培育表達(dá)shTRAIL植物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及培育表達(dá)ShTRAIL植物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方式主要有微生物發(fā)酵、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物等傳統(tǒng)生產(chǎn)系統(tǒng)。植物生物反應(yīng)器是指利用植物系統(tǒng)，包括細(xì)胞、組織和器官，以及整株 植物來生產(chǎn)具有應(yīng)用價(jià)值的生物制品（如人或動(dòng)物用疫苗、抗體、激素等），已成為農(nóng)業(yè)和 生物工程制藥領(lǐng)域生產(chǎn)目的蛋白的理想載體。
[0003] 具體而言，植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白主要具有以下優(yōu)勢(shì)：
[0004] 1、成本低、易大規(guī)模生產(chǎn)：相對(duì)于微生物和昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí) 所需要的培養(yǎng)基和復(fù)雜培養(yǎng)條件而言，一旦獲得目的蛋白高表達(dá)、遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物， 則目的蛋白的生產(chǎn)只需要光照、土壤、水分等條件，生產(chǎn)成本較低、易于大規(guī)模生產(chǎn)且環(huán)境 友好。據(jù)估計(jì)，在目的蛋白表達(dá)量占干種子重量的1%且目的蛋白回收率為50%的條件下， 植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)的成本分別為微生物表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的2-10 %和 0? 1%〇
[0005] 2、安全性好：動(dòng)物細(xì)胞源性生物制品由于其原料來源和工藝流程的特殊性，可能 在生產(chǎn)過程中引入毒素、病原體和其它的有毒物質(zhì)且難以去除。與人們對(duì)動(dòng)物源性生物制 品可能由于原料來源而污染有病原微生物的擔(dān)憂不同，由于未發(fā)現(xiàn)人與植物共患病的病原 微生物，且植物原料尤其是種子可耐受嚴(yán)格的表面消毒，因此植物源性的藥用蛋白具有較 高的安全性。
[0006] 3、原料耐貯存：利用微生物、昆蟲細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，待目的蛋白積累 至適宜濃度后，需盡快進(jìn)行下游工藝流程，原料無菌、保鮮等操作工藝復(fù)雜且增加成本。相 對(duì)而言，在谷類作物的種子中表達(dá)目的蛋白，種子經(jīng)收獲、干燥處理后，蛋白酶活力較低、生 命活動(dòng)暫停，目的蛋白能夠在室溫下貯存很長時(shí)間而不顯著降低活性，能夠增強(qiáng)生產(chǎn)工藝 的靈活性。
[0007] 4、較完善的翻譯后修飾系統(tǒng)：原核表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳操作簡單、生長迅速、表達(dá)量 高、易于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。歷史上第一款重組蛋白質(zhì)藥物即是由基因泰克公司利用 大腸桿菌表達(dá)的胰島素產(chǎn)品。然而，由于原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，一些對(duì)蛋白質(zhì)活性至關(guān)重要的 翻譯后修飾，如：信號(hào)肽切割、前肽加工、蛋白質(zhì)折疊、二硫鍵形成和糖基化可能無法完成， 結(jié)果造成原核表達(dá)的一些復(fù)雜的藥用蛋白質(zhì)可能由于無法進(jìn)行正確的折疊、加工而導(dǎo)致生 物學(xué)活性降低。因此，微生物表達(dá)系統(tǒng)一般僅用于表達(dá)一些簡單的藥用蛋白，例如：胰島素、 干擾素、生長激素等。
[0008] 鑒于原核表達(dá)系統(tǒng)在翻譯后修飾能力上的缺陷，科研人員開展了哺乳動(dòng)物細(xì)胞、 酵母、真菌、昆蟲細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等表達(dá)系統(tǒng)的研究工作。發(fā)現(xiàn)其存在著下列問題：發(fā)酵 成本高、產(chǎn)量低、分泌表達(dá)困難、不正確的翻譯后修飾、難于大規(guī)模生產(chǎn)、病毒或朊病毒污染 等問題。
[0009] 植物相對(duì)于酵母或大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是具有實(shí)現(xiàn)絕大多數(shù)蛋白 質(zhì)類藥物生物活性和藥代動(dòng)力學(xué)所必需的翻譯后修飾能力，如：糖基化、酰基化、信號(hào)肽的 去除、寡聚化等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供融合蛋白。
[0011] 本發(fā)明提供的融合蛋白，其包括shTRAIL蛋白及位于其N端的信號(hào)肽，所述 shTRAIL蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2第29-33位氨基酸殘基。
[0012] 上述的融合蛋白中，所述信號(hào)肽為PAH-L或PR-S ;
[0013] 所述PAH-L的氨基酸序列為序列表中序列2第1-20位氨基酸殘基；
[0014] 所述PR-S的氨基酸序列為序列表中序列8第1-25位氨基酸殘基。
[0015] 上述的融合蛋白中，所述融合蛋白還包括位于所述shTRAIL蛋白C端的分選信號(hào) 蛋白；
[0016] 所述分選信號(hào)蛋白具體為AFVY或KDEL ;
[0017] 所述AFVY的氨基酸序列具體為序列4第202-205位氨基酸殘基；
[0018] 所述KDEL的氨基酸序列具體為序列6第202-205位氨基酸殘基。
[0019] 上述的融合蛋白中，所述融合蛋白為如下1)-6)中任一種：
[0020] 1)融合蛋白從N端至C端依次包括信號(hào)肽PAH-L和shTRAIL ;
[0021] 2)融合蛋白從N端至C端依次包括信號(hào)肽PAH-L、shTRAIL和分選信號(hào)蛋白AFVY ;
[0022] 3)融合蛋白從N端至C端依次包括信號(hào)肽PAH-L、shTRAIL和分選信號(hào)蛋白KDEL ;
[0023] 4)融合蛋白從N端至C端依次包括信號(hào)肽PR-S和shTRAIL組成；
[0024] 5)融合蛋白從N端至C端依次包括信號(hào)肽PR-S、shTRAIL和分選信號(hào)蛋白AFVY ;
[0025] 6)融合蛋白從N端至C端依次包括信號(hào)肽PR-S、shTRAIL和分選信號(hào)蛋白KDEL。
[0026] 上述的融合蛋白中，1)所示的融合蛋白為序列2所示的蛋白或?qū)⑿蛄斜碇行蛄? 所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功 能由序列2衍生的蛋白質(zhì)；
[0027] 2)所示的融合蛋白為序列4所示的蛋白或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列經(jīng) 過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列4衍生的蛋 白質(zhì)；
[0028] 3)所示的融合蛋白為序列6所示的蛋白或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列經(jīng) 過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列6衍生的蛋 白質(zhì)；
[0029] 4)所示的融合蛋白為序列8所示的蛋白或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?所示的氨基酸序列經(jīng) 過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列8衍生的蛋 白質(zhì)；
[0030] 5)所示的融合蛋白為序列10所示的蛋白或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?0所示的氨基酸序列 經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列10衍生 的蛋白質(zhì)；
[0031] 6)所示的融合蛋白為序列12所示的蛋白或?qū)⑿蛄斜碇行蛄?2所示的氨基酸序列 經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列12衍生 的蛋白質(zhì)。
[0032] 上述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸 殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0033] 編碼上述融合蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，其具體是如下1)_8)中任 一種的DNA分子：
[0034] 1)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的DNA分子；
[0035] 2)編碼區(qū)為序列表中序列3所示的DNA分子；
[0036] 3)編碼區(qū)為序列表中序列5所示的DNA分子；
[0037] 4)編碼區(qū)為序列表中序列7所示的DNA分子；
[0038] 5)編碼區(qū)為序列表中序列9所示的DNA分子；
[0039] 6)編碼區(qū)為序列表中序列11所示的DNA分子；
[0040] 7)在嚴(yán)格條件下與1)-6)任一限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的 DNA分子；
[0041] 8)與1)-6)任一限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 % 或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0042] 上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0. 5 % SDS的溶液中，在65oC下雜交，然后用 2 X SSC，0? 1 % SDS 和 1 X SSC，0? 1 % SDS 各洗膜一次。
[0043] 含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù) 的范圍。
[0044] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在制備 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0045] 或上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培 育表達(dá)shTRAIL蛋白的植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0046] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種培育表達(dá)shTRAIL蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0047] 本發(fā)明提供的方法，為將編碼上述融合蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得表達(dá) shTRAIL蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。
[0048] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種制備促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)品的方法。
[0049] 上述方法中，為提取上述方法制備的表達(dá)shTRAIL蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的總蛋白， 即得到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)品。
[0050]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，為了實(shí)現(xiàn)shTRAIL的高水平表達(dá)，本研究確定使用兩種信號(hào) 肽（PR-S來源信號(hào)肽、PHA-L來源信號(hào)肽）、兩種蛋白分選信號(hào)（AFVY、KDEL)進(jìn)行信號(hào)序列 組合，以造成目的蛋白的三種亞細(xì)胞靶向部位一一質(zhì)外體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和蛋白質(zhì)貯藏型液泡，并 比較不同亞細(xì)胞靶向?qū)δ康牡鞍妆磉_(dá)量的影響。經(jīng)過對(duì)擬南芥1代轉(zhuǎn)基因植株葉片和種 子、煙草代轉(zhuǎn)基因種子的目的蛋白ELISA檢測(cè)和表達(dá)量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，本研究發(fā)現(xiàn)使 用PHA-L來源的信號(hào)肽將目的蛋白靶向至質(zhì)外體這一策略最有利于shTRAIL的高表達(dá)，其 在轉(zhuǎn)基因擬南芥T 3代種子中的表達(dá)量為442. 29pg/mL。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，shTRAIL在種子中的 豐度高于葉片，說明種子是理想的目的蛋白表達(dá)器官。該研究結(jié)果，可為shTRAIL在煙草和 陸地棉中的表達(dá)提供參考。
[0051] 提取目的蛋白shTRAIL表達(dá)量較高的煙草轉(zhuǎn)基因株系的總蛋白，以野生型煙草總 蛋白為對(duì)照，檢測(cè)shTRAIL對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460的增殖抑制效果，表明植物源性 的shTRAIL具有生物學(xué)活性，能夠抑制NCI-H460的增殖。本研究還在陸地棉中進(jìn)行了組成 型啟動(dòng)子和種子特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)shTRAIL表達(dá)的嘗試，證明該蛋白可以陸地棉為轉(zhuǎn)基因 受體材料進(jìn)行表達(dá)，為將來開展陸地棉種子植物生物反應(yīng)器、提高陸地棉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值奠定 了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0052] 圖1為融合蛋白示意圖。
[0053] 圖2為shTRAIL轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定的部分結(jié)果。
[0054] 圖3為shTRAIL轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定的部分結(jié)果。
[0055] 圖4為不同信號(hào)序列組合的shTRAIL表達(dá)量。
[0056] 圖5為煙草源性shTRIAL的Western blot檢測(cè)。
[0057] 圖6為轉(zhuǎn)基因煙草PCR的鑒定結(jié)果。
[0058] 圖 7 為 GV3101 (pEXPR-PPvphas: : shTRAIL-211)轉(zhuǎn)基因陸地棉的 PCR 檢測(cè)。
[0059] 圖8為pEXPR-PGh a GLOA: : shTRAIL-211轉(zhuǎn)基因煙草不同株系shTRAIL的表達(dá) 量。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0061] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0062] 擬南芥（col-0)記載在如下文獻(xiàn)中：擬南芥PMRP的表達(dá)特性及功能分析，中國農(nóng) 業(yè)科學(xué)，2014, 47 (15) : 3094-3102,以下也稱為野生型擬南芥。
[0063] 本氏煙草（N. benthamiana)NC89記載在如下文獻(xiàn)中：同步抑制FAD2與FatB基因 提高煙草種子油酸組分含量的研究；西北植物學(xué)報(bào)，2015, 35(2) :0245_0251，以下也稱為野 生型煙草。
[0064] 陸地棉（Gossypium hirsutum)品種'河字 312'（Coker312)，記 載在如 下文南犬中：Effects of hygrom