專利名稱：生物反應(yīng)器系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)細(xì)胞、特別是貼壁細(xì)胞(adherent cell)的生物反應(yīng)器，還涉及生物反應(yīng)器的應(yīng)用，特別是用于細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)和增殖中的應(yīng)用，且還涉及利用本發(fā)明的生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞的方法。應(yīng)用的一個(gè)特別領(lǐng)域是該生物反應(yīng)器在GMP-適應(yīng)性全自動(dòng)化細(xì)胞培養(yǎng)和增殖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在組織工程(特別是涉及再生醫(yī)學(xué))的技術(shù)領(lǐng)域中，需要在潔凈的室內(nèi)條件下以 GMP-適應(yīng)性的方式進(jìn)行生物實(shí)驗(yàn)室工藝的自動(dòng)化操作。通過這種方式，能夠?qū)崿F(xiàn)更高產(chǎn)率、 更高工藝安全性和可標(biāo)準(zhǔn)化工藝的優(yōu)化和工藝控制。這些年來，已確立了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)中的一些標(biāo)準(zhǔn)。因此經(jīng)常使用由注塑的聚丙烯或聚苯乙烯制成的一次性制品，這樣避免了成本非常高的樣品容器的清潔和消毒。首先從活體檢查物(biopsate)中分離建立組織構(gòu)造所需的細(xì)胞，然后將其在大小不同的細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶或多孔板中培養(yǎng)數(shù)天的時(shí)期。為了培養(yǎng)的目的，首先將分離的原代細(xì)胞再懸浮在特定的細(xì)胞培養(yǎng)基中。隨后將細(xì)胞懸浮液吸移至一次性培養(yǎng)器皿中，在該一次性培養(yǎng)器皿中細(xì)胞以不定的方式粘附至經(jīng)過特別的預(yù)處理的塑料表面。在孵育器中孵育數(shù)天的時(shí)期，且定期用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基更換舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，隨后將細(xì)胞培養(yǎng)物(生長有足夠的密度，即融合的)自細(xì)胞培養(yǎng)器皿的塑料材料的表面脫附。脫附過程以完全酶促的方式(例如使用含胰蛋白酶/EDTA的溶液) 進(jìn)行，或者與機(jī)械激發(fā)聯(lián)合進(jìn)行。在此情況下，酶活性和機(jī)械應(yīng)力兩者對(duì)細(xì)胞活力都有負(fù)面的影響。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)器皿不適于量相對(duì)較大的自動(dòng)化生產(chǎn)。細(xì)胞僅在滿足特定的對(duì)細(xì)胞典型的條件時(shí)才增殖。在這點(diǎn)上，一個(gè)重要的因素是例如接種密度，即分離的細(xì)胞被引入至培養(yǎng)器皿的細(xì)胞濃度。另一方面，必須選擇接種密度，使其足夠高，以允許細(xì)胞能夠建立增殖所必需的細(xì)胞/細(xì)胞相互接觸；另一方面，接種密度必需足夠低，以提供充足的生長區(qū)域。在手動(dòng)實(shí)驗(yàn)室操作中，多次傳代(passaging)(即細(xì)胞的脫附和在新的、更大的器皿中培養(yǎng))確保滿足這些條件。轉(zhuǎn)種培養(yǎng)工藝包括大量手動(dòng)操作，例如溶液的添加和移除、在孵育器中孵育、細(xì)胞脫附的顯微監(jiān)測(cè)、輔助的機(jī)械作用、細(xì)胞懸浮液至離心管的轉(zhuǎn)移、細(xì)胞計(jì)數(shù)、離心分離、移除上清液、在新鮮的培養(yǎng)基中再懸浮細(xì)胞和重新接種。這導(dǎo)致移液管和一次性器皿的消耗增加。當(dāng)進(jìn)行獨(dú)立的操作時(shí)，實(shí)驗(yàn)室人員經(jīng)常采用不同的處理技術(shù)，并作出獨(dú)立的決定。這些涉及例如酶反應(yīng)的時(shí)間長短、細(xì)胞脫附的監(jiān)測(cè)、選擇是否施加機(jī)械輔助以及(如果施加機(jī)械輔助的話)施加何種機(jī)械輔助、或者選擇用于轉(zhuǎn)移細(xì)胞培養(yǎng)物的器皿。 在細(xì)胞的培養(yǎng)中，還需要考慮不同細(xì)胞類型的生長行為和增殖速度。總的來說，單一培養(yǎng) (unitary cultivation)過程因此高度依賴于自動(dòng)化系統(tǒng)。從前對(duì)自動(dòng)化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行過的嘗試局限于使用改造的培養(yǎng)器皿復(fù)制手動(dòng)實(shí)驗(yàn)室工藝中的順序。如此，例如來自Greiner Bio-One公司的CELLSTAR Aut0FlaskTM細(xì)胞培養(yǎng)瓶的形狀和處理被改造用于現(xiàn)有的自動(dòng)化系統(tǒng)中。在這種情況中，細(xì)胞以與傳統(tǒng)手動(dòng)工藝相同的方式進(jìn)行傳代。在PET膜上培養(yǎng)細(xì)胞的方法被用作實(shí)驗(yàn)室中的標(biāo)準(zhǔn)。為此目的，使用細(xì)胞培養(yǎng)插件，如通過例如WO 2004/020571A2而眾所周知的那些。然而，它們僅以有限的尺寸可利用。 在手動(dòng)實(shí)驗(yàn)室工藝中使用插件膜的缺點(diǎn)是培養(yǎng)期間不能在顯微鏡下監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物的生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于以下技術(shù)問題提供使細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增與現(xiàn)有技術(shù)相比夠得到改善和/或簡化的裝置和方法。本發(fā)明還基于以下技術(shù)問題提供使細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增能夠節(jié)約細(xì)胞的方法和裝置。本發(fā)明還基于以下技術(shù)問題提供使細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增能夠自動(dòng)化的方法和裝置。本發(fā)明還基于以下技術(shù)問題提供使細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增能夠簡化的方法和裝置。本發(fā)明還基于以下技術(shù)問題提供裝置和方法，其避免由于多次傳代而導(dǎo)致細(xì)胞受損，同時(shí)特別地使第一次傳代的培養(yǎng)時(shí)期和生長時(shí)間延長。本發(fā)明還基于以下技術(shù)問題提供以節(jié)約貼壁細(xì)胞的方式使細(xì)胞自培養(yǎng)表面脫附的方法和裝置。本發(fā)明的技術(shù)問題通過本申請(qǐng)獨(dú)立權(quán)利要求的主題得到解決。特別地，本發(fā)明的技術(shù)問題通過權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器得到解決。特別地，本發(fā)明的技術(shù)問題通過用于培養(yǎng)細(xì)胞的生物反應(yīng)器得到解決，其中所述生物反應(yīng)器的反應(yīng)器空間被膜單元細(xì)分成兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域，且其中所述兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域各自具有適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口，所述膜單元在至少局部區(qū)域是液體可滲透性的。因此，本發(fā)明涉及具有一體化的細(xì)胞生長膜的生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器作為外殼， 包圍反應(yīng)器空間(也稱作反應(yīng)器腔室)。該反應(yīng)器空間被膜單元(在局部區(qū)域?yàn)橐后w可滲透性的)分成兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域。因此，所述生物反應(yīng)器具有兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域或反應(yīng)器空間區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。在本發(fā)明中，術(shù)語"貼壁細(xì)胞"是指如下細(xì)胞類型其能夠在細(xì)胞培養(yǎng)基中以單層或多層、但特別是單層在惰性表面(例如反應(yīng)器皿)上培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞與表面接觸并粘附于其上。貼壁細(xì)胞一般形成連續(xù)的細(xì)胞層。貼壁細(xì)胞通常表現(xiàn)出密度依賴性增殖抑制 (也稱為接觸抑制)，這尤其出現(xiàn)在融合過度的情況中。貼壁細(xì)胞通常衍生自組織，如皮膚、 肌肉、神經(jīng)、肝、腎。貼壁細(xì)胞的實(shí)例是纖維原細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和許多腫瘤細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并根據(jù)待生長的細(xì)胞類型而選擇的基質(zhì)適合作為細(xì)胞培養(yǎng)基。然而，還可以培養(yǎng)"懸浮細(xì)胞"。懸浮細(xì)胞是不以單層或多層生長(即不粘附至惰性表面)的細(xì)胞。懸浮細(xì)胞的實(shí)例是血細(xì)胞，如白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞系。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)，除其它外，在于避免細(xì)胞擴(kuò)增期間的傳代步驟并伴隨有大大簡化的工藝自動(dòng)性，還在于節(jié)約細(xì)胞的工藝管理。
4
通過下面對(duì)本發(fā)明的生物反應(yīng)器的應(yīng)用和本發(fā)明的方法的描述，本發(fā)明的生物反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)將更明顯。對(duì)于本發(fā)明的生物反應(yīng)器，能夠提供例如下面的優(yōu)選和/或可選的實(shí)施方式根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選為可拆卸的。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選能夠被拆卸成至少三部分。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選能夠被拆卸成至少三部分，即a)包圍第一反應(yīng)器區(qū)域的反應(yīng)器外殼部分，b)包圍第二反應(yīng)器區(qū)域的反應(yīng)器外殼部分和c)至少局部區(qū)域?yàn)橐后w可滲透性的膜單元。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選為模件結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器外殼因此優(yōu)選由至少兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分(尤其是由兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分)形成。可選地，第一和第二反應(yīng)器外殼部分還能夠互相連接，尤其是通過鉸鏈互相連接。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，所述第一反應(yīng)器外殼部分被配置成反應(yīng)器蓋且第二反應(yīng)器外殼部分被配置成反應(yīng)器底部。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選包括反應(yīng)器底部、反應(yīng)器蓋和膜單元。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選由反應(yīng)器底部、反應(yīng)器蓋和膜單元組成。根據(jù)本發(fā)明，反應(yīng)器底部優(yōu)選向上開口。所述膜單元然后覆蓋反應(yīng)器底部的開口，其中膜單元的膜被水平放置在該開口之上。反應(yīng)器蓋然后具有向下的開口。所述反應(yīng)器蓋然后放置在反應(yīng)器底部上，使反應(yīng)器蓋中的開口也被水平的膜覆蓋。膜單元的膜因此劃分由反應(yīng)器底部形成的反應(yīng)器區(qū)域或反應(yīng)器空間以及由反應(yīng)器蓋形成的反應(yīng)器區(qū)域或反應(yīng)器空間。根據(jù)本發(fā)明，反應(yīng)器空間因此優(yōu)選被膜單元(其局部區(qū)域?yàn)橐后w可滲透性的)分成下部反應(yīng)區(qū)域和上部反應(yīng)區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，所述兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選能夠以密封的方式互相連接。根據(jù)本發(fā)明，所述兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分能夠通過螺紋連接以密封的方式互相連接。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員也熟知另選的或附加的能夠以密封的方式連接兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分的方式，例如通過夾鉗、夾具、帶(尤其是橡皮帶)或繩。根據(jù)本發(fā)明，所述兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選當(dāng)細(xì)胞在所述生物反應(yīng)器中培養(yǎng)期間以密封的方式互相連接。根據(jù)本發(fā)明，所述膜單元優(yōu)選由至少一個(gè)膜和至少一個(gè)框架組成。可選地，所述膜單元能夠僅由至少一個(gè)膜組成。根據(jù)本發(fā)明，所述膜單元優(yōu)選由膜和框架組成。可選地，所述膜單元能夠僅由膜組成。根據(jù)本發(fā)明，所述反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有接收裝置，例如槽或突出部，用于接收和設(shè)置膜單元。在可選的實(shí)施方式中，所述反應(yīng)器外殼部分具有接收裝置，例如槽或突出部，用于接收和設(shè)置膜。在可選的實(shí)施方式中，所述反應(yīng)器外殼部分具有接收裝置，例如槽或突出部，用于接收和設(shè)置膜單元的框架。如果膜單元包括框架，則所述框架優(yōu)選用于支撐膜和將其定位，并將膜設(shè)置在所述生物反應(yīng)器中。任選提供的框架能夠簡易地和廉價(jià)地制造成一次性注塑部分。能夠以這樣的方式選擇框架的材料(例如塑料材料，例如聚丙烯或聚苯乙烯)，從而使框架能夠被消毒，特別是能夠被高壓消毒。可以規(guī)定膜單元的框架被多次使用，且優(yōu)選為僅使用一次的膜在框架中可替換。然而，還可以規(guī)定整個(gè)膜單元(包括例如框架)被配置成一次性產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)框架能夠簡易地和廉價(jià)地制造成一次性注塑部分，且反應(yīng)器外殼在消毒后能夠選擇性地被回收再用。這提供廣范圍的應(yīng)用。在本發(fā)明優(yōu)選提供的膜單元中，特別地，膜的具體方式為優(yōu)選通過夾鉗保持在框架中的膜插件。在本發(fā)明一個(gè)特別的可選的實(shí)施方式中，通過大小不同的框架插件，作為細(xì)胞生長區(qū)域的膜面積是可變化的，從而允許根據(jù)需要改變可使用的細(xì)胞生長區(qū)域。還可以規(guī)定框架的大小為可變化的，從而使其覆蓋膜的大小不同的區(qū)域。這樣使培養(yǎng)過程中可被細(xì)胞利用的膜表面的大小可變化，特別是在細(xì)胞生長或增殖期間可增大。能夠以不同的方式增加由膜形成的細(xì)胞生長區(qū)域的大小，而不會(huì)破壞生長條件， 例如通過機(jī)械地可變的可調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長區(qū)域。在本發(fā)明進(jìn)一步特別的可選的實(shí)施方式中，所述生物反應(yīng)器能夠以這樣的方式被構(gòu)建使框架可以在生物反應(yīng)器中反轉(zhuǎn)，特別是能夠以自動(dòng)化的方式反轉(zhuǎn)，從而能夠?qū)Σ煌?xì)胞類型進(jìn)行共培養(yǎng)，包括例如在各種不同的培養(yǎng)基中。在這種情況下，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選規(guī)定膜的兩個(gè)表面均作為細(xì)胞的生長區(qū)域；特別是，一個(gè)膜表面能夠作為第一細(xì)胞類型的生長區(qū)域，且第二膜表面能夠作為第二細(xì)胞類型的生長區(qū)域。這允許例如模擬血/腦屏障。還可以規(guī)定將膜直接插入到生物反應(yīng)器中，而不使用框架。如果使用沒有框架的膜，則可以提供用于拉緊生物反應(yīng)器中的膜的拉緊系統(tǒng)。此外，在生物反應(yīng)器的制造過程中，能夠?qū)⒛せ蚰卧苯舆B接于其上，尤其是連接至反應(yīng)器外殼部分，例如連接至反應(yīng)器底部。這在一次性生物反應(yīng)器中尤其是可能的。根據(jù)本發(fā)明，膜單元優(yōu)選為通過膜是液體可滲透性的。根據(jù)本發(fā)明，膜因此優(yōu)選形成液體可滲透性部分，特別是膜單元的唯一液體可滲透性部分。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜還可以被其它合適的多孔材料(例如海綿狀材料)代替。根據(jù)本發(fā)明，膜單元的膜優(yōu)選為盤狀的或片狀的，且其被設(shè)置于兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域之間，使其兩表面水平。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，整個(gè)膜單元粗略地為盤狀的或片狀的，且被設(shè)置于兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域之間，使其兩表面水平。根據(jù)本發(fā)明，膜優(yōu)選占膜單元的至少25%。根據(jù)本發(fā)明，膜優(yōu)選占膜單元的至少 50%。還可以規(guī)定膜占膜單元面積的至少75%，特別是至少90%。根據(jù)本發(fā)明，膜優(yōu)選占膜單元面積的25%至100%。根據(jù)本發(fā)明，膜優(yōu)選占膜單元面積的50%至100%。膜用作細(xì)胞的生長區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選僅膜的兩個(gè)表面中的一個(gè)用作細(xì)胞的生長區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，如果將膜優(yōu)選水平地插入所述生物反應(yīng)器中，則根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選膜的上表面用作細(xì)胞的生長區(qū)域。
可選地，然而，特別是在貼壁細(xì)胞中，膜的兩個(gè)表面都能夠用作細(xì)胞的生長區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適合用于培養(yǎng)細(xì)胞(特別是貼壁細(xì)胞)的合適的液體可滲透性膜。細(xì)胞生長膜能夠例如由PET (即聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)或類似的材料制成。根據(jù)定義，膜具有多孔結(jié)構(gòu)，使得液體能夠通過膜進(jìn)行交換。細(xì)胞生長膜能夠例如由PET (即聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)或類似的材料制成。還可以使用例如聚碳酸酯膜。根據(jù)定義，膜具有多孔結(jié)構(gòu)，使得液體能夠通過膜進(jìn)行交換。根據(jù)本發(fā)明，膜優(yōu)選選自PET膜、PC膜、尼龍膜、兩性尼龍膜、帶正電荷的尼龍膜、 帶負(fù)電荷的尼龍膜、PTFE膜、纖維素酯膜、醋酸纖維素膜、硝酸纖維素膜、纖維素混合酯膜、 再生纖維素膜、Nytran膜和Nytran SuPerCharge++膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是PET膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是PC 膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是尼龍膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是兩性的尼龍膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是帶正電荷的尼龍膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中， 膜是帶負(fù)電荷的尼龍膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是PTFE膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是纖維素酯膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是醋酸纖維素膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是硝酸纖維素膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是纖維素混合酯膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是再生纖維素膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是Nytran+ 膜。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，膜是Nytran SuPerCharge++膜。細(xì)胞生長膜的涂層或施加表面結(jié)構(gòu)也是可以選擇的。根據(jù)本發(fā)明，膜的孔徑優(yōu)選為至少0.01 μ m。根據(jù)本發(fā)明，膜的孔徑優(yōu)選為至少 O-Ium0根據(jù)本發(fā)明，膜的孔徑優(yōu)選為至少0. 35 μ m。根據(jù)本發(fā)明，膜的孔徑優(yōu)選為至多20μπι。根據(jù)本發(fā)明，膜的孔徑優(yōu)選為至多 10 μ m。根據(jù)本發(fā)明，膜的孔徑優(yōu)選為至少0. 01 μ m，特別是0. 1 μ m，且為至多20 μ m，特別為至多10 μ mo根據(jù)本發(fā)明，膜的孔徑優(yōu)選為至少0. 35 μ m,特別是0. 4 μ m，且為至多9 μ m，特別為至多8μπ 。例如可以提供的孔徑是0. 4μ 、0. 45μ 、1. Ομπκ . 2μ 、3. 0μ 、5. Ομ 或 8· O μ m0本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知膜的合適的孔徑，其確保足夠的液體通道(特別是細(xì)胞培養(yǎng)基的通道)，并同時(shí)確保良好的細(xì)胞培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明，膜單元的膜的孔密度優(yōu)選為至少IO5孔/cm2。根據(jù)本發(fā)明，膜單元的膜的孔密度優(yōu)選為至多IO8孔/cm2。根據(jù)本發(fā)明，膜單元的膜的孔密度優(yōu)選為至少IO5孔/cm2且至多IO8孔/cm2。例如可以提供的孔密度是 0. IX 106、0· 2X 106、0· 4X 106、2X 106、22X IO6 或 IOOXlO6 孔 /cm2。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知膜的合適的孔密度，其能夠確保足夠的液體通道(特別是細(xì)胞培養(yǎng)基的通道)，并同時(shí)確保良好的細(xì)胞培養(yǎng)。還可以規(guī)定例如膜的面積擴(kuò)展為50cm2至120cm2，特別是75cm2至85cm2。特別地， 膜的面積擴(kuò)展可以是約80cm2。
根據(jù)本發(fā)明，兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域各自具有適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口。所述開口連接生物反應(yīng)器的內(nèi)部和生物反應(yīng)器的外部；因此，它們是貫通生物反應(yīng)器外殼的開口。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分各自具有適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開優(yōu)選地，所述開口可以是連接器的形式。所述生物反應(yīng)器能夠通過所述連接器 (例如經(jīng)由軟管)連接至其它裝置(例如在用于從細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生組織的自動(dòng)化整體系統(tǒng)中)，且液體(特別是細(xì)胞培養(yǎng)基或用于使細(xì)胞脫附的溶液)能夠通過所述連接器供應(yīng)至所述生物反應(yīng)器或從所述生物反應(yīng)器移除。所述開口還可以是隔板的形式。所述開口還可以是移液管開口的形式。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器區(qū)域優(yōu)選具有適于導(dǎo)入液體的開口。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器區(qū)域優(yōu)選具有適于導(dǎo)入和導(dǎo)出液體的開口。根據(jù)本發(fā)明，開口優(yōu)選是可關(guān)閉的。可選地，開口還可以配置成不可關(guān)閉的，例如， 當(dāng)生物反應(yīng)器通過開口經(jīng)由軟管連接至整體系統(tǒng)時(shí)。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器區(qū)域中適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口優(yōu)選被設(shè)置在反應(yīng)器外殼部分的側(cè)面或上側(cè)。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器區(qū)域中適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口被設(shè)置在反應(yīng)器外殼部分的側(cè)面。根據(jù)本發(fā)明，第二反應(yīng)器區(qū)域優(yōu)選具有適于導(dǎo)入和導(dǎo)出液體的開口。根據(jù)本發(fā)明，第二反應(yīng)器區(qū)域中適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口優(yōu)選被設(shè)置在反應(yīng)器外殼部分的側(cè)面或上側(cè)。根據(jù)本發(fā)明，第二反應(yīng)器區(qū)域中適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口被設(shè)置在反應(yīng)器外殼部分的側(cè)面。根據(jù)本發(fā)明，適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口被設(shè)計(jì)成閥。然而，它們也可以被設(shè)計(jì)成可關(guān)閉的或不可關(guān)閉的噴嘴或連接器，所述噴嘴或連接器能夠與例如軟管形式的供料管線或排液管線連接。這樣使得能夠連續(xù)或分步供應(yīng)新鮮的液體，而將舊的液體同時(shí)或提前除去。這是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，特別是當(dāng)本發(fā)明的生物反應(yīng)器被用在用于細(xì)胞培養(yǎng)的自動(dòng)化裝置中時(shí)。可選地，然而，特別是在本發(fā)明的生物反應(yīng)器的手動(dòng)使用中，也可以不一樣地供應(yīng)和/或除去液體，例如通過移液管添加液體、或?qū)⑵涞谷牖蛲ㄟ^移液管除去液體、將其排掉或?qū)⑵涞钩觥８鶕?jù)本發(fā)明，液體優(yōu)選為細(xì)胞培養(yǎng)基或用于將細(xì)胞從膜脫附的溶液。根據(jù)本發(fā)明，能夠這樣配置第一和/或第二反應(yīng)器區(qū)域使它們由反應(yīng)器腔室(實(shí)際的反應(yīng)器區(qū)域)以及將開口連接至反應(yīng)器腔室的引導(dǎo)系統(tǒng)形成。根據(jù)本發(fā)明，可選地，可以規(guī)定多個(gè)反應(yīng)器區(qū)域或一個(gè)反應(yīng)區(qū)域僅由多個(gè)反應(yīng)器腔室或一個(gè)反應(yīng)器腔室形成。根據(jù)本發(fā)明，可選地，可以規(guī)定所述生物反應(yīng)器為可反轉(zhuǎn)的。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個(gè)通風(fēng)口。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有至少一個(gè)通風(fēng)口。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器外殼部分(特別是反應(yīng)器蓋)優(yōu)選具有通風(fēng)口。
8
根據(jù)本發(fā)明，至少一個(gè)通風(fēng)口優(yōu)選提供有無菌過濾器。還可以規(guī)定通風(fēng)口是可關(guān)閉的。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選具有至少一個(gè)移液管開口。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有至少一個(gè)移液管開口。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有移液管開口。根據(jù)本發(fā)明，可以規(guī)定所述生物反應(yīng)器具有兩個(gè)移液管開口。在此情況下，可以規(guī)定一個(gè)移液管開口形成通向第一反應(yīng)器區(qū)域的通路，以及第二移液管開口形成通向第二反應(yīng)器區(qū)域的通路。在此情況下，第二移液管開口能夠例如位于反應(yīng)器蓋的上側(cè)，且為通向下面的第二反應(yīng)器區(qū)域的管線的形式。該管線能夠例如被引導(dǎo)沿著膜或膜單元。例如，特別成形的網(wǎng)(webs)能夠允許通過移液管開口將液體引入下面的反應(yīng)器區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，可以特別規(guī)定兩個(gè)移液管開口被設(shè)置在反應(yīng)器蓋的上側(cè)。可選地，還可以規(guī)定移液管開口為兩個(gè)適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口。在此實(shí)施方式中，因此可以規(guī)定不是在適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的兩個(gè)開口之外存在移液管開口，而是所述移液管開口代替適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的兩個(gè)開口。特別是，可以規(guī)定所述生物反應(yīng)器包括兩個(gè)移液管開口和通風(fēng)口作為僅有的開□。根據(jù)本發(fā)明，移液管開口優(yōu)選是可關(guān)閉的，特別是以密封的方式可關(guān)閉的。必要時(shí)，移液管開口也可以提供有液體可滲透性無菌過濾器。可選地，還可以進(jìn)一步提供開口(特別是可關(guān)閉的開口)，使得能夠向生物反應(yīng)器添加和/或從生物反應(yīng)器除去液體，特別是細(xì)胞培養(yǎng)基或添加劑。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有至少一個(gè)尤其提供有無菌過濾器的通風(fēng)口，和/或可關(guān)閉的移液管開口。在可選的實(shí)施方式中，所述生物反應(yīng)器適于接收計(jì)量裝置，例如電極；在此情況中，因此提供插槽或類似物，用于接收計(jì)量裝置。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器中優(yōu)選整合有能夠測(cè)量數(shù)據(jù)的計(jì)量裝置，例如測(cè)量 TEER值的計(jì)量裝置。通過測(cè)量TEER值(TEER=跨上皮電阻)，能夠測(cè)定細(xì)胞群的密度。因此，能夠測(cè)定細(xì)胞在膜上達(dá)到所需的細(xì)胞密度的時(shí)間點(diǎn)，特別是細(xì)胞層變成幾乎融合或融合的時(shí)間點(diǎn)。術(shù)語“融合”用于描述貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)器皿面(即本申請(qǐng)中的膜表面)的表面上可能最接近的布置。細(xì)胞系之間的融合各不相同。融合是細(xì)胞生長和/或增殖的結(jié)果，在即將達(dá)到融合或達(dá)到融合時(shí)，可以將細(xì)胞采集或傳代。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選具有用于測(cè)量數(shù)據(jù)的裝置，特別是電極。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選具有用于測(cè)量TEER值的裝置，特別是電極。可選地，可以為裝置(特別是用于測(cè)量TEER值的電極)僅提供插槽。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有用于測(cè)量TEER值的至少一個(gè)電極，特別是一個(gè)電極。根據(jù)本發(fā)明，第二反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有用于測(cè)量TEER值的至少一個(gè)電極，特別是一個(gè)電極。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，所述第一反應(yīng)器區(qū)域具有用于測(cè)量TEER值的電極，且所述第二反應(yīng)器區(qū)域也具有用于測(cè)量TEER值的電極。通過任選地一體化的電極，能夠以優(yōu)選的方式通過測(cè)量TEER值來監(jiān)測(cè)細(xì)胞在載體結(jié)構(gòu)上的群密度。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選向生物反應(yīng)器中整合能夠測(cè)量液體(特別是細(xì)胞培養(yǎng)基)的不透明性、PH、葡萄糖含量和/或含氧量的計(jì)量裝置。例如，可以提供目測(cè)不透明性測(cè)量 (visual opacity measurement)0根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器區(qū)域優(yōu)選具有用于測(cè)量液體量或液體體積的測(cè)量工具。 根據(jù)本發(fā)明，第二反應(yīng)器區(qū)域優(yōu)選具有用于測(cè)量液體量或液體體積的測(cè)量工具。通過測(cè)量生物反應(yīng)器中或生物反應(yīng)器局部區(qū)域中的液體量，例如可以倒入剛好用于使細(xì)胞脫附的酶溶液的量，以便能夠以簡易的方式實(shí)施用于使細(xì)胞脫附的方法(其為本發(fā)明下文所優(yōu)選的)，特別是自動(dòng)化地實(shí)施該方法。然而，也可以規(guī)定生物反應(yīng)器中液體的量不一定需要被測(cè)量，因?yàn)榉磻?yīng)器區(qū)域的體積是準(zhǔn)確已知的，并且理想的或所需的量因此而同樣是已知的且能夠例如以計(jì)算機(jī)可控的方式被準(zhǔn)確地計(jì)量而加入。特別地，第二反應(yīng)器區(qū)域，特別是被反應(yīng)器底部包圍的反應(yīng)器區(qū)域的體積可以是 5ml 至 20ml ο特別地，第二反應(yīng)器區(qū)域，特別是被反應(yīng)器底部包圍的反應(yīng)器區(qū)域的體積可以是至少10ml。特別地，第二反應(yīng)器區(qū)域，特別是被反應(yīng)器底部包圍的反應(yīng)器區(qū)域的體積可以是至多15ml。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的生物反應(yīng)器的兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域優(yōu)選具有大致相同的大小和 /或占大致相同的體積。根據(jù)本發(fā)明，在此情況中，上部反應(yīng)器區(qū)域優(yōu)選稍微大于，特別是大于下部反應(yīng)器區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器優(yōu)選具有用于固定膜的支撐組件。根據(jù)本發(fā)明，第一反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有用于固定膜的支撐組件。根據(jù)本發(fā)明，第二反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有用于固定膜的支撐組件。根據(jù)本發(fā)明，第一和第二反應(yīng)器外殼部分優(yōu)選具有用于固定膜的支撐組件。根據(jù)本發(fā)明，反應(yīng)器底部和反應(yīng)器蓋優(yōu)選具有用于固定膜的支撐組件。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器外殼(特別是反應(yīng)器外殼部分)由塑料材料或樹脂玻璃制成。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知合適的塑料材料，以及其它可用于生物反應(yīng)器外殼的材料。 可用的塑料材料例如是聚丙烯或聚苯乙烯。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器外殼(特別是反應(yīng)器外殼部分)優(yōu)選至少在局部區(qū)域中是透明的。特別是可以提供透明的局部區(qū)域，使得能夠觀察膜上的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器外殼(特別是反應(yīng)器外殼部分)可以優(yōu)選被消毒。特別是高壓消毒。生物反應(yīng)器的外殼因此能夠使用多次。這提供廣范圍的應(yīng)用。然而，可以規(guī)定將生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)成一次性產(chǎn)品。特別地，可以將生物反應(yīng)器提供為具有下列任選特征中的一個(gè)、多個(gè)或全部的一次性產(chǎn)品-生物反應(yīng)器的所有組件被配置成一次性產(chǎn)品。-生物反應(yīng)器的反應(yīng)器外殼由塑料材料(特別是聚丙烯或聚苯乙烯)制成。
-反應(yīng)器外殼是通過注塑制造的。-膜單元或膜被固定在反應(yīng)器底部。-生物反應(yīng)器蓋能夠從由反應(yīng)器底部和膜單元組成的單元升起。-生物反應(yīng)器具有兩個(gè)移液管開口和可選擇的通風(fēng)口作為僅有的開口。-兩個(gè)移液管開口位于反應(yīng)器蓋的上側(cè)。-第一移液管開口通向第一反應(yīng)器區(qū)域且第二移液管開口通向第二反應(yīng)器區(qū)域。-生物反應(yīng)器具有隔板。-生物反應(yīng)器的寬度為至少6cm且至多12cm，特別是8cm至9cm，且長度為至少 IOcm且至多14cm，特別是至少12cm且至多13cm。-生物反應(yīng)器具有的寬度和長度為標(biāo)準(zhǔn)化多孔板的尺寸。-生物反應(yīng)器的高度為至少Icm且至多10cm。-膜的面積擴(kuò)展為50cm2至120cm2，特別是75cm2至85cm2。特別是，膜的面積擴(kuò)展可以是約80cm2。當(dāng)然，此類生物反應(yīng)器還可以具有本發(fā)明的其它特征和進(jìn)一步的特征。本發(fā)明的生物反應(yīng)器可以被配置成GMP-適應(yīng)性形式，且細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)期間受污染的風(fēng)險(xiǎn)或無菌性的損失被減少。在此情況下，一次性組件的使用被降至最少，卻不顯著增加受污染的風(fēng)險(xiǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知生物反應(yīng)器的可能的形狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地使生物反應(yīng)器的形狀適應(yīng)其要求。根據(jù)本發(fā)明，生物反應(yīng)器優(yōu)選為盒狀、紙板箱狀或罐狀。特別是，所述生物反應(yīng)器能夠具有對(duì)應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)器皿(例如多孔板)的標(biāo)準(zhǔn)長度和寬度的長度和寬度。根據(jù)本發(fā)明，本身不包括微泵的生物反應(yīng)器是優(yōu)選的。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的生物反應(yīng)器的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的生物反應(yīng)器用于培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)用是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的生物反應(yīng)器用于細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增的應(yīng)用是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選是貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選是真核細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選是動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是人類、牛或鼠科動(dòng)物細(xì)胞。可選地，然而，還可以培養(yǎng)原核細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞，特別是如果它們是貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的生物反應(yīng)器在用于由細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生組織的自動(dòng)化裝置中的應(yīng)用是優(yōu)選的。可選地，然而，本發(fā)明的生物反應(yīng)器也能夠被手動(dòng)使用，例如能夠在潔凈工作臺(tái)下組裝和加載，然后在孵育器中進(jìn)行孵育。能夠選擇性地使用生物反應(yīng)器作為單機(jī)模塊(stand-alone module)，或作為整體系統(tǒng)中的組件，例如用于由活體檢查物產(chǎn)生細(xì)胞組織。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)細(xì)胞的方法，本發(fā)明的生物反應(yīng)器被用于培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選在該方法中被培養(yǎng)和擴(kuò)增。本發(fā)明的生物反應(yīng)器允許進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的全自動(dòng)化方法，其優(yōu)選能夠在GMP-適應(yīng)性條件下進(jìn)行。本發(fā)明還特別涉及培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括以下步驟a)提供本發(fā)明的生物反應(yīng)器，b)將細(xì)胞施加至膜單元的膜，c)在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞。在此情況中，規(guī)定上述步驟以特定的順序進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，步驟a)、b)和C)優(yōu)選緊接地連續(xù)進(jìn)行，不涉及其它中間步驟。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選在步驟b)中在液體(特別是細(xì)胞培養(yǎng)基)中培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選是貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選是真核細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選是動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是人類、牛或鼠科動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選將細(xì)胞留在步驟b)中進(jìn)行粘附；然后，在步驟C)開始時(shí)，使生物反應(yīng)器第一次充滿細(xì)胞培養(yǎng)基。其優(yōu)選通過生物反應(yīng)器的開口中一個(gè)進(jìn)行。為了實(shí)現(xiàn)滿足生長條件，例如與細(xì)胞/細(xì)胞接觸以及因此而必需的多次傳代相關(guān)的生長條件，開發(fā)了用原代細(xì)胞填充(populating)細(xì)胞生長膜的新方法。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在步驟b)中使用所述方法。根據(jù)本發(fā)明，在此情況下，提供作為細(xì)胞生長區(qū)域的膜優(yōu)選在填充期間沒有被細(xì)胞液整體潤濕；相反，生成了均勻分布在細(xì)胞生長區(qū)域上的單獨(dú)的細(xì)胞簇。根據(jù)本發(fā)明，懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞優(yōu)選在步驟b)中利用移液管大致恒定地(特別是以恒定的間距)被吸移并滴加在膜上。在長度為IOcm至14cm且寬度為6cm至IOcm的膜中，細(xì)胞特別地以Iml至10ml， 特別是3ml至5ml的總液體體積被施加。總液體量被分成多個(gè)液滴。在此過程中，下列參數(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是可變的液滴體積、液滴間距、 液滴中細(xì)胞的濃度和/或直至第一次替換培養(yǎng)基的等候時(shí)間。這些參數(shù)還允許改變獨(dú)立的細(xì)胞的培養(yǎng)行為。在此情況下，液滴中的細(xì)胞濃度導(dǎo)致維持細(xì)胞生長所必需的細(xì)胞/細(xì)胞接觸，同時(shí)使可利用的細(xì)胞生長區(qū)域的尺寸增加至標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)器皿的細(xì)胞生長區(qū)域的倍數(shù)。此外，此優(yōu)選的填充方法確保細(xì)胞在作為培養(yǎng)區(qū)域的多孔材料中的均勻分布，而在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)器皿中，細(xì)胞隨機(jī)地分布，且在邊緣區(qū)域中的分布一般高于中心處的分布。均勻的細(xì)胞分布的優(yōu)點(diǎn)是填充的多孔材料上的生長條件是單一的。此足夠大的細(xì)胞生長區(qū)域的結(jié)果是， 特別是能夠避免特別是在自動(dòng)化工藝中額外的細(xì)胞傳代步驟，從而免除了對(duì)大量會(huì)妨礙自動(dòng)化工藝和損害細(xì)胞的處理步驟的需要。根據(jù)本發(fā)明，液滴體積優(yōu)選為至少2. 5μ 1且至多30 μ 1。液滴體積可以是例如 2. 5μ 1、5μ 1、10μ 1、20μ 1 $ 30μ 1。根據(jù)本發(fā)明，接種期間液滴中優(yōu)選包含10至500，特別是25至350個(gè)細(xì)胞，例如約 20、40、80、160 或 320 個(gè)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，在接種期間，優(yōu)選將細(xì)胞以約4，000至約20，000細(xì)胞/cm2，特別是約4，000至約16，000細(xì)胞/cm2的細(xì)胞濃度施加至多孔表面。例如，可以向多孔材料，特別是膜施加 4，000 細(xì)胞/cm2、5，000 細(xì)胞/cm2、8，000 細(xì)胞/cm2、10，000 細(xì)胞/cm2、16，000 細(xì)胞/cm2或20，000細(xì)胞/cm2。對(duì)于約80cm2的膜面積，每個(gè)生物反應(yīng)器具有大約320，000至 1，280，000 個(gè)細(xì)胞。
細(xì)胞生長區(qū)域中均勻的逐滴填充使細(xì)胞生長區(qū)域的尺寸能夠成倍增加，而不破壞細(xì)胞成功擴(kuò)增的條件。這樣，能夠?qū)崿F(xiàn)無傳代的細(xì)胞擴(kuò)增所必需的細(xì)胞生長區(qū)域的尺寸。傳代過程中，酶反應(yīng)作用或機(jī)械負(fù)載對(duì)細(xì)胞的其它損害也能夠被減至最少，特別是減至培養(yǎng)期終結(jié)時(shí)細(xì)胞的單一脫附。培養(yǎng)結(jié)束后細(xì)胞采集的時(shí)刻因此優(yōu)選保持為細(xì)胞唯一所需的脫附過程。此外，通過新的脫附方法能夠?qū)⒚笇?duì)細(xì)胞的不良作用最小化。可選地，細(xì)胞生長膜還能夠以不同于吸移液滴的方式被填充，例如通過用懸浮在液體中的細(xì)胞進(jìn)行噴霧而填充。根據(jù)本發(fā)明，貼壁細(xì)胞優(yōu)選保留在步驟b)中以粘附至膜，然后加入液體(特別是
細(xì)胞培養(yǎng)基)以進(jìn)一步培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明，液體優(yōu)選在步驟C)中被再生。這特別地可通過適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口來進(jìn)行。液體可以被連續(xù)地、半連續(xù)地或分步地再生。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，在此情況下，新的液體通過第一或第二反應(yīng)器外殼部分中的開口被引入，且舊的液體通過第一或第二反應(yīng)器外殼部分中的開口被除去。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，在此情況下，新的液體通過反應(yīng)器蓋中的開口被引入，且舊的液體通過反應(yīng)器底部中的開口被除去。可選地，然而，還可以規(guī)定通過移液管開口引入或除去液體。可選地，然而，還可以規(guī)定不使液體再生。可以規(guī)定通過步驟C)的工藝控制對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的寬范圍參數(shù)進(jìn)行計(jì)量測(cè)試，例如通過用于測(cè)量TEER值的電極和/或培養(yǎng)基的自動(dòng)化供應(yīng)進(jìn)行。特別是，可以規(guī)定通過測(cè)量 TEER值確定步驟c)的持續(xù)時(shí)間。在此情況中，步驟c)優(yōu)選可以在達(dá)到所需的細(xì)胞密度時(shí)終止，特別是當(dāng)細(xì)胞幾乎融合或融合時(shí)。根據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)后，優(yōu)選將細(xì)胞在步驟d)中從膜表面脫附。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用適于使細(xì)胞脫附的溶液進(jìn)行脫附。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選進(jìn)行酶促脫附。可使用含酶溶液(例如在現(xiàn)有技術(shù)中也用于使貼壁細(xì)胞脫附的含酶溶液)進(jìn)行酶促脫附。特別是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)使用胰蛋白酶，特別是EDTA溶液中的胰蛋白酶作為酶。 在此情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知合適的胰蛋白酶濃度。根據(jù)本發(fā)明，酶優(yōu)選為胰蛋白酶。然而，也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它酶，例如 Accutase 或 rProtease。酶溶液可通過生物反應(yīng)器開口中的一個(gè)或通過敞開的生物反應(yīng)器倒入。根據(jù)本發(fā)明，適于使細(xì)胞脫附的溶液優(yōu)選通過適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口中的一個(gè)倒入生物反應(yīng)器中，并由此到達(dá)膜。根據(jù)本發(fā)明，所述生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口的位置使得能夠進(jìn)行溫和的脫附工藝以及提高脫附的細(xì)胞的活力。根據(jù)本發(fā)明，粘附至膜的細(xì)胞的脫附優(yōu)選通過酶反應(yīng)來控制，其中酶能夠僅在細(xì)胞層與膜接觸之處通過多孔膜起作用。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在培養(yǎng)后將細(xì)胞從膜的表面脫附，其中將適于使細(xì)胞脫附的溶液倒入反應(yīng)器區(qū)域中，所述反應(yīng)器區(qū)域環(huán)繞未通過該反應(yīng)器區(qū)域中的開口施加細(xì)胞的膜的表面，使得溶液與膜接觸。根據(jù)本發(fā)明，適于使細(xì)胞脫附的溶液優(yōu)選僅與細(xì)胞的與膜連接的
13細(xì)胞分枝(cell branches)接觸。根據(jù)本發(fā)明，適于使細(xì)胞脫附的溶液優(yōu)選通過反應(yīng)器底部的開口引入到生物反應(yīng)器中。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選僅引入如下量的溶液使溶液的充入水平剛及至膜。當(dāng)細(xì)胞優(yōu)選粘附至朝向反應(yīng)器蓋的膜表面時(shí)，適于使細(xì)胞脫附的溶液因此僅與細(xì)胞的與膜連接的細(xì)胞分枝接觸。同樣地，可以通過改變反應(yīng)器的設(shè)計(jì)來修飾脫附過程和通過物理方法輔助酶促脫附，或必要時(shí)，用物理方法替代酶促脫附。物理方法包括向反應(yīng)器底部施加壓力；此外，還可以通過敲擊和/或振動(dòng)生物反應(yīng)器來輔助脫附過程。物理方法還包括使用超聲或從反應(yīng)器下面往上升起氣泡。在本發(fā)明可選的實(shí)施方式中，在步驟d)中，細(xì)胞被酶促脫附，脫附由物理方法輔助。因此加速脫附過程。可以規(guī)定細(xì)胞還在步驟d)或在步驟d)后通過過度壓力脫附。例如，能夠?qū)⑦m于使細(xì)胞脫附的溶液在壓力下壓經(jīng)膜。例如，可以規(guī)定在步驟d)中特別是通過引導(dǎo)系統(tǒng)除去細(xì)胞培養(yǎng)基，以及用PBS/ EDTA充滿兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域并孵育1至30min。取決于細(xì)胞的類型，此過程能夠重復(fù)1至2 次。然后可以將兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域完全排空，然后可以用酶溶液充滿下部反應(yīng)器區(qū)域。經(jīng)過 0. 2至IOmin的特定范圍，并通過施加50至2，OOOPa的特定壓力，酶溶液能夠流經(jīng)膜的孔 (其直徑為0. 1至10 μ m)，甚至到達(dá)細(xì)胞與膜的上側(cè)接觸的點(diǎn)。隨后，可以進(jìn)行孵育步驟， 持續(xù)時(shí)間為0. 5至IOmin0為了輔助脫附過程，在脫附過程中或在其后(即在脫附后)，可以在下部腔室中施加相同壓力范圍的壓力。所述壓力可以以0.1至200Hz的頻率進(jìn)行額外的調(diào)整。另外，可以通過對(duì)整個(gè)反應(yīng)器實(shí)施機(jī)械激發(fā)來強(qiáng)化此過程。所施加的壓力使特別是20ml/(min cm2) 的體積流經(jīng)膜。可以規(guī)定在步驟d)完成后，在步驟e)中將細(xì)胞從膜除去。例如，細(xì)胞可以在細(xì)胞培養(yǎng)基(特別是含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基)中被取出，然后被抽吸或通過移液管被除去。可以規(guī)定在步驟d)完成后，在步驟e)中引入更多適于使細(xì)胞脫附的溶液，由此將細(xì)胞推離多孔表面。可以規(guī)定在步驟d)中或在步驟d)后例如借助胰蛋白酶挑選細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，所述方法優(yōu)選以自動(dòng)化的方式進(jìn)行，特別是在用于由細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生組織的自動(dòng)化裝置中和/或使用機(jī)器人進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在用于由細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生組織的自動(dòng)化裝置中進(jìn)行所述方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物反應(yīng)器能夠進(jìn)行細(xì)胞(特別是貼壁細(xì)胞)的自動(dòng)化細(xì)胞培養(yǎng)。在此情況下，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生長區(qū)域的尺寸的有利增長，同時(shí)滿足細(xì)胞生長的條件。本發(fā)明的生物反應(yīng)器還能夠避免傳代步驟，傳代步驟特別是在自動(dòng)化過程中是非常復(fù)雜的且能夠很容易損害細(xì)胞。本發(fā)明的生物反應(yīng)器優(yōu)選提供一體化計(jì)量，特別是測(cè)量TEER值。因此能夠準(zhǔn)確測(cè)定采集時(shí)刻(harvest moment)，包括特別是在自動(dòng)化工藝中。
本發(fā)明的生物反應(yīng)器使本發(fā)明用于使細(xì)胞從膜脫附的方法能夠節(jié)約細(xì)胞，且其中僅細(xì)胞與膜的接觸點(diǎn)與用于脫附的酶接觸。本發(fā)明的生物反應(yīng)器、其根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用以及本發(fā)明的方法尤其能夠用在被操作用于培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的自動(dòng)化系統(tǒng)中。然而，本發(fā)明的生物反應(yīng)器、其根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用以及本發(fā)明的方法還能夠以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模使用，特別是為了盡量減少污染的風(fēng)險(xiǎn)，以及避免將液體直接計(jì)量至制劑。本發(fā)明的生物反應(yīng)器、其根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用以及本發(fā)明的方法尤其能夠用在用于組織工程的細(xì)胞培養(yǎng)中。本發(fā)明的生物反應(yīng)器、其根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用以及本發(fā)明的方法尤其能夠用在用于產(chǎn)生作為體外測(cè)試系統(tǒng)或移植物的人造皮膚的各種細(xì)胞類型的培養(yǎng)中。本發(fā)明的生物反應(yīng)器、其根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用以及本發(fā)明的方法尤其能夠用在用于產(chǎn)生人造軟骨移植物的各種細(xì)胞類型的培養(yǎng)中。本發(fā)明的生物反應(yīng)器的根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的和可選的實(shí)施方式也應(yīng)當(dāng)被理解為生物反應(yīng)器的應(yīng)用的根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的和可選的實(shí)施方式，以及本發(fā)明的方法的根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的和可選的實(shí)施方式。本發(fā)明的應(yīng)用的根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的和可選的實(shí)施方式也應(yīng)當(dāng)被理解為本發(fā)明的生物反應(yīng)器的根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的和可選的實(shí)施方式，以及本發(fā)明的方法的根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的和可選的實(shí)施方式。本發(fā)明的方法的根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的和可選的實(shí)施方式也應(yīng)當(dāng)被理解為生物反應(yīng)器的應(yīng)用的根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的和可選的實(shí)施方式，以及本發(fā)明的生物反應(yīng)器的根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的和可選的實(shí)施方式。本發(fā)明的特別的實(shí)施方式示于從屬權(quán)利要求中。本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)將體現(xiàn)在下文描述的附圖中，其中m示出組裝狀態(tài)下的本發(fā)明的生物反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)施方式(非真實(shí)比例示意圖)；Sl示出拆卸狀態(tài)下的本發(fā)明的生物反應(yīng)器的優(yōu)選實(shí)施方式(非真實(shí)比例示意圖)；圖3示出本發(fā)明可選的反應(yīng)器蓋的各種視圖；圖4示出本發(fā)明可選的反應(yīng)器底部的各種視圖；和圖5例示本發(fā)明優(yōu)選的用于將細(xì)胞施加至反應(yīng)器的膜單元的膜的方法。Si示出組裝狀態(tài)下的本發(fā)明的生物反應(yīng)器(100)的優(yōu)選實(shí)施方式(非真實(shí)比例示意圖)。所述生物反應(yīng)器由反應(yīng)器底部(20)、反應(yīng)器上部(30)以及由膜(10)和框架 (15)形成的膜單元組成。反應(yīng)器底部00)和反應(yīng)器上部(30)具有用于固定膜(10)的支撐組件01，31)。反應(yīng)器底部00)和反應(yīng)器上部(30)以密封的方式連接，使得僅連接器形式的開口( ，34)通過引導(dǎo)系統(tǒng)(23，33)將反應(yīng)器腔室(22，32)與生物反應(yīng)器(100)的外界連接。引導(dǎo)系統(tǒng)(23，3 確保在細(xì)胞生長膜的整個(gè)區(qū)域上的連續(xù)和均勻的供應(yīng)。任選的通風(fēng)口或移液管開口未示出。反應(yīng)器底部00)和反應(yīng)器上部(30)均具有用于測(cè)量培養(yǎng)細(xì)胞的TEER值的電極06，36)。通過所測(cè)量的TEER值，可以監(jiān)測(cè)生長過程并確定最佳的采集時(shí)刻。
膜(10)具有上側(cè)(11)和下側(cè)(12) 0優(yōu)選地，貼壁細(xì)胞在膜的上側(cè)(11)被培養(yǎng)。 在此情況中，通過開口( ，34)中的一個(gè)使反應(yīng)器腔室(22,3 充滿細(xì)胞培養(yǎng)基。當(dāng)通過電極(沈，36)進(jìn)行的TEER值測(cè)量顯示已到達(dá)最佳的細(xì)胞密度時(shí)，例如細(xì)胞已生長為融合， 則能夠通過下部開口 04)排出細(xì)胞培養(yǎng)基。然后能夠通過開口 04)將含胰蛋白酶的溶液引入到生物反應(yīng)器(100)中。引入溶液的量使得溶液僅剛好接觸到膜(10)。結(jié)果，細(xì)胞從膜表面(11)脫附；然而，僅細(xì)胞的膜接觸點(diǎn)與胰蛋白酶接觸，使得與傳統(tǒng)的細(xì)胞脫附相比， 細(xì)胞受到較少的損害。Sl示出拆卸狀態(tài)下的

圖1的本發(fā)明的優(yōu)選的生物反應(yīng)器(100)(非真實(shí)比例示意圖)。反應(yīng)器上部(30)以及由膜(10)和框架(1 形成的膜單元與反應(yīng)器底部00)分離。膜(10)的膜表面(11)因此是可及的，且能夠進(jìn)行細(xì)胞填充，例如通過向其上吸移細(xì)胞。 其后，反應(yīng)器上部(30)、膜單元和反應(yīng)器底部00)能夠重新組裝。同樣，示出開口 ( ，34)、反應(yīng)器腔室(22，32)和引導(dǎo)系統(tǒng)(23，33)以及電極(26, 36)。_和Mi示出本發(fā)明優(yōu)選的反應(yīng)器蓋(30)和本發(fā)明優(yōu)選的反應(yīng)器底部00)的各種視圖。反應(yīng)器蓋(30)和反應(yīng)器底部00)具有與多孔板大致相同的長度和寬度。對(duì)于這兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分，可以看到支撐組件01，31)。圖3還示出了通風(fēng)口(37)和兩個(gè)移液管開口 08，38)。移液管開口 08)用作通往上部反應(yīng)腔室的通道。移液管開口(38)用作通往下部反應(yīng)腔室的通道。可以通過繞過膜(設(shè)置在反應(yīng)腔室之間)的引導(dǎo)系統(tǒng)以密封的形式實(shí)現(xiàn)該通道。圖3a和如中示出的放大視圖示出網(wǎng)(38a)的具體實(shí)施方式
，所述網(wǎng)有助于液體通過移液管開口的引入。圖4示出安裝的電極06)。兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分00，30)能夠通過鉆孔09，39) 而彼此螺接。圖5例示了本發(fā)明優(yōu)詵的用于將細(xì)胞施加至反應(yīng)器的膜單元的膜的方法。示出了具有膜(10)和框架(15)的膜單元。膜(10)的膜上側(cè)(11)用來自細(xì)胞培養(yǎng)基的含細(xì)胞的液滴(60)均勻地覆蓋。放大視圖示出其內(nèi)包含液滴(61)和細(xì)胞(62)的膜表面(11)的細(xì)節(jié)。表1以實(shí)例的方式示出可使用的各種膜
權(quán)利要求
1.一種用于培養(yǎng)細(xì)胞的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器的反應(yīng)器空間被膜單元細(xì)分成兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域，且其中所述兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域各自具有適于導(dǎo)入和/或?qū)С鲆后w的開口，所述膜單元在至少局部區(qū)域是液體可滲透性的。
2.如權(quán)利要求1所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器能夠拆卸成至少三部分，即a)包圍第一反應(yīng)器區(qū)域的反應(yīng)器外殼部分；b)包圍第二反應(yīng)器區(qū)域的反應(yīng)器外殼部分；c)至少在局部區(qū)域?yàn)橐后w可滲透性的膜單元。
3.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述第一反應(yīng)器外殼部分被配置成反應(yīng)器蓋，且所述第二反應(yīng)器外殼部分被配置成反應(yīng)器底部。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述兩個(gè)反應(yīng)器外殼部分能夠以密封的方式互相連接，特別是通過螺紋連接而互相連接。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述膜單元由膜和框架組成，或者所述膜單元僅由膜組成。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述膜單元是盤狀的，且其被設(shè)置于所述兩個(gè)反應(yīng)器區(qū)域之間，使其兩表面水平。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述膜占所述膜單元面積的 25% 至 100%。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述膜的孔徑為至少0.Ιμπι且至多20 μ m。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述膜單元的膜的孔密度為至少 IO5孔/cm2且至多IO7孔/cm2。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述第一反應(yīng)器外殼部分具有至少一個(gè)尤其提供有無菌過濾器的通風(fēng)口，和/或可關(guān)閉的移液管開口。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器具有用于測(cè)量 TEER值的電極。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器，其中所述生物反應(yīng)器是盒狀或罐狀。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器用于培養(yǎng)細(xì)胞的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器在用于由細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生組織的自動(dòng)化裝置中的應(yīng)用。
15.培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括以下步驟a)提供權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的生物反應(yīng)器；b)將細(xì)胞施加至所述膜單元的膜；c)在所述生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中在培養(yǎng)細(xì)胞后，將細(xì)胞自膜表面脫附，其特征在于將適于使細(xì)胞脫附的溶液倒入反應(yīng)器區(qū)域中，所述反應(yīng)器區(qū)域環(huán)繞未通過該反應(yīng)器區(qū)域中的開口施加細(xì)胞的膜的表面，使得溶液與膜接觸。
17.如權(quán)利要求15至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法以自動(dòng)化的方式進(jìn)行，特別是在用于由細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生組織的自動(dòng)化裝置中和/或使用機(jī)器人進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)細(xì)胞、特別是貼壁細(xì)胞的生物反應(yīng)器，還涉及該生物反應(yīng)器的應(yīng)用，特別是該生物反應(yīng)器在細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)和增殖中的應(yīng)用，且還涉及利用本發(fā)明的生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞的方法。應(yīng)用的一個(gè)特別領(lǐng)域是該生物反應(yīng)器在GMP-適應(yīng)性全自動(dòng)化細(xì)胞培養(yǎng)和增殖中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12M3/06GK102428168SQ201080021059
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2010年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者烏爾麗克·科羅普, 克里斯蒂安·德里克斯, 揚(yáng)·漢斯曼, 海克·瓦勒斯, 米夏埃拉·考夫曼 申請(qǐng)人:弗朗霍夫應(yīng)用科學(xué)研究促進(jìn)協(xié)會(huì)