專利名稱：一種細菌的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種細菌的檢測方法和一種用于細菌 檢測的凝集素修飾的金納米粒子及一種用于細菌檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
當(dāng)今社會，病毒性感染疾病有愈演愈烈之勢，但細菌感染仍然是人類健康的一大 威脅。例如結(jié)核病造成的死亡仍然位居世界第一位，并且有卷土重來的跡象；食品來源的沙 門氏菌、李斯特氏菌和大腸桿菌等是造成腹瀉的重要因素；引起肺炎的幾種病原如肺炎克 雷伯氏菌、肺炎雙球菌、肺炎衣原體、肺炎支原體等往往對抵抗力低下、年老或年幼人群構(gòu) 成極大威脅；金黃色葡萄球菌感染十分頑固，而且耐藥性十分普遍；腦炎球菌對抵抗力尚 不十分完善的兒童威脅較大。隨著細菌耐藥性的不斷增強，生物恐怖主義隱現(xiàn)以及食品污 染等影響日常生活，傳染病的威脅越來越受到人們的關(guān)注，因此發(fā)展有效的細菌檢測方法 對公共衛(wèi)生有重要意義。細菌的檢測方法多種多樣，目前細菌分類鑒定的常規(guī)方法主要依賴于細菌培養(yǎng)、 染色以及顯微觀察技術(shù)，但是細菌需要進行分離、培養(yǎng)以及一系列的生物化學(xué)檢測使得 該方法非常耗時(Manual of Clinical Microbiology, 9th ed. , Am. Soc. Microbiol. Washington,D. C.，2007)。此外，還有核酸(DNA標記探針、PCR等)技術(shù)和抗體檢測(ELISA 酶聯(lián)免疫檢測、免疫熒光等)技術(shù)等，但上述方法屬于一對一的檢測模式，即一種標記探針 只能檢測一種細菌。因此，亟待發(fā)展高效的細菌識別檢測技術(shù)。生物芯片是目前基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具。生物芯片以其高通量、 敏感、準確的特點，越來越多地應(yīng)用于細菌快速檢測以及細菌糖組學(xué)的動力學(xué)研究(Nat. Chem. Biol.，2006，2，153-157)。但目前，生物芯片主要以熒光為檢測手段，在檢測靈敏度、 選擇性等方面尚存在一定的缺點，因而發(fā)展生物芯片的檢測新方法對其發(fā)展有重要意義 (Nature,2007，4，437-444)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有的檢測方法靈敏度和選擇性欠佳的缺陷，提供 一種靈敏度和識別度更高的細菌的檢測新方法。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種細菌的檢測方法，包括以下步驟步驟1 提供對照細菌樣品；步驟2 固定有一種以上凝集素的固體支持物分別與待測樣品和對照細菌樣品充 分作用，洗滌除去固體支持物上未結(jié)合的樣品；步驟3 洗滌后的固體支持物與凝集素修飾的金納米粒子充分作用，洗滌除去固 體支持物上未結(jié)合的金納米粒子；步驟4:檢測固體支持物上結(jié)合的金納米粒子的共振光散射信號，與細菌標準品共振光散射信號比較，分析待測樣品細菌種類。細菌表面覆蓋著多種不同糖綴合物，如糖蛋白、糖脂、糖胺聚糖和蛋白多糖等，而 且不同細菌表面覆蓋糖基的種類不完全相同，如大腸桿菌表面覆蓋有唾液酸、巖藻糖、末端 乙酰氨基半乳糖、α-半乳糖、末端乙酰葡萄糖和α-甘露糖等糖基，而與大腸桿菌不同，枯 草芽孢桿菌表面除覆蓋有唾液酸、巖藻糖、末端乙酰氨基半乳糖、α -半乳糖、末端乙酰葡萄 糖和α -甘露糖等糖基外，還存在葡萄糖-β -1，4葡萄糖低聚物。凝集素(lectin)是從各種植物、無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結(jié) 合糖的蛋白，能識別單糖或寡糖中特定的糖基序列，并與之結(jié)合，常用于寡糖和糖復(fù)合物 的分離純化和糖鏈的結(jié)構(gòu)分析。目前發(fā)現(xiàn)的凝集素有100多種，常用的為植物凝集素 (Phytoagglutin, PNA)，通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A、麥胚素、花生凝集素和大 豆凝集素等，凝集素是它們的總稱。一種凝集素可以識別一種或幾種特定的糖基序列，并 與之結(jié)合。如蓖麻凝集素I可以識別半乳糖-β (1,4)葡萄糖(Gali3 (1,4) GlcNAc β 1)糖 基，大豆凝集素可以特異性識別末端乙酰氨基半乳糖(Terminal GalNAc)糖基，麥胚凝集 素可以特異性識別β-乙酰葡萄糖胺、唾液酸和乙酰氨基半乳糖糖基(β-GlcNAc，sialic acid, GalNAc)。本發(fā)明所述細菌的檢測方法在固體支持物上固定有一種以上不同種類的凝集素， 利用凝集素-糖類物質(zhì)相互作用識別具有不同糖基的細菌，將與凝集素結(jié)合的細菌固定在 固體支持物上，以凝集素修飾的金納米粒子作為細菌標記物，利用共振光散射技術(shù)檢測細 菌表面金納米粒子的共振光散射信號，然后通過將待測樣品的共振光散射信號與對照細菌 樣品的共振光散射信號比較，分析待測樣品細菌種類，實現(xiàn)細菌的定性分析。其中，凝集素 修飾的金納米粒子為金納米粒子直接或間接與凝集素結(jié)合形成的帶有凝集素的金納米粒 子。本發(fā)明所述凝集素可以為目前發(fā)現(xiàn)的凝集素中的任意一種。其中，作為優(yōu)選， 所述凝集素為蓖麻凝集素I (Ricinus Communis Agglutinin)、山槐黃柏苷凝集素I和 II (Maackia Amurensis Agglutinin)、笄[J豆凝集素 I (Ulex Europaeus Agglutinin)、大豆 凝集素(Soybean Agglutinin)、雞冠珊瑚樹凝集素(Erythrina Cristagalli Lectin)、 接骨木凝集素(Sambucus Nigra Lectin)、西非單葉豆凝集素I和II (Griffonia simplicifolia)、麥胚凝集素(Wheat Germ Agglutinin)、刀豆素 A(Conconvalina)、 橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(Aleuria Aurantia Lectin)、喇叭水仙凝集素(Narcissus Pseudonarcissus Lectin)、蔓陀蘿^疑集素(Datura stramonium Lectin)、扁豆^疑集素 (Lens Culinaris Agglutinin)或花生凝集素(Phaseolus Vulgaris Agglutinin)。共振光散射技術(shù)(RLQ是近年迅速發(fā)展起來的新的儀器分析技術(shù)，因其靈敏度 高，操作簡單等顯著特點而廣泛應(yīng)用。隨著金納米粒子周圍的環(huán)境變化，其共振光散射信號 的強度不同，由此可以檢測細菌表面金納米粒子結(jié)合強度。因金納米粒子對周圍環(huán)境的變 化反應(yīng)迅速，故檢測的靈敏度和準確性高，因此該方法還可實現(xiàn)細菌的半定量分析，并且可 應(yīng)用于檢測不同環(huán)境下的細菌。作為優(yōu)選，所述金納米粒子半徑為IOnm 13nm。優(yōu)選的，所述檢測共振光散射信號之前還包括增強信號步驟，以進一步提高檢測 靈敏度。
作為優(yōu)選，所述增強信號步驟具體為與銀增強溶液反應(yīng)5 lOmin，18. 2ΜΩ水洗 滌，其中，所述的銀增強溶液是美國西格瑪(Sigma)公司生產(chǎn)的銀增強溶液A與銀增強溶液 B按體積比1 1混合所得，即制即用。本發(fā)明所述18. 2MΩ水是指絕對純水。MΩ是指水的電阻率，表示高純水水質(zhì)的參 數(shù)，指某一溫度下橫截面積是Icm2長度是Icm的水的電阻，其單位為歐姆*厘米(Ω *CM)， 電阻率越高表明鹽份越少。絕對純水在25°C的理論值為18.2MQ*CM，測定值與溫度有關(guān)， 溫度越高，電阻率越低，反之越高。本發(fā)明還提供了一種用于細菌檢測的凝集素修飾的金納米粒子，金納米粒子直接 或間接與凝集素結(jié)合。本發(fā)明所述金納米粒子與凝集素可以通過多種方式結(jié)合在一起，包括金納米粒子 與凝集素通過直接或間接形成離子鍵、共價鍵或配位鍵而結(jié)合形成凝集素修飾的金納米粒 子。本發(fā)明還提供了一種凝集素修飾的金納米粒子的制備方法，包括步驟1 金納米粒子與多肽反應(yīng)，得到多肽修飾的金納米粒子，所述多肽為
biotin
Cys-Ala-Leu-Asn-Asn 和廣 Αι τ ▲ ▲Tl ^ 摩爾比為 9 1 的混合物；
Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly步驟2 多肽修飾的金納米粒子與親和素反應(yīng)，得到親和素修飾的金納米粒子；步驟3 生物素與凝集素反應(yīng)，得到生物素修飾的凝集素；步驟4 親和素修飾的金納米粒子與生物素修飾的凝集素反應(yīng)，得到凝集素修飾 金納米粒子。本發(fā)明多肽混合物為CyS-Ala-LeU-ASn-ASn(胱氨酰丙氨酰亮氨酰天冬酰胺酰天
biotin
冬酰胺)和r A1 T A AI (胱氨酰丙氨酰亮氨酰天冬酰胺酰天冬酰胺
Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly
酰甘氨酰賴氨酰(生物素)甘氨酸)摩爾比為9 1的混合物。Cys-Ala-Leu-Asn-Asn與金表面有很強的親和性，能夠形成致密的保護層，使金納
米粒子溶于水，并可以保持長期穩(wěn)定性。
biotin^ αι τ A AI ^能夠高效且有針對性的聚集在指定位置。 Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生 物素分子親密結(jié)合，結(jié)合后兩者形成的鍵穩(wěn)定很難斷裂。親和素-生物素是目前發(fā)現(xiàn)的最 穩(wěn)定的配合物。本發(fā)明以親和素與多肽修飾的金納米粒子共價結(jié)合，再利用親和素與生物素間形 成的穩(wěn)定的配位鍵，與生物素修飾的凝集素結(jié)合，將凝集素連接到多肽修飾的金納米粒子 上，獲得凝集素修飾的金納米粒子，可作為標記物特異性識別糖類物質(zhì)，應(yīng)用于糖類物質(zhì)的 識別和檢測。在一個具體實施方案中本發(fā)明所述生物素修飾的凝集素為市售的生物素修飾 的GS-II凝集素。優(yōu)選的，所述金納米粒子半徑為IOnm 13nm。本發(fā)明還提供了利用上述制備方法制備的凝集素修飾金納米粒子。本發(fā)明還提供了一種用于細菌檢測的試劑盒，包括凝集素修飾的金納米粒子和凝集素生物芯片，所述凝集素生物芯片通過將一種以上的凝集素固定在固體支持物上得到， 所述凝集素修飾的金納米粒子為上述直接或間接與凝集素結(jié)合的金納米粒子。凝集素生物芯片屬于糖類物質(zhì)生物芯片，是繼基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片等 之后發(fā)展起來的一種很有前景的生物檢測技術(shù)，具有檢測樣品用量少、高通量和特異性高 等優(yōu)點。在一個實施方案中，所述凝集素生物芯片，為4X4排布的16個子陣列，其中每個 子陣列包括4個結(jié)合位點。作為優(yōu)選，所述固體支持物為玻片。按照本發(fā)明，玻片優(yōu)選為本領(lǐng)域人員熟知的二 氧化硅玻璃片或有機硅半導(dǎo)體玻片，本發(fā)明不做限定，所述玻片的表面修飾有環(huán)氧基團，可 與凝集素發(fā)生共價反應(yīng)。本發(fā)明所述用于細菌檢測的凝集素生物芯片的制備方法，為取不同種類的凝集素 在固體支持物上點樣，25°C 37°C靜置4h 16h，得到凝集素生物芯片。優(yōu)選的，所述用于細菌檢測的凝集素生物芯片的制備方法還包括洗滌和封閉步 驟。所述封閉為在25°C 37°C與封閉溶液反應(yīng)Ih 池，以封閉未凝集素的結(jié)合部位，以減 少非特異性結(jié)合背景的影響。常用的封閉液中含有脫脂奶粉、小牛血清等。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述封閉溶液為包括40mmol/L 60mol/L牛血清蛋白、0. Imol/ L 0. 2mol/L乙醇胺以及0. 15mol/L 0. 2mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液。在一個實施方案中，所述用于細菌檢測的凝集素生物芯片制備過程為將16種不 同凝集素噴點于4X4排布16個子陣列的環(huán)氧玻片上，每個子陣列包括4個結(jié)合位點，分別 噴點相同的凝集素。之后噴點了凝集素的玻片在25°C 37°C反應(yīng)4h 16h，磷酸鹽緩沖 溶液洗滌玻片，然后浸泡于含有40mM 60mM牛血清蛋白(BSA)、0. IM 0. 2M乙醇胺以及 0. 15M 0. 2M氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液的封閉溶液中，25°C 37°C下反應(yīng)Ih 2h，制得凝 集素生物芯片。在一個具體實施方案中，本發(fā)明以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、陰溝腸桿菌和金黃葡 萄球菌為對照細菌樣品，利用本發(fā)明所述細菌的檢測方法分別檢測對照細菌樣品和待測樣 品的共振光散射指紋圖譜及信號強度，通過比較待測樣品與對照細菌樣品的共振光散射指 紋圖譜及信號強度，定性分析待測樣品的細菌種類。在一個具體實施方案中，本發(fā)明還用所述的檢測方法分別對不同濃度的大腸桿 菌、枯草芽孢桿菌、陰溝腸桿菌和金黃葡萄球菌進行檢測，結(jié)果顯示大腸桿菌、金黃葡萄球 菌和枯草芽孢桿菌檢測限為103，陰溝腸桿菌測限為104，并且不同濃度的對照細菌樣品其 共振光散射指紋圖譜相似，而共振光散射信號強度不同，表明本發(fā)明所述細菌的檢測方法 檢測樣品用量少，檢測靈敏度高，可實現(xiàn)細菌半定量分析。本發(fā)明所述細菌的檢測方法具有通用性，并且靈敏度高、樣品消耗量少、穩(wěn)定性 好，可實現(xiàn)細菌的定性及半定量分析。本發(fā)明所述用于細菌檢測的凝集素修飾金納米粒子 穩(wěn)定性高、生物相容性好，制備方法簡單、快速。本發(fā)明所述用于細菌檢測的試劑盒制備方 法簡單、使用方便，適合廣泛推廣與應(yīng)用。


圖1示凝集素生物芯片微陣列排列圖，相應(yīng)編號代表的凝集素見表1 ；
圖2示實施例6對照細菌樣品大腸桿菌的共振光散射指紋圖譜；圖3示實施例6對照細菌樣品大腸桿菌的共振光散射強度圖；圖4示實施例6對照細菌樣品枯草芽孢桿菌的共振光散射指紋圖譜；圖5示實施例6對照細菌樣品枯草芽孢桿菌的共振光散射強度圖；圖6示實施例6對照細菌樣品陰溝腸桿菌的共振光散射指紋圖譜；圖7示實施例6對照細菌樣品陰溝腸桿菌的共振光散射強度圖；圖8示實施例6對照細菌樣品金黃葡萄球菌的共振光散射指紋圖譜；圖9示實施例6對照細菌樣品金黃葡萄球菌的共振光散射強度圖；圖10示實施例6待測樣品的共振光散射指紋圖譜；圖11示實施例6待測樣品的共振光散射強度圖；圖12示實施例7不同濃度大腸桿菌的共振光散射指紋圖譜，大腸桿菌濃度分別 為a、106，b、105，c、104，d、103，e、102 ；
具體實施例方式本發(fā)明實施例公開了一種細菌的檢測方法、用于細菌檢測的凝集素修飾金納米粒 子及其制備方法和用于細菌檢測的試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進 工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而 易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品和方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描 述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品和方法進行改 動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1 凝集素生物芯片的制備由北京博奧生物技術(shù)有限公司提供的SmartArrayerfS芯片制作系統(tǒng)上制作并處 理凝集素生物芯片。取16種濃度為lmg/mL的凝集素噴點于環(huán)氧基修飾的玻片上，在25°C 37°C真空條件下反應(yīng)4h，凝集素種類及其特異性識別的糖基見表1。凝集素生物芯片微陣 列排列圖見圖1。然后用含有體積濃度為0. 05%吐溫-20,0. 15mol/L NaCl和pH值為8. 0 的50mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗滌玻片，再用含有60mol/L牛血清蛋白(BSA)、0. lmol/L乙 醇胺以及0. 2mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖溶液，25°C 37°C下反應(yīng)lh，封閉芯片得到凝集素 生物芯片。為獲得好的陣列點并保持生物分子的活性，點樣液含有體積濃度為15%甘油， IOmol/L單糖，0. 15mol NaCl和pH值為8. 0的50mol/L磷酸鹽緩沖溶液。表1.凝集素以及相應(yīng)糖基的特異性結(jié)合
權(quán)利要求
1.一種細菌的檢測方法，包括以下步驟 步驟1 提供對照細菌樣品；步驟2 固定有一種以上凝集素的固體支持物分別與待測樣品和對照細菌樣品充分作 用，洗滌除去固體支持物上未結(jié)合的樣品；步驟3:洗滌后的固體支持物與凝集素修飾的金納米粒子充分作用，洗滌除去固體支 持物上未結(jié)合的金納米粒子；步驟4 檢測固體支持物上結(jié)合的金納米粒子的共振光散射信號，與對照細菌樣品共 振光散射信號比較，分析待測樣品細菌種類。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述凝集素為蓖麻凝集素I、山槐黃柏苷凝 集素、荊豆凝集素、大豆凝集素、雞冠珊瑚樹凝集素、接骨木凝集素、西非單葉豆凝集素、麥 胚凝集素、刀豆素A、橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素、喇叭水仙凝集素、蔓陀蘿凝集素、扁豆凝集素或 花生凝集素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述金納米粒子半徑為IOnm 13nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述檢測共振光散射信號之前還包括增強信號步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述增強信號步驟具體為與銀增強溶液反 應(yīng)5 lOmin，18. 2ΜΩ水洗滌。
6.一種用于細菌檢測的凝集素修飾的金納米粒子，其特征在于，金納米粒子直接或間 接與凝集素結(jié)合。
7.一種凝集素修飾的金納米粒子的制備方法，包括步驟1 金納米粒子與多肽反應(yīng)，得到多肽修飾的金納米粒子，所述多肽為biotinCys-Ala-Leu-Asn-Asn 和廣 Αι τ ▲ ▲Tl ^ 摩爾比為 9 1 的混合物；Cys-Ala-Leu-Asn-Asn-Gly-Lys-Gly步驟2 多肽修飾的金納米粒子與親和素反應(yīng)，得到親和素修飾的金納米粒子； 步驟3 生物素與凝集素反應(yīng)，得到生物素修飾的凝集素；步驟4:親和素修飾的金納米粒子與生物素修飾的凝集素反應(yīng)，得到凝集素修飾的金 納米粒子。
8.權(quán)利要求7所述制備方法制備的凝集素修飾的金納米粒子。
9.一種用于細菌檢測的試劑盒，包括權(quán)利要求6或8所述凝集素修飾的金納米粒子和 凝集素生物芯片，所述凝集素通過將一種以上的凝集素固定在固體支持物上得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種細菌的檢測方法，具體為提供對照細菌樣品；固定有一種以上凝集素的固體支持物分別與待測樣品和對照細菌樣品充分作用，洗滌除去固體支持物上未結(jié)合的樣品；洗滌后的固體支持物與凝集素修飾的金納米粒子充分作用，洗滌除去固體支持物上未結(jié)合的金納米粒子；檢測固體支持物上結(jié)合的金納米粒子的共振光散射信號，與對照細菌樣品共振光散射信號比較，分析待測樣品細菌種類。本發(fā)明所述細菌的檢測方法具有通用性，并且靈敏度高、樣品消耗量少、穩(wěn)定性好，可實現(xiàn)細菌的定性及半定量分析。本發(fā)明還提供了穩(wěn)定性高、生物相容性好的凝集素修飾的金納米粒子以及制備方法簡單、使用方便的用于細菌檢測的試劑盒。
文檔編號C12Q1/04GK102108375SQ20101059308
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者劉殿駿, 王振新, 高晶清 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所