實現儀器化和自動化。


圖1為實施例1中采樣時對應的裝置結構示意圖；圖2為實施例1中對細菌培養時對應的裝置結構示意圖；圖3為實施例1中對培養液進行檢測時對應的裝置結構示意圖；圖4為實施例2中對細菌連續培養檢測時對應的裝置結構示意圖；圖5為實施例3中采樣時對應的裝置結構示意圖；圖6為實施例3中對細菌連續培養檢測時對應的裝置結構示意圖。
具體實施例方式實施例1 如圖1、2、3所示，一種細菌檢測裝置，包括過濾器11、培養單元2、檢測單元和分析 單元4 ；
所述過濾器11包括過濾膜111和連接器112，所述過濾膜111為等效過濾孔徑為 0. 2um的親水性聚砜濾膜；帶有壓力的樣本(0. 1 !Bbar)通過所述連接器112進入過濾器11，在壓力的作用 下濾液從過濾膜111的濾孔排出，而樣本中的細菌被截留在過濾膜111的內壁上；所述過濾 器11用于過濾積累被測樣本中的細菌，本實施例中樣本為水樣；所述培養單元2包括培養容器211和培養箱212，所述培養容器211用于容納含 有特異性反應底物的培養液；由于本實施例是對水體中的大腸桿菌進行檢測，只要培養容 器211對檢測細菌光度信息時的光度信號不會產生影響即可；本實施例是檢測培養液在 420nm波長處的吸光度或者透光率，選用培養容器的材料為無色透明硼硅酸玻璃材料，該材 料的截止波長為300nm左右，對420nm左右的光均是透明的；所述培養箱212為可容納所述培養容器211的用于調節和控制細菌培養條件的箱 體，用于細菌培養過程的環境條件控制；所述培養箱212也可以同時容納檢測單元，以使檢測單元在培養箱內能夠檢測培 養容器211內培養液的光度信息；所述檢測單元包括光發射模塊311和光接收模塊312 ；在測量時，光發射模塊311 和光接收模塊312分別設置在培養容器211相對的兩側；由于本實施例是檢測培養液在 420nm波長處的吸光度或者透光率，則所述檢測單元能夠發射和檢測420nm左右的光即可；所述檢測單元設置在培養單元2的外部，所述光發射模塊311和光接收模塊312 處于光路相對的測量狀態；當需要測量時，將培養容器211從培養箱212中拿出放入檢測單 元中光發射模塊311和光接收模塊312形成的測量光路中，對細菌培養過程中培養液的光 度信息進行間斷檢測；或將檢測單元31及分析單元4放入培養箱212內，使光發射模塊311和光接收模 塊312分別置于培養容器211相對的兩側，在細菌培養過程中，對培養液的光度信息進行間 斷或連續檢測；本實施例中，檢測單元設置在培養單元2的外部；分析單元4與光接收模塊312相連，對光接收模塊312傳來的培養液的信號進行 分析，并得出樣本中的細菌信息。本實施例還提供了一種細菌檢測方法，采用本實施例的細菌檢測裝置，包括以下 步驟a、采樣步驟在采樣現場，直接將過濾器11連接至樣本源上，本實施例樣本源為水龍頭；在水 龍頭自身壓力(0. 1 ;3bar)的驅動下，水樣通過連接器112進入過濾器11并從過濾膜111 的濾孔排出，水樣中的細菌被截留在過濾膜111的內壁上并積累；計量通過過濾器11的樣本總體積；本實施例中，樣本總體積為IL ；b、培養及檢測步驟，具體如下bl、培養步驟在現場，將積累有細菌的過濾器11放入培養容器211中的培養液中，所述培養液 含有反應底物ONPG(Orthonitrophenyl β -D galactopyranoside)，目標細菌為總大腸菌 群；所述反應底物ONPG對目標細菌代謝物具有特異性；
將培養箱212的溫度調節至35. 5°C，將內置過濾器11的培養容器211放入培養箱 212 內；培養液通過過濾膜111的微孔進入到所述過濾器11內，將截流在過濾膜111內壁 上的細菌浸潤；細菌被限制在過濾器11內，在培養液的浸潤下生長繁殖并產生代謝物，代 謝物中包括分泌的特定酶部分細菌分泌的特定酶在過濾器11內特異性地將培養液中的反應底物分解，釋 放出特征指示物，該特征指示物通過過濾膜111上的微孔擴散至過濾器11外；部分細菌分泌的特定酶也通過過濾膜111上的微孔擴散至過濾器11外，并將過濾 器11外培養液中的反應底物分解，釋放出特征指示物；隨著細菌的生長增殖，前述兩部分特征指示物在培養液中逐步累積；若被測水樣中存在目標細菌即總大腸菌群，則在培養過程中該類細菌將分 泌β-D半乳糖苷酶(β-D galactosidase)，該酶將特異性地切斷ONPG分子并釋放出 ONP(Orhonitrophenyl)分子，導致ONP分子在培養液內累積；若被測水樣中不存在總大腸 菌群，則在培養過程中不釋放出ONP分子；b2、檢測步驟對細菌培養12小時后，將培養容器211從培養箱212內取出，放入檢測單元的光 發射模塊311和光接收模塊312形成的測量光路中，對細菌培養過程中培養液的光度信息 進行間斷檢測；檢測培養液在420nm波長處的吸光度或者透光率，分析單元4處理光接收模 塊312傳來的信號，得出特征指示物ONP的濃度信息若最終培養液吸光度達到0. 05Unit，表明被測水樣中目標細菌即總大腸菌群的濃 度高于1個/lOOmL，則可認為被測水樣中存在目標細菌；若吸光度小于0. 05Unit，表明被測 水樣中目標細菌即總大腸菌群的濃度低于1個/lOOmL，則可認為被測水樣中不存在目標細菌。采用本實施例的方法采樣時，水體中的細菌共存微生物也被截留在過濾膜內壁 上；則在進行培養步驟時，所有細菌被限制在過濾器內生長，共存微生物不會對過濾器外的 培養液產生影響，而檢測單元僅對過濾器外的培養液進行檢測，消除了共生細菌繁殖形成 的菌濁對光電檢測的干擾，從而提高了檢測結果的準確性。實施例2請參閱圖4，一種細菌檢測裝置，與實施例1所述檢測裝置不同的是本實施例檢 測裝置還包括密封袋及冷藏箱，對采樣后的過濾器12在運輸過程中保存；過濾膜121為等效過濾孔徑為0. Ium的親水性特氟隆濾膜；檢測單元的光發射模塊321能發射波長為365nm的光，光接收模塊322能檢測波 長為450nm的光；培養容器221為無色透明聚碳酸酯材料，對檢測單元的發射光和接收光透 明；在測量時，將培養容器221從培養箱212中取出放入設置在培養單元外的檢測單 元的測量光路中，對細菌培養過程中的培養液進行間斷檢測，或將檢測單元和分析單元4 放入培養箱212內，在細菌培養的過程中，對培養液的光度信息進行間斷或連續檢測；本實 施例中，檢測單元和分析單元4設置在培養箱212內。本實施例還提供了一種細菌檢測方法，與實施例1所述檢測方法不同的是
采用本實施例的細菌檢測裝置；在步驟a中，在現場，樣本中的細菌被截留在過濾膜121的內壁上并積累；計量通過過濾器12的樣本總體積；本實施例中，樣本總體積為1. 5L ；將截流細菌后的過濾器12裝入密封袋內，并放入冷藏箱內(溫度保持在4 10 攝氏度內)保存，然后帶回實驗室；本實施例為水樣；在步驟b中，在實驗室，將積累有細菌的過濾器12從冷藏箱內取出，并去除密封 袋，放入培養容器221中的培養液中，本實施例中培養液含有反應底物MUGG-甲基傘形 酮-β -D葡萄糖苷酸)，目標細菌為大腸桿菌；將培養箱212的溫度調節至35. 5°C，將內置過濾器12的培養容器221放入培養箱 212 內；培養液通過過濾膜121的微孔進入到所述過濾器12內，將截流在過濾膜121內壁 上的細菌浸潤；細菌被限制在過濾器12內，在培養液的浸潤下生長繁殖并產生代謝物，代 謝物中包括分泌的特定酶若被測樣本中存在目標細菌即大腸桿菌，則在培養過程中該類細菌將分泌 β -D-葡糖醛酸糖苷酶，該酶將特異性地切斷MUG分子并釋放出MU (4-甲基傘形酮)分子， 導致MU分子在培養液內累積；若被測水樣中不存在大腸桿菌，則在培養過程中不釋放出MU 分子；同時，檢測單元的光發射模塊321和光接收模塊322設置在培養箱212內培養容 器221相對的兩側，實時檢測培養液的熒光信息(激發波長為365nm，發射波長為450nm)， 以獲取特征指示物MU的濃度隨時間的變化信息；當培養液的熒光強度增大并達到設定的閾值0. OlRF時培養結束，記錄從開始培 養至培養結束所消耗的時間，結合培養消耗時間與細菌濃度之間的關系式可推算出被測水 樣中目標細菌即大腸桿菌的濃度；培養消耗時間與細菌濃度之間的關系式可通過對一系列 水樣按前述方法與平板計數法對比獲得。采用本實施例的方法對細菌進行檢測，不僅能夠排除共生微生物對細菌檢測的影 響；且采用特殊設計的過濾器過濾樣本，采集樣本中的細菌，采集操作可以在檢測取樣點現 場進行，并可將采集得到的樣本中的細菌帶回實驗室進行培養及檢測，從而解決了大體積 樣本運輸和存儲不便的問題。實施例3請參閱圖5、圖6，一種細菌檢測裝置，與實施例1所述的檢測裝置不同的是所述 檢測裝置還包括驅動泵5，所述驅動泵5將驅動樣本進入過濾器11 ；檢測單元和分析單元4設置在培養箱內；光發射模塊311和光接收模塊312設置 在培養箱212內培養容器211相對的兩側，能夠發射和檢測405nm波長的光。本實施例還提供了一種細菌檢測方法，與實施例1所述檢測方法不同的是采用本實施例所述的細菌檢測裝置；在步驟a中，從現場采集1. 5L樣本，并帶回實驗室對樣本進行細菌截留累積操 作采用驅動泵5驅動從現場采回的樣本，使其進入過濾器11，樣本中的細菌被截留 在過濾膜111的內壁上并積累；本實施例中樣本為水樣；
在步驟b中，將培養箱212的溫度調節至37°C，對細菌進行培養；本實施例中培養 液含有反應底物Boc-Ie和u-Gly-Arp-p，目標細菌為凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌；若樣本中存在目標細菌即凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌，則在培養過程中該類細 菌將分泌凝固酶，該酶將特異性地催化Boc-Ie和u-Gly-Arp-p反應，產生有色的對硝基苯 胺(nitroa-niline，PNA)，導致PNA分子在培養液內累積；若被測水樣中不存在凝固酶陽性 的金黃色葡萄球菌，則在培養過程中不釋放出PNA分子；檢測單元的光發射模塊311和光接收模塊312設置在培養箱212內培養容器211 相對的兩側，實時檢測培養液在405nm波長處的吸光度或者透光率，分析單元4處理光接收 模塊傳來的信號，從而獲取特征指示物PNA分子的濃度信息；若最終培養液吸光度大于等 于0. lUnit，則表明被測水樣中存在目標細菌即凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌；若吸光度 小于0. lUnit，則表明被測水樣中不存在凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌。實施例4一種細菌檢測裝置，與實施例2所述檢測裝置不同的是所述檢測裝置還包括驅 動泵5，所述驅動泵5將驅動樣本進入過濾器12。本實施例還提供了一種細菌檢測方法，與實施例2所述的檢測方法不同的是采用本實施例所述的細菌檢測裝置；在步驟a中，從現場采集2L樣本，并帶回實驗室對樣本進行細菌累積采用驅動泵5驅動從現場采回的樣本，使其進入過濾器12，樣本中的細菌被截留 在過濾膜121的內壁上并積累；在步驟b中，將培養箱212的溫度調節至45°C，對細菌進行培養；本實施例中培養 液含有反應底物MUGalG-甲基傘形酮-β-D半乳糖苷酸)，目標細菌為糞大腸菌群；若樣本中存在目標細菌即糞大腸菌群，則在培養過程中該類細菌將分泌β-D-半 乳糖苷酶，該酶將特異性地切斷MUGal分子并釋放出MU分子，導致MU分子在培養液內累 積；若被測水樣中不存在糞大腸菌群，則在培養過程中不釋放出MU分子；同時，檢測單元的光發射模塊321和光接收模塊322設置在培養箱212內培養容 器221相對的兩側，實時檢測培養液的熒光信息(激發波長為365nm，發射波長為450nm)， 以獲取特征指示物MU的濃度隨時間的變化信息；當培養液的熒光強度增大并達到設定的閾值0. OlRF時培養結束，記錄從開始培 養至培養結束所消耗的時間，結合培養消耗時間與細菌濃度之間的關系式可推算出被測水 樣中目標細菌即糞大腸桿菌的濃度；培養消耗時間與細菌濃度之間的關系式可通過對一系 列水樣按前述方法與平板計數法對比獲得。上述實施方式不應理解為對本發明保護范圍的限制。本發明的關鍵是在采樣過 程中將細菌截留在過濾器內膜上，在對細菌培養時，其共生微生物也被限制在過濾器內，而 不會對培養液的信息產生影響，從而使檢測得到的培養液的信息能夠更準確地反應細菌存 在的狀況，使對細菌的檢測更準確。在不脫離本發明精神的情況下，對本發明做出的任何形 式的改變均應落入本發明的保護范圍之內。
權利要求
1. 一種細菌檢測方法，包括以下步驟a、采樣步驟待測樣本通過過濾器，樣本中的細菌在過濾器內積累；計量通過過濾器的樣本總體積；b、培養及檢測步驟將積累有細菌的過濾器放入培養液中，細菌被限制在過濾器內生長繁殖并產生代謝 物，目標細菌產生的代謝物與培養液中的底物發生特異性反應；檢測培養液的信息，得到被測樣本中目標細菌的信息。
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述樣本為水樣。
3.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于在現場進行步驟a，再將積累有細菌 的過濾器帶回實驗室，再進行步驟b。
4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于檢測培養液中對目標細菌代謝物具 有特異性的底物變化信息。
5.根據權利要求1或4所述的檢測方法，其特征在于在步驟b中，檢測培養液的吸光 度或透光率或熒光強度。
6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于在步驟b中，根據檢測得到的培養液的信息，判斷樣本中是否含有細菌；或根據連續檢測得到的培養液的信息隨時間變化的關系，得出細菌的濃度。
7. —種細菌檢測裝置，包括培養單元、檢測單元和分析單元，其特征在于所述檢測裝 置還包括過濾器；所述過濾器用于截留樣本中的細菌；所述過濾器放置在培養單元中時， 所述培養單元中的培養液和細菌代謝物能夠透過所述過濾器。
8.根據權利要求7所述的檢測裝置，其特征在于所述樣本為水樣。
9.根據權利要求7所述的檢測裝置，其特征在于所述檢測裝置還包括驅動泵，以驅動 樣本進入過濾器。
10.根據權利要求7所述的檢測裝置，其特征在于所述檢測裝置還包括冷藏箱，對截 留細菌后的過濾器冷藏。
全文摘要
本發明涉及一種細菌檢測方法，包括以下步驟a、采樣步驟待測樣本通過過濾器，樣本中的細菌在過濾器內積累；計量通過過濾器的樣本總體積；b、培養及檢測步驟將積累有細菌的過濾器放入培養液中，細菌被限制在過濾器內生長繁殖并產生代謝物，目標細菌產生的代謝物與培養液中的底物發生特異性反應；檢測培養液的信息，得到被測樣本中目標細菌的信息。本發明還提供了一種細菌檢測裝置。本發明具有采樣方便、消除共存物干擾、檢測結果準確等優點。
文檔編號C12Q1/02GK102094062SQ20101056598
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月19日 優先權日2010年11月19日
發明者項光宏 申請人:聚光科技(杭州)股份有限公司