專利名稱：一種可提高轉基因作物細菌抗性的基因GhMKK5及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶激酶基因GhMKK5的克隆、重組及在提高轉基因煙草細菌抗性的應用，屬于分子生物學和生物技術領域。
背景技術：
細菌性病害是由細菌病菌侵染所導致的病害，防治難度比較大。我國主要的細菌性作物病害有60-70種，病害分布范圍極廣，能夠侵染多種植株。感病植株往往發(fā)病部位廣(根、莖、葉均可發(fā)病)、死亡率高、傳播性強，造成農作物大量減產甚至絕產。因此，細菌性病害的防治工作已經成為一個世界性的難題并越來越受到人們的重視。早期細菌性病害的防治措施主要集中在施用化學農藥、改善栽培管理技術及選育抗病品種等方面。然而， 長期施用大量化學農藥不但造成了嚴重的環(huán)境污染，而且影響了農作物的品質，危害了人體健康；改善的栽培管理技術受地域條件等因素的限制不能被廣泛采用；傳統(tǒng)的育種方式由于育種周期長、工作量大、成本高等弊端也越來越受到限制。近年來，分子生物學和基因工程技術的迅速發(fā)展為作物疾病的防治提供了新的思路。相對于傳統(tǒng)的品種選育方法，轉基因技術的應用具有快速、高效的優(yōu)點，能夠大大縮短品種選育的周期，克服雜交不親和的障礙。但是，目前轉基因技術仍然存在一定的弊端，尤其是抗病轉基因植物的研究還不完善。植物自身存在許多抗病或與抗病相關的基因，這些基因是植物應對病原菌入侵的關鍵因子，然而將單一的抗病目的基因轉入植物中往往不能達到理想的防治效果。梁元發(fā)等將抗菌肽基因(天蠶-Hyalophora cecropia Cecropin)轉入馬鈴薯脫毒微型薯塊中，結果發(fā)現(xiàn)轉基因株系間抗性差異過大，某些株系仍然高度感病(梁元發(fā)等，2004)。因此，植物自身各方面防御性的提高才是增強植物抗病能力最根本的措施。而植物一般是通過某些基因的表達來激活信號通路或信號傳導網絡來提高植物的防御力。目前，有關信號通路相關的基因已成為植物轉基因研究的熱點。促絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應途徑是真核生物中保守的信號傳導模式，在胞內細胞信號的傳導過程中發(fā)揮著重要的作用。它能夠響應環(huán)境壓力、機械損傷、植物激素、病原物侵染等多種刺激，促使植物產生相應的免疫性，增強植物自身的防御系統(tǒng) (Mizoguchi et al. ,1998；Burnett et al. ,2000 ；Ahlfors et al. ,2004 ；Asai et al., 2002)。MAPKK位于MAPK級聯(lián)系統(tǒng)的中游，它接受MAPKKK的信號后再通過雙磷酸化作用激活其特異的MAPK，從而調節(jié)特異基因的表達，使植物能夠響應多種脅迫刺激。然而，目前國內外尚沒有關于棉花MAPKK應用于改良作物農藝性狀的報道。棉花作為世界上最重要的經濟作物之一，生產成本低，應用價值高，但是它的生長和產量嚴重受到病原物侵染的抑制。關于棉花功能基因，特別是抗性基因的研究不僅可以為植物基因工程提供優(yōu)良的基因源，而且對于棉花遺傳改良、提高其抗病性也具有重要的現(xiàn)實意義。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的旨在提供一種棉花抗細菌病害相關基因GhMKK5，同時提供該基因在抗細菌，尤其是青枯病害及細菌性斑點病害的轉基因煙草中的應用，并應用于生產其它具有明顯抵抗細菌病害能力的轉基因植物。本發(fā)明中提供的核苷酸序列來自棉花。本發(fā)明利用同源克隆和RACE技術獲得了棉花抗細菌病害相關基因GhMKK5，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，蛋白質氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。具體方法如下本發(fā)明從棉花幼葉中提取總RNA，反轉錄得到cDNA。根據(jù)國際基因庫(GenBank)中已發(fā)布的其它植物中促絲裂原活化蛋白激酶基因的保守氨基酸序列，設計簡并引物，序列如下MP 1:AARGTNATHGGNAARGGMP2 CCCAARCTCCAVATRTCNCT其中，R= A, G ;H = A, T, C ;V = G, A, C ;N = Α, Τ, C, G利用上述簡并引物進行常規(guī)聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)。將PCR產物與克隆載體(pMDIS-T)連接后轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，然后篩選重組子，進行序列分析。根據(jù)獲得的序列設計引物，引物序列如下5Ρ1 GACTTTGTAAACGGTGCCTCC5Ρ2 CAAGGCGTTGGAGTTGGAG3Ρ1CTACGATGGTTACGCTGGGG3Ρ2 :CCCTTTCGCAGTTGGTAGAC通過3'和 5'末端快速擴增(Rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技術分別獲得3'和5'端序列，并拼接成完整的cDNA序列。根據(jù)cDNA的3'和5'端序列設計特異引物，引物序列如下HPlCATTCATTTCCTTTTAGCTTCCTCHP2 CAGAAGATTTTTTCCCCTAATCC以棉花幼葉的cDNA為模板進行PCR擴增，得到cDNA全長序列，將該cDNA命名為 GhMKK5。該基因的cDNA全長為148;3bp，其中開放閱讀框部分為1050bp。由此推得，該基因具有350個氨基酸。將其氨基酸序列在GenBank中檢索，發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表的LeMKK2 (番茄，AAU04434)、NtMEK2 (煙草，BAE97401)、AtMKK4 (擬南芥，NP_175577)、AtMKK5 (擬南芥， NP_188759)、PcMKK5 (歐芹，AAS21305)、StMEK2 (馬鈴薯，BAC81698)相比，氨基酸同源性分別為 73. 63%,73. 46%,74. 86%,75. 21%,72. 02%,72. 99%。由此表明，經過上述克隆步驟得到了編碼棉花促絲裂原活化蛋白激酶的基因GhMKK5。該基因序列如下序列表(l)SEQ. ID. NO. 1 的信息(a)序列特征長度1483bp類型核酸鏈型雙鏈
拓撲結構線性(b)分析類型cDNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源棉花(f)序列描述:SEQ. ID. NO. 1tttatttatt tatgtaatca ttaggagtga atgatcctcc tctcctcccg ctgctgcttc 60atcatcttgtccaggaacttgccttcctttttcctttttctgtgaagaataaagggaaaa120
C3.C3.C3.C3.C3.cacacactctctttctctctctctctctctctctctctctctctctttca180
tcattcatttccttttagcttcctcaatttttttacagctaagcc 'jatg| ag acccaatcac240
caaccaccaccatctgctggtggctcctcctcctccaataagaaccgtccacgtagacga300
gctgaccttaccctacccctccctcaacgtgacccttctctcgccgtccctcttcccctt360
cctccctcctccaactccgccccgcccgcctcctccaactccaacgccttgcctcagcaa420
gtcaacttctccgagctcgaccgcgtcaaccggatagggagcggtaccggaggcaccgtt480
tacaaagtcgtccaccgcccttcctctcgcccttatgccctcaaggttatctacgggaac540
catgaagagtctgtccgccgtcagatccgcagggagatcgagatcctccgtgacgtggac600
caccccaacgtcgtaaaatgtcacgaaatgtacgatcacaacggagaaatccaggttctt660
ttggaattcatggatggcggatctttggaagggatcctcatatctcgcgaagctaactta720
tcagatctggcccgtcaagtcctcagcggtctaaactaccttcaccgccgacacatcgtc780
caccgcgacataaaaccttcgaatctgctaaccaattccaagaaggtggtgaagatagct840
gattttggggtgagecgaatcttggatcaaaccatggacccctgcaactcatctgttggg900
accatagcatacatgagccctgagaggattaacaccgatttgaaccacgggctctacgat960
ggttacgctggggatatttggagtttaggggttagcatattggaattttatttagggagg1020
ttccctttcgcagttggtagacaaggggattgggccagtctcatgtgcgcgatttgtatg1080
tctcagccaccggaggcccctcccactgcttctaatgaatttaggcattttatatcatgt1140
tgtttgcagagggatccagccaggaggtggtcggcggctcagttgttgcagcatcctttt1200
attctcagaggacaaccacatcaggttgctcagaatcttcatcagttattaccacctcca1260
cctcctctttcttct |fcag|ct ttctatttct ttttatttgttttgggatta ggggaaaaaa1320
tcttctgtaagttttgatataatgagggtctggggggagttgggtgcaatgtctttcctt1380
cttcttttttttttttcctttcatgtttttattaatcactcttgcttctg ataaaagata1440
atctttacaatattagaaaa aaaaaaactctgttatgactggc1483其中透明方框內的為起始密碼子，灰色方框內的為終止密碼子。(3) SEQ. ID. NO. 2 的信息(a)序列特征長度350個氨基酸類型氨基酸鏈型單鏈拓撲結構線性(b)分析類型蛋白質0068](C)序列描述-.SEQ.ID.NO. 20069]MetArgProAsnHisGlnProProProSerAlaGlyGlySerSerSer0070]1510150071]SerAsnLysAsnArgProArgArgArgAlaAspLeuThrLeuProLeu0072]2025300073]ProGlnArgAspProSerLeuAlaValProLeuProLeuProProSer0074]3540450075]SerAsnSerAlaProProAlaSerSerAsnSerAsnAlaLeuProGln0076]5055600077]GlnValAsnPheSerGluLeuAspArgValAsnArglieGlySerGly0078]657075800079]ThrGlyGlyThrValTyrLysValValHisArgProSerSerArgPro0080]8590950081]TyrAlaLeuLysVallieTyrGlyAsnHisGluGluSerValArgArg0082]1001051100083]GlnlieArgArgGlulieGlulieLeuArgAspValAspHisProAsn0084]1151201250085]ValValLysCysHisGluMETTyrAspHisAsnGlyGlulieGlnVal0086]1301351400087]LeuLeuGluPheMETAspGlyGlySerLeuGluGlylieLeulieSer0088]1451501551600089]ArgGluAlaAsnLeuSerAspLeuAlaArgGlnValLeuSerGlyLeu0090]1651701750091]AsnTyrLeuHisArgArgHislieValHisArgAsplieLysProSer0092]1801851900093]AsnLeuLeuThrAsnSerLysLysValValLyslieAlaAspPheGly0094]1952002050095]ValSerArglieLeuAspGlnThrMETAspProCysAsnSerSerVal0096]2102152200097]GlyThrlieAlaTyrMETSerProGluArglieAsnThrAspLeuAsn0098]2252302352400099]HisGlyLeuTyrAspGlyTyrAlaGlyAsplieTrpSerLeuGlyVal0100]2452502550101]SerlieLeuGluPheTyrLeuGlyArgPheProPheAlaValGlyArg0102]2602652700103]GlnGlyAspTrpAlaSerLeuMETCysAlalieCysMETSerGlnPro0104]2752802850105]ProGluAlaProProThrAlaSerAsnGluPheArgHisPhelieSer0106]290295300
Cys Cys Leu Gln Arg Asp Pro Ala Arg Arg Trp Ser Ala Ala Gln Leu305310315320Leu Gln His Pro Phe lie Leu Arg Gly Gln Pro His Gln Val Ala Gln325330335Asn Leu His Gln Leu Leu Pro Pro Pro Pro Pro Leu Ser Ser340345350本發(fā)明還提供了編碼促絲裂原活化蛋白激酶激酶基因GhMKK5在農作物中應用的方法，可提高轉基因細菌抗性能力。步驟為(a)利用棉花促絲裂原活化蛋白激酶激酶基因GhMKK5，將cDNA序列置于CaMV 35S 啟動子之下，構建植物表達載體。(b)采用本領域熟知的方法，如農桿菌介導的方法將構建的表達載體導入植物細胞，得到轉基因植株。本發(fā)明從棉花中分離出一種編碼促絲裂原活化蛋白激酶激酶的基因(GhMKK5)，將該cDNA序列構建在由組成型CaMV 35S強啟動子控制的真核轉化載體pBI121上，構建了 GhMKK5的正義表達載體，采用農桿菌介導的方法轉化本生煙。對獲得的轉基因煙草進行功能分析表明，轉基因煙草中GhMKK5的過量表達能提高其細菌抗性。相對于非轉基因煙草， 轉基因植株具有明顯的抗菌能力。該基因可轉化棉花、小麥、玉米等農作物，能提高其產量， 具有重大的經濟價值和社會價值。本發(fā)明涉及一種植物表達載體，包含有如SEQ. ID. NO. 1所示的核苷酸序列，用于提高植物抵抗細菌病菌的能力。本發(fā)明涉及將上述植物表達載體導入植物細胞中，導入方法都是本領域人員熟知的，這些方法包括但不僅限于農桿菌介導的轉化法、基因槍法、電擊法、顯微注射法、脂質體轉化法、PEG介導的轉化法、花粉管導入法等。本發(fā)明所用選擇標記基因為新霉素磷酸轉移酶基因，可進一步包括其它選擇標記基因和報告基因。本發(fā)明中GhMKK5基因及含有該基因的植物表達載體也可以用于生產其它具有抵抗細菌病害能力的轉基因植物，包括具有抗細菌病害能力植物的器官、組織、細胞及其種子和后代。本發(fā)明采用離體葉片接種法對獲得的T2代轉基因煙草進行抗細菌病能力分析發(fā)現(xiàn)，轉基因煙草中GhMKK5的過量表達能顯著提高其抗青枯病害及細菌性斑點病害的能力。 可將該基因轉化小麥、棉花等農作物或其它植物，提高其抵抗細菌病害的能力，提高其產量和品質，具有重大的經濟價值和社會價值。
四

圖 1. PCR 擴增 GhMKK5 片段。M :marker DL2000。圖2.棉花中GhMKK5氨基酸序列與幾種其它植物的MAI3K氨基酸序列的比較結果。 其中相同的氨基酸殘基用黑底表示。它們在GenBank中的注冊號及其物種來源分別為 StMEK2 (馬鈴薯，BAC81698)、AtMKK4 (擬南芥，NP 175577)、AtMKK5 (擬南芥，NP 188759)、 LeMKK2 (番茄，AAU04434)、NtMEK2 (煙草，BAE97401)、PcMKK5 (歐芹，AAS21305)。
圖3.煙草正義表達載體的構建程序。圖4.部分轉基因植株的PCR鑒定結果。CK-非轉基因對照；CK+ 轉空載體陽性對照；1-10 轉基因煙草植株M :marker DL2000。圖5.過量表達GhMKK5的轉基因煙草與非轉基因煙草離體接種細菌。A 未接種細菌的非轉基因煙草；B 未接種細菌的轉基因煙草；C 接種青枯病菌的非轉基因煙草；D 接種青枯病菌的轉基因煙草；E 接種I3St DC3000的非轉基因煙草；F 接種I^st DC3000的轉
基因煙草。
五具體實施例方式基于本生煙草生長速度快、生活周期短、離體培養(yǎng)再生能力強、遺傳轉化效率高等優(yōu)點，在下述實施例中以本生煙為例對本發(fā)明進行了詳細的說明。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例(一)一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMKK5的克隆方法1. RNA的提取利用TRIZOL試劑盒提取棉花總RNA2. cDNA第一鏈的合成(采用Transgen公司cDNA第一鏈合成試劑盒法)在0. 25ml離心管中加入下列試劑mRNA5 μ 1Oligod(T)1 μ 1Buffer10 μ 1吸打混勻后42°C水浴30min，85°C水浴lOmin，冰上冷卻5min，輕離心后，保存?zhèn)溆谩?. cDNA的5'加尾反應(a)反應體系(b)37°C 保溫 30min。(c)加 100 μ 1 無水乙醇，_20°C沉淀 30min。(d)12，000rpm，室溫離心5min。棄上清，干燥后加適量ddH20回溶。4. cDNA全長序列的獲得4.1 用引物 MP 1 (AARGTNATHGGNAARGG)和 MP2 (CCCAARCTCCAVATRTCNCT)進行 PCR 反應獲得GhMKK5中間片段體系如下IOXEasyTaq buffer 2. 5 μ 1dNTP mixture (IOmM) 1 μ 1
0135]EasyS cript Reverse Transcriptase
0136]RNAase free water
1 μ 1 3 μ 1
0140]cDNA
0141]5XTdT Buffer
0142]0. 1 % BSA
0143]IOOmM dCTP
0144]TdT
0145]ddH20 Up to
20 μ 1 10 μ 1 5 μ 1 1 μ 1 1 μ 1 50 μ 1
MPl (10 μ Μ)1 μ 1ΜΡ2(10μΜ)1 μ 1cDNA1 μ 1TaqE0. 25 μ 1ddH20Upto25 μ 1反應程序為
權利要求
1.一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMKK5，其特征在于其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示；該核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMKK5的應用，其特征在于該基因在本生煙草中過量表達，能夠提高轉基因煙草對細菌的抗性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可提高轉基因作物細菌抗性的基因GhMKK5及其應用，屬于分子生物學和生物技術領域。本發(fā)明采用同源克隆和RACE技術獲得一種棉花促絲裂原活化蛋白激酶基因GhMKK5，將該基因的cDNA序列置于CaMV 35S啟動子下，構建植物表達載體，轉化本生煙，使該基因在煙草中過量表達。實驗證實，轉基因煙草具有明顯的抵抗細菌病害的能力。將該基因用于轉化小麥、棉花等農作物，可提高增強其抗細菌能力，提高其產量和品質，具有重大的經濟價值和社會價值。
文檔編號C12N15/54GK102154338SQ20101059084
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月7日 優(yōu)先權日2010年12月7日
發(fā)明者吳長艾, 孟飛, 張良, 李玉真, 郭興啟 申請人:山東農業(yè)大學