專利名稱：：一個簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因及其表達載體和應用的制作方法一個簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因及其表達載體和應用
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，公開了一個簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKI及其表達載體和應用。
背景技術：
：小麥是世界上分布最廣、種植面積最大的糧食作物，對人類糧食安全具有舉足輕重的作用。小麥生產過程中，受到諸多逆境的脅迫(如病蟲害、干旱、鹽潰等)，制約其產量和品質的提高。由專性寄生真菌Blumeriagraminisf.sp.tritici侵染引起的小麥白粉病是我國小麥的第二大病害，近年來出現由南向北逐漸加重之勢，給小麥生產帶來了越來越嚴重的危害。防治白粉病最經濟有效的方法是使用抗病品種，但由于病原菌小種變化快，我國現有的大部分品種已逐漸失去了對白粉病的抗性。分離和鑒定新的抗白粉病基因，利用轉基因技術改良和創造小麥抗白粉病新種質，為小麥抗白粉新品種的選育提供了新的路徑。簇毛麥(Haynaldiavillosa,2n=14,VV),是小麥的一個野生近緣種，它高抗小麥白粉病、銹病、梭條花葉病、全蝕病等病害，并具有抗旱、耐鹽、耐寒等特性，是小麥抗逆遺傳改良的寶貴基因資源庫。其中來自簇毛麥6VS的Pm21基因是目前抗白粉病主效基因之一，具有抗性強、抗譜廣等特點，是目前為止最有效的抗白粉病基因(參考文獻=ChenPD,QiLL,ZhouB,etal.DevelopmentandmoIecμIarcytogeneticanalysisofwheat-Haynaldiavillosa6VS/6ALtranslocationlinesspecifyingresistancetopowderymildew.TheorApplGenet,1995，91:1125-1128.)。因此，研究Pm21基因發揮抗病作用過程中所涉及的信號轉導途徑基因和重要的防衛反應基因，對于了解廣譜抗性的分子機理，運用基因工程手段提高小麥對白粉病的抗性具有重要意義。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供一種簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKI。本發明的另一目的是提供該基因的表達載體。本發明的又一目的是提供該基因和表達載體的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKI，來自簇毛麥，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。該簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因編碼的蛋白質HvCIPKI，其氨基酸序列為SEQIDN0.2。含有所述的類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKI的表達載體。含有所述的類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKI的表達載體優選以pAHC25為出發載體，將所述的HvCIPKI基因插入pAHC25的SmaI和SacI酶切位點間所得。所述的類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKI在培育抗白粉病小麥品種中的應用。所述的類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKI的表達載體在培育白粉病小麥品種中的應用。有益效果本發明從簇毛麥中克隆得到了一個類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKI及其所編碼的蛋白質HvCIPKl。HvCIPKI可用于基因工程育種，將其插入表達載體pAHC25，得到該基因的過量表達載體導入感病小麥品種中，可以提高感白粉病小麥品種對白粉病的抗性。圖1利用中國春、簇毛麥和小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL及小麥-簇毛麥的一套添加系材料對HvCIPKI基因進行染色體區段定位，將HvCIPKl定位到6V染色體短臂。1，簇毛麥；2，小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系92R137;3，中國春(ChineseSpring);4，小麥-簇毛麥DAlV;5，小麥-簇毛麥DA2V;6，小麥-簇毛麥DA3V;7，小麥-簇毛麥DA4V;8,小麥-簇毛麥DA5V;9,小麥-簇毛麥DA6V;10，小麥簇毛麥DA7V;12，MarkerDL2000(Takala).圖2HvCIPKl在簇毛麥葉片經白粉菌誘導后的RT-PCR分析0h、2h、6h、12h、24h、48h分別表示白粉病菌誘導了0h、2h、6h、12h、24h、48h的葉片cDNA樣品。圖3HvCIPKl過量表達載體構建圖4HvCIPKl基因轉化揚麥158的Ttl代陽性轉基因植株PCR分子鑒定結果泳道I為未轉化揚麥158對照，泳道2為MarkerDL2000,泳道3為包含目的基因的質粒，泳道4-23依次為T。代再生植株(其中泳道4、5、7、13、14、15、17、18、21、22、23為陽性轉化植株)，泳道24為水空白對照。圖5普通小麥染色體示6簇毛麥染色體示7小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL的示8小麥-簇毛麥添加系DA6V的示圖具體實施例方式實施例1簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的克隆本實驗室前期利用簇毛麥受白粉菌誘導后的cDNA樣品與大麥表達譜芯片BarleyIGeneChip(http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/barley,affx)進行雜交，篩選克隆了一個在簇毛麥中受白粉誘導表達的絲氨酸/蘇氨酸激酶基因(Hv-S/TPK)，物理定位于Pm21所在區段，轉入感病小麥揚麥158超量表達后表現高抗白粉病(CaoAZ,XingLP,etal.Serine/threoninekinasegeneStpk-V,akeymemberofpowderymildewresistancegenePm21,conferspowderymildewresistanceinwheat,PNAS,2011,108(19):7727-7732)。為進一步克隆位于簇毛麥Pm21所在區段的抗白粉病相關基因，本發明以Hv-S/TPK為出發點，篩選其周圍的抗病基因類似物。大量研究表明，水稻和小麥染色體之間存在一定的共線性，其中小麥第六部分同源群染色體與水稻第2條染色體之間存在共線性，Hv-S/TPK在水稻中的同源基因位于克隆AP004093.3和AP004863.3上，這兩個緊鄰的克隆位于第2條染色體上且部分重疊。通過搜索Genbank，獲得了水稻第2條染色體上位于Hv-S/TPK基因上下游的BAC同源序列，進一步利用水稻基因組的序列信息，圍繞Hv-S/TPK的同源BAC繼續篩選第六部分同源群中間區域的抗病基因類似物。圍繞Hv-S/TPK的同源BAC，在小麥第六部分同源群中共查找到具有抗病基因結構的EST23個，設計了68條引物(組成49對)。49對引物在簇毛麥中均能擴增出條帶，為了篩選出定位于6VS上的抗病基因類似物，本發明以6VS/6AL易位系，小麥-簇毛麥異附加系(DAlV-DA7V)(1、ChenPD,QiLL,ZhouB,etal.Developmentandmolecularcytogeneticanalysisofwheat-Haynaldiavillosa6VS/6ALtranslocationlinesspecifyingresistancetopowderymildew.TheorApplGenet,1995，91:1125-1128.2、L.L.Qi,S.L.Wang,P.D.Chen,D.J.Liu,B.S.Gill1998IdentificationandphysicalmappingofthreeHaynaldiaviIIosachromosome_6VdeletionlinesTAG97:1042-1046)基因組DNA為模板進行PCR擴增，最終得到6個定位于6VS上的基因。其中I個為BarIey1-14940(引物對Pltgctctccttggatacattt(SEQIDNO.3)和P2(acaaggttcagaaaggtgaaCSEQIDNO.4)),染色體定位如圖1,其預測的結果顯示，它包含一個完全不同于Hv-S/TPK的絲氨酸蘇氨酸激酶結構域，為了研究它和Hv-S/TPK的功能差別，以及它在抗白粉病中是否和Hv-S/TPK有聯系，進一步利用篩選簇毛麥葉片cDNA文庫的方法克隆獲得了該基因的全長序列。本發明所用的白粉菌誘導12h的簇毛麥葉片cDNA文庫(陳雅萍，2005)，能夠滿足對簇毛麥葉片中Pm21基因和其它抗性基因、防衛基因和其它優良基因的克隆研究。cDNA片段兩端經NotI和SalI酶切位點定向克隆于載體。pSPORTl能被lmmol/LIPTG(isopropylthio-β-galactoside)誘導,通過半乳糖苷啟動子表達被克隆的基因。多克隆位點的設計便于用HenikofT法進行套式缺失的構建和測序，其它特征和PUC系列載體類似。為長期保存文庫和減小篩庫工作量，先從5個384孔板每4-5個小混合池中各吸IμI菌液,將其混合到一起，37°C擴大培養后提取質粒。每塊384孔板提取80個質粒，共有400個質粒。首先用Barleyl-14940引物以上述的400個混合池質粒DNA為模板進行PCR擴增，篩選到一個陽性的混合質粒；然后取1.5μI初級混合池質粒做電擊轉化，涂10個LBA平板，37°C培養待其生長16h后，每平板分30個小區刮取菌落，接入含500μILBA的1.5ml離心管中培養5個小時后，進行PCR篩選。用Barleyl-14940引物以這300個小區為模板進行PCR擴增，70%以上的次級克隆池可以擴出陽性條帶。其中83號次級克隆池中陽性條帶最濃，取5μI83號菌液稀釋200倍，每ImlLBA培養基中接種10μI。共100管菌液，用Barleyl-14940弓I物進行PCR篩選。50%的菌液可以擴增出陽性條帶，其中60號菌液擴出的條帶最濃。取60號菌液稀釋10000倍，取10μI稀釋液涂平板。用槍頭挑取15-20個單克隆于500μILBA中培養，用Barleyl-14940引物進行PCR篩選。篩選出含有目標片段的混合菌液，再次稀釋鋪板挑單克隆，LBA中培養后進行PCR篩選，獲得I個陽性克隆。測序結果表明，該cDNA克隆全長2491個堿基，序列如SEQIDNO.1所示，其中5’UTR區有404堿基，3’-UTR有692個堿基，開放閱讀框(ORF)長1395bp(圖5-8)，編碼465個氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。通過對該氨基酸序列進行保守結構分析，發現它含有一個絲氨酸蘇氨酸激酶活性區和一個NAF結構域。NAF結構域又名FISL結構域，由21個氨基酸殘基組成，其中A、F和L殘基在已克隆的CIPK(CBL-1nteractingserine-threonineproteinkinases)基因中高度保守。CIPK是一類植物特有的響應I丐信號、CBL(B_likecalciumsensorproteins)特定祀向的絲氨酸-蘇氨酸激酶。經BLAST分析，該基因編碼的蛋白序列與高粱中的CIPK31基因同源性最高為82%，與擬南芥CIPK2、水稻CIPKl所編碼的氨基酸序列同源性分別為58%、44%。因本實驗克隆的基因含有保守的NAF結構域而且與其它種屬的CIPK基因有較高的同源性，故將該基因命名為HvCIPKl。實施例2白粉菌誘導后HvCIPKl的表達特征分析把簇毛麥的非誘導和誘導不同時間的樣品的cDNA為模板、以引物對P3(TTCGAGGATTGGCCTAATTG(SEQID勵.5))和卩4(GCACTGATGAGCTGATGGAA(SEQIDNO.6))進行實時熒光定量qPCR分析，以管家基因Tubulin作為內參。PCR反應在實時熒光定量PCR儀(MylQ，Bio-Rad，USA)上擴增并檢測熒光。20μIPCR反應體系中含2XSYBRGreenPCRMasterMix10μ1,0.4nmol/yI引物P3和P4，反轉錄產物2μI。擴增參數為95°CIOmin,然后95°C15s、58°C30s，72°Clmin，共40個循環。反應結束后，進行熔解曲線的測定。檢測基因表達水平定量用MyiQ系統軟件進行分析。qPCR結果表明HV_S/TPK基因在簇毛麥中受白粉菌誘導上調表達，12小時期間達到最高值，隨后下降并維持在較低水平(圖2)。實施例3HvCIPKl基因的表達載體的構建及其轉化普通小麥揚麥158把用P5(TCCCCCGGGATGGAGGAAAGGAGGACA(SEQIDNO.7))和P6(ACGCGAGCTCTTACTCCTGTGGCTGCTGT(SEQIDNO.8))從簇毛麥cDNA中擴增出來的HvCIPKl基因片段構建入轉化載體pAHC-25(公知公用，參考文獻ChristensenAH，QuailPH,Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996，5:213-218.)，用SmaI和SacI分別雙酶切載體pAHC-25和目標片段HvCIPKl基因，以HvCIPKl替換pAHC25載體上的⑶S基因編碼序列，連接轉化大腸桿菌獲得重組子，由此將目標基因克隆到強啟動子Ubi的下游，獲得表達載體pAHC-HvCIPKl。除草劑抗性基因(Bar基因)作為植物轉化的選擇標記基因(附圖3)。將構建好的過量表達載體通過基因槍法轉化揚麥158，挑選1200個幼胚愈傷進行基因槍轟擊，轟擊前在高滲培養基(MS++2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上預處理4小時，轟擊后在高滲培養基上繼續培養16小時。之后將愈傷組織轉移至恢復培養基(1/2MS(只有大量元素減半的MS)+水解酪蛋白500mg/L+2，4_D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培養2周，再將其轉移至含有除草劑的篩選培養基上(1/2MS+ZTImg/L+1AA0.5mg/L+水解釀蛋白500mg/L+2,4-Dlmg/L+鹿糖30g/L+3mg/LBialaphos,pH5.8),分化篩選培養2周。然后將具有抗性的愈傷組織轉移到分化培養基中(1/2MS+水解酪蛋白200mg/L+ZTlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0.8%,pH5.8)進行分化，待分化芽長至2-4cm時將其轉移至生根培養基(l/2MS+IAAlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0.8%，pH5.8)中。至再生苗長約5-8cm、根系較健壯時，即可開管煉苗1-2天，最后洗去根系攜帶的培養基殘渣便可移栽入盆缽，獲得再生植株共125株。提取所有再生植株基因組DNA，對轉化植株利用載體上啟動子引物P7(CCCTGTTGTTTGGTGTTACCSEQIDNO.9))和基因HvCIPKl內部引物P8(CTTCAATACGTTGGGATGT(SEQIDNO.10))進行PCR擴增，以鑒定陽性植株。PCR程序10_50ng/μI基因組模板，ΙΟμΜ的5’引物Ρ7和3’引物Ρ8各O.5μI;2·5μIIOXbuffer；2.5μI2.5mM的dNTP；1.5μ125mM的Mg2+;0·25μI(5U/μI)Taqpolymerase(TaKaRa),加水至25μI。PCR反應條件為94°C預變性3min；94°C45s,58°C45s,72°Clmin，35個循環；72°C延伸IOmin0PCR產物經8%的聚丙烯凝膠電泳檢測。其中11株可以擴增約556bp的目的條帶，初步鑒定為陽性植株，株系編號依次為TQ-4、TQ-5、TQ-7、Ttl-13、Ttl-14、Ttl-15、Ttl-17、Ttl-18、TQ-21、TQ-22、T0-23(附圖4)。實施例4轉基因植株的白粉病抗性鑒定對Ttl代轉基因植株、轉基因受體品種揚麥158進行了田間抗病性鑒定，對T2代轉基因植株、轉基因受體品種揚麥158進行了苗期離體和成株期白粉病抗病性鑒定。抗性鑒定標準采用“0-9級”白粉病抗性反應型的分級標準0-2級為高抗、3-4級為中抗、5-6級為中感、7-9為高感。Ttl代成株期抗性鑒定的結果表明揚麥158表現為高感，陽性轉基因植株中，除IV18和TciH表現為中感，其余陽性轉基因植株均表現為中抗。T2代苗期離體抗性鑒定的兩次重復結果表明揚麥158表現為高感；陽性轉基因植株中，1-144-174-22和TQ-23均表現為高抗，Tc1-LTc1-S和TpI均表現為中抗。T2代成株期白粉病鑒定結果表明揚麥158表現為高感，陽性轉基因植株中，Tq-14表現為高抗，Tq-17、Tq-21、T0-22和TQ-23均表現為中抗，T0-4,T0-5和Tc1-1S均表現為中感。(表2)。表2轉基因植株的白粉病抗性鑒定權利要求1.一個簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKl，其特征在于其核苷酸序列為SEQIDNO.1。2.權利要求1所述簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因的蛋白質HvCIPKl，其特征在于其氨基酸序列為SEQIDNO.2。3.含有權利要求1所述的簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的表達載體。4.根據權利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的表達載體是以PAHC25為出發載體，將權利要求1所述的HvCIPKl基因插入PAHC25的SmaI和SacI酶切位點間所得。5.權利要求1所述的簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKl培育抗白粉病小麥品種中的應用。6.權利要求3或4所述的含簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的表達載體在培育抗白粉病小麥品種中的應用。全文摘要本發明公開了一個簇毛麥類鈣調素互作蛋白激酶基因HvCIPK1及其表達載體和應用，屬于基因工程領域。HvCIPK1的cDNA序列為SEQIDNO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO.2。該基因為簇毛麥中首次報道，受小麥白粉病菌誘導上調表達，在小麥感白粉病品種揚麥158中過量表達該基因可以提高揚麥158對白粉病菌的抗性。HvCIPK1是簇毛麥抗病信號傳導途徑中的一個重要元件，可作為目的基因導入感白粉病小麥品種，提高白粉病抗性；同時探明其作用的分子機制，有助于了解白粉病的廣譜抗性機制。文檔編號C12N15/63GK102994528SQ20121051258公開日2013年3月27日申請日期2012年12月4日優先權日2012年12月4日發明者邢莉萍,曹愛忠,胡佳夢,錢晨,李穎波,王秀娥,陳佩度申請人:南京農業大學