專利名稱：利用廢菌體的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及液體培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及同時高效生產β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及制造這兩種酶中使用的液體培養基。
背景技術：
近年來，為了有效利用纖維素資源，人們探索了有效分解纖維素的方法。人們已經了解到自然界中纖維素主要是被微生物分解的，細菌和絲狀菌等各種各樣的微生物生產纖維素分解酶。這些微生物將纖維素分解酶分泌到菌體外，纖維素經該酶作用后，主要經纖維低聚糖(Cellooligosaccharides)、纖維二糖被分解為葡萄糖。纖維素分解酶一般稱為纖維素酶。人工制造纖維素酶時，作為分泌纖維素酶的微生物已知有木霉屬的微生物，并被廣泛利用。而且，也已經知道利用含有碳源和氮源等營養素的培養基培養屬于木霉屬的微生物，可使其分泌纖維素酶的方法。然而，以前用于制造纖維素酶的方法，作為碳源能夠使用的材料受到限制，高價的結晶纖維素，或者即使假如為價格便宜的纖維素資源，也要進行加熱處理或堿處理等前處理，所以需要較高的成本。例如，專利文獻1報道了將廢紙于硫酸亞鐵溶液中蒸煮，可接種纖維素酶生產菌的纖維素酶生產用底物。另外，專利文獻2報道了將微粉碎的甘蔗渣于氫氧化鈉中蒸煮，然后再用次氯酸鹽溶液處理，作為可接種纖維素酶生產菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的生產纖維素酶用底物的制造方法。另外，利用這些以往方法得到的纖維素酶主要含β -葡聚糖酶，而木聚糖酶活性低，對于像甘蔗渣和稻秸等那樣的含木聚糖的纖維素資源的分解能力差。因此，對于目的是有效利用天然存在的各種各樣的纖維素資源來說效率低。專利文獻3報道了包括對屬于里氏木霉的變異株進行液體培養，對得到的纖維素酶進行提取的工序在內的纖維素酶的制造方法。作為培養基的碳源，羅列了纖維素粉末、纖維二糖、濾紙、一般紙類、鋸末、麥糠、稻殼、甘蔗渣、大豆粕、咖啡粕等化學構造和性質不同的各種材料(第0011段落)。然而，其中培養操作實際使用的材料只是纖維二糖(實施例1)和微晶纖維素(實施例2、，而有關其他材料，即天然纖維素材料，沒有證實纖維素酶的生成。專利文獻4報道了使用除去了固體構成成分以及進行非揮發成分的濃縮，對濃縮物進行高壓釜處理等予處理的黑麥稀乙醇蒸餾廢液，對屬于木霉屬的微生物進行培養，制造木聚糖酶的方法。然而，由于本技術中作為碳源使用的黑麥獲得困難，還必須進行復雜的前處理，因此需要高成本，另外，使用該方法反倒使β-葡聚糖酶的產量降低了。
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另外，在通過培養微生物的醫藥品原料、營養補充原料、健康需求的原料、嗜好性原料、食藥品的原料及其中間體等生產中，在提取目的成分后剩下的菌體、培養基等都作為廢品被處理掉了。然而，為了廢棄菌體、培養基，為了不給環境造成惡劣影響必須要進行失活和分離等無害化處理，勢必需要勞力和費用。為了解決這樣的問題，例如，專利文獻5報道了可將由ftOpionihcter屬或 I^eudomonas屬等發酵生產后的廢菌體作為蘑菇子實體栽培用培養基或培養基再利用。然而，利用廢菌體作為用于同時高效生產β-葡聚糖酶和木聚糖酶的培養基至今還沒有報道。以往技術文獻專利文獻專利文獻1 日本特開2003-137901專利文獻2 日本特公平5-33984號公報專利文獻3 日本特開平9-163980號公報專利文獻4 日本特開平11-113568號公報
專利文獻5 日本特開2003-47338

發明內容
發明要解決的課題本發明正是要解決上述以往的問題的發明，發明的目的就在于以低成本制造對含有木聚糖的纖維素資源具有優良分解能力的纖維素酶。用于解決課題的手段本發明者等對同時高效生產葡聚糖酶和木聚糖酶，分解(糖化)纖維素資源的酶的制造方法以及該酶的制造進行不斷的銳意研究，結果發現通過作為液體培養基的營養源使用廢菌體，對屬于木霉屬的微生物進行培養的可同時高效生產β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法以及對制造該酶有用的液體培養基。本發明提供一種β -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有廢菌體的液體培養基作為有機氮源，對屬于木霉屬的微生物進行培養的工序。在某一實施方式中，所述廢菌體在所述液體培養基中的濃度為W/V以上。在某一實施方式中，所述廢菌體在所述液體培養基中的濃度為2 10% W/V。在某一實施方式中，所述廢菌體的原料是屬于木霉屬的微生物。在某一實施方式中，所述屬于木霉屬的微生物是里氏木霉。在某一實施方式中，所述液體培養基還含有作為碳源的天然纖維素材料以及作為氮源的氨態氮或氨基態氮。在某一實施方式中，所述天然纖維素材料在所述液體培養基中的濃度為2% W/V 以上。在某一實施方式中，所述天然纖維素材料為選自紙漿、啤酒粕、麥茶抽提粕、小麥麥糠和蘋果渣餅中的至少一種。在某一實施方式中，在培養的過程中對所述液體培養基追加廢菌體。另外本發明提供一種液體培養基，其含有廢菌體作為有機氮源，用于培養屬于木霉屬的微生物。在某一實施方式中，含有W/V以上的所述廢菌體。另外，本發明提供一種β -葡聚糖酶和木聚糖酶，其是任意前述方法制造的。另外，本發明提供一種纖維素資源的分解或糖化方法，其特征在于，使用所述的 β-葡聚糖酶和木聚糖酶。發明的效果本發明由于有效利用了廢菌體，使產業廢棄物減少，有益于環境問題的解決。另夕卜，由于可同時高效生產作為纖維素分解酶的葡聚糖酶和木聚糖酶，對于甘蔗渣和稻秸等天然纖維素資源的糖化極其有用。特別是對由纖維素資源制造酒精的生物量乙醇制造有用。


圖1是表示在含有3%的復寫紙的液體培養基中的、相對于廢菌體濃度的培養上清液的酶活性變化的圖。圖2是表示在含有的結晶纖維素的液體培養基中的、相對于廢菌體濃度的培養上清液的酶活性變化的圖。圖3是表示在使用實施例1得到的1. 5%廢菌體的培養基以及參考例1得到的 1.5%廢菌體的培養基的各個上清液，對稻秸糖化時，對生成的葡萄糖濃度進行比較的圖。圖4是表示在使用實施例1得到的1. 5%廢菌體的培養基以及參考例1得到的 1.5%廢菌體的培養基的各個上清液，對纖維素原料糖化時，對生成的葡萄糖濃度進行比較的圖。圖5是表示在含3%啤酒粕的液體培養基中，使用0. 2%多價胨得到的酶活性，以及相對于廢菌體濃度的培養上清液的酶活性的變化的圖。圖6是表示在含5%麥茶抽提粕的液體培養基中，使用0. 2%多價胨得到的酶活性，以及相對于廢菌體濃度的培養上清液的酶活性的變化的圖。圖7是表示在含5%小麥麥糠的液體培養基中，相對于廢菌體濃度的培養上清液的酶活性的變化的圖。圖8是表示在含4%蘋果渣餅的液體培養基中，相對于廢菌體濃度的培養上清液的酶活性的變化的圖。圖9是表示在含3%復寫紙的液體培養基中，相對于玉米浸漬液(Corn Steep Liquor)濃度的培養上清液的酶活性的變化的圖。圖10是表示在含3%復寫紙的液體培養基中，相對于多價胨濃度的培養上清液的酶活性的變化的圖。
具體實施例方式液體培養基本發明的液體培養基是含有屬于木霉屬微生物成長的營養的材料。這樣的液體培養基是將培養基的營養成分溶解或懸浮于IOOml水的液體培養基(一般稱為Mandel培養基)為基礎調配的，含有作為介質的水、作為有機氮源的廢菌體等；根據需要，含有作為碳源的天然纖維素材料等；根據需要，含有作為氮源的氨態氮或氨基態氮等。以下給出了本發明理想的培養基組成的一個例子。培養基組成(本發明)含有廢菌體lg、天然纖維素材料3 5g、(NH4) 2S04 :0. 14g、KH2PO4 :1. 5g、 CaCl2 · 2H20 :0. 03g、MgSO4 · 7H20 :0. 03g、吐溫 80 :0. 1ml、微量元素液(H3BO4 6mg、 (NH4)6Mo7O24 ·4Η20 26mg,FeCl3 ·6Η20 lOOmg、CuSO4 ·5Η20 40mg、MnCl2 ·4Η20 8mg、ZnSO4 ·7Η20 200mg液):0. 1ml、水:100ml (用磷酸或氫氧化鈉將PH調整為4. 8)另外，作為參考，以下給出了 Mandel培養基的培養基組成的典型例子。培養基組成(Mandel培養基)含有多價胨0. 2g、結晶纖維素(Fluka BioChemika生產、商品名微晶纖維素 PH101) :lg、(NH4)2SO4 :0. 14g、KH2PO4 :1. 5g、CaCl2 · 2H20 :0. 03g、MgSO4 · 7H20 :0. 03g、吐溫 80 :0. 1ml、微量元素液(H3BO4 6mg、(NH4)6Mo7O24 ·4Η20 26mg,FeCl3 ·6Η20 1 OOmgXuSO4 ·5Η20 40mg、MnCl2 · 4H20 8mg, ZnSO4 · 7H20 200mg 液):0. 1ml、水:100ml (用磷酸或氫氧化鈉將 PH 調整為4. 8)需要說明的是，有時取代作為有機氮源的多價胨，而使用玉米浸漬液(corn steep liquor)。所謂廢菌體指的是使微生物增殖生產像酶那樣的物質生產過程中，提取目的成分之后殘留的菌體和培養基等殘渣，或者其加工物。作為廢菌體原料的微生物只要是確認對人體是安全的種類，沒有特別限定。例如、屬于木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、頂孢霉屬(Acremonium)、分枝抱屬(Sporotrichum)> 青霉屬(Penicillium)、碟節菌屬 (Talaromyces)、腐質霉屬(Humicola)、Neocallimastix 屬、嗜熱真菌屬(Thermomyces 屬) 或梭菌屬(Clostridium)、鏈霉屬(Str印tomyces)的微生物對人體是安全的，可以用作本發明的液體培養基。其中優選的微生物是屬于木霉屬的微生物。優選的屬于木霉屬的微生物為里氏木霉或綠色木霉(Trichoderma viride)。特別優選里氏木霉。廢菌體的制造方法，首先是將作為原料的微生物接種于適當的培養基中，在適當的條件下進行培養，獲得培養液。培養中使用的培養基優選Mandel培養基那樣的液體培養基。因為從培養液中容易分離菌體。在一優選的實施方式中，用于制造廢菌體的培養與本說明書中說明的本發明方法使用的培養相同。然后，將培養后得到的培養液分離為上清液和菌體。分離方法可以使用通常的方法，例如，過濾法以及離心分離法等。培養液或上清液在分離工序前或后對微生物用高壓爸，例如，于121°C進行15分鐘加熱滅菌殺死菌體。該微生物的加熱滅菌可以在添加到培養基前進行，也可以在添加到培養基后通過對培養基加熱滅菌來進行。加熱工序和分離工序可以進行多次。由培養液分離的濕菌體殘渣可直接作為廢菌體使用。也可以使該濕菌體進一步干燥，做成干燥菌體殘渣后作為廢菌體使用。干燥方法可以使用通常方法，例如，自然干燥法、 熱風干燥法、減壓干燥法以及噴霧干燥法等。液體培養基中的廢菌體濃度優選W/V以上。液體培養基中的廢菌體的濃度更優選2 10% W/V、進一步優選2 8% W/V、3 6% W/V。當廢菌體濃度達不到1 % W/V時，纖維素酶、特別是木聚糖酶的產量有時增大量不大。所謂天然纖維素材料指的是原樣保持天然存在的分子構造的非水溶性纖維素。例如，紙、紙漿、啤酒粕、麥茶抽提粕、小麥麥糠、蘋果渣餅那樣的果實渣餅等就屬于天然纖維素材料。反之，例如，像纖維二糖和微晶纖維素那樣的結晶纖維素是纖維素通過纖維素酶分解，以具有特定結構的方式進行精制得到的純化合物，不屬于這里所說的天然纖維素材料。所謂紙漿指的是制造紙類的原料中使用的纖維。紙漿的種類優選像化學紙漿和廢紙紙漿那樣纖維素純度高的紙漿。優選的紙漿是來自于將紙類分解、切斷等之后得到的紙類的紙漿。作為優選的紙類的具體例子，如高級紙、低級紙、復寫用紙、報紙以及瓦楞紙板紙等。紙類只要優選的含有紙漿的都可以，可以是印刷過或用筆寫過的紙以及一般稱為廢紙的紙。例如，可以使用舊書、雜志以及用過的筆記本紙、活頁紙、信封、便箋、明信片、綿紙 (tissue paper)等。液體培養基中的紙漿濃度優選2% W/V以上。如果紙漿濃度達不到2% W/V，則纖維素酶、特別是葡聚糖酶的產量有時增大量不大。液體培養基中的紙漿濃度優選3% W/V以上、更優選4% W/V以上、5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上。另外，為了容易進行液體培養基的攪拌混合，紙類最好是用撕碎機(shredder)裁斷后使用。所謂啤酒粕指的是啤酒制造工序中的副產品，是使大麥發芽了的麥芽糖化后，將麥汁過濾除去后剩下的殘渣。對大麥的種類、副原料的種類等沒有限制，另外本發明的啤酒粕也包括使麥芽的使用比率降低了的發泡酒等制造工序中的副產品殘渣。啤酒粕在啤酒制造工序中大量產生，容易獲得。而且由于啤酒粕是食品制造的副產物，都嚴格進行原料階段的品質檢查以及制造工序管理，所以衛生品質上非常安全。作為啤酒粕的種類，例如有生啤酒粕、脫水啤酒粕、干燥啤酒粕。液體培養基中的啤酒粕開始濃度優選2% W/V以上。如果啤酒粕濃度低于2% W/ V，纖維素酶、特別是β-葡聚糖酶的產量有時增大量不大。液體培養基中的啤酒粕濃度優選3% W/V以上、更優選4% W/V以上、5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上。所謂麥茶抽提粕指的是用水等抽提溶劑從焙煎了的麥粒抽提出水溶性成分后剩下的殘渣。麥茶抽提粕在麥茶的制造工程中大量產生，容易獲得。而且由于麥茶抽提粕是食品制造的副產物，都嚴格進行原料階段的品質檢查以及制造工序管理，所以衛生品質上非常安全。可作為麥茶抽提粕原料的麥子只要是適于制造麥茶的，其種類沒有特別限定。一般在麥茶的制造中都用大麥，例如，六條大麥、二條大麥、去殼大麥燕麥等。其中優選六條大麥和二條大麥。也可以將它們混合后使用。麥茶抽提粕的制造方法，首先對大麥等的麥粒進行焙煎。焙煎方法一般有熱風焙煎、砂炒焙煎、遠紅外焙煎等。焙煎時的溫度為100 700°C、優選200 600°C，焙煎時間為1 60分鐘，優選5 60分鐘。然后將焙煎了的麥粒浸漬于抽提溶劑中，優選地加熱到80°C以上。抽提溶劑一般使用水。通過用熱水煮，麥粒中含有的水溶性成分被抽提到水中。在從麥粒抽提的水溶性成分中含有風味成分和淀粉等。抽提時間沒有特別限定，優選于20分鐘至1小時范圍內進行。
然后，分離抽提液作為麥茶，剩下的物質為麥茶抽提粕。抽提液的分離可以用傾析、過濾、離心分離等通常的方法進行。而麥茶抽提粕，根據需要可進行洗凈、脫水、干燥等處理。液體培養基中的麥茶抽提粕的濃度優選3% W/V以上。如果麥茶抽提粕的濃度達不到3% W/V，纖維素酶、特別是葡聚糖酶的產量有時增大量不大。液體培養基中的麥茶抽提粕的濃度更優選4% W/V以上、更優選5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上、8% W/V以上。所謂小麥麥糠指的是小麥的外皮和胚芽的混合物。而從小麥去除小麥麥糠(即外皮和胚芽)后細微化后的產物是小麥粉。小麥麥糠作為例如工業上獲得食用小麥粉的制造面粉工序的副產物而大量產生，很容易得到。而這樣的小麥麥糠由于是制造食品的副產物， 所以都嚴格進行原料階段的品質檢查以及制造工序管理，衛生品質上非常安全，優選地用于本發明的方法中。用于制備小麥麥糠的小麥的種類沒有特別限定，如北進(*々ν >，Hokushin), 福清(么< 々力、Fukusayaka)、農林61號、南部小麥(f > 7·· 二 Λ年，Nanbukomugi)、北之香(今夕乂力才1J , Kitanokaori)、春富(‘、卟二夕力，haruyutaka)、春之戀(春忑戀)寸。一般小麥麥糠的粒子形狀為薄片狀。薄片狀的小麥麥糠可原樣使用。也可以將它們適當粉碎，使粒子細化后使用，還可以造粒使其形成粒子的塊狀后使用。小麥麥糠的形態，可以是例如、大的麥糠、小的麥糠、粉末等。也可以使用作為食品原料以及健康食品等市場上銷售的產品。液體培養基中的小麥麥糠濃度優選為3% W/V以上。如果小麥麥糠的濃度低于3% W/V，纖維素酶、特別是β-葡聚糖酶的產量有時增大量不大。液體培養基中的小麥麥糠濃度更優選4% W/V以上，更優選在5% W/V以上、6% W/V以上、7% W/V以上、8% W/V以上。所謂果實渣餅指的是在果汁等的制造工序中的副產品，將果實壓榨后，濾去果汁后剩下的殘渣。果實渣餅在果汁等的制造工序中大量產生，容易獲得。而且由于果實渣餅是食品制造的副產物，所以都嚴格進行原料階段的品質檢查以及制造工序管理，衛生品質上非常安全。果實渣餅優選蘋果、梨、桃、櫻桃、草莓等那樣的薔薇科果實的渣餅。優選蘋果渣餅，因為能夠高效生產所期望的酶。蘋果的品種只要迄今為止用于制造蘋果果汁的蘋果就可以，例如、“富士”、“律輕 (。力、'3 ) ”、“王林”、“紅金蘋果(夕 3 f) ”、“紅星蘋果(Starking delicious) ”、 “陸奧”等。蘋果的果實無論是完全成熟的，還是未完全成熟的都可以。果實渣餅的制造方法，首先將果實洗凈。此時如果有不適合作原料的果就去除掉。 將洗凈的果實送入破碎機，進行破碎。破碎的果實通過泵等輸送到油壓搾汁機，進行搾汁。 然后從搾汁機回收渣餅。果實渣餅根據需要還可進行洗凈、脫水、干燥等處理。液體培養基中果實渣餅的濃度優選2% W/V以上。果實渣餅的濃度如果低于2% W/V，纖維素酶、特別是β-葡聚糖酶的產量有時增大量不大。液體培養基中果實渣餅的濃度更優選3% W/V以上、更優選3% W/V以上、4% W/V以上、5% W/V以上、6% W/V以上。液體培養基中天然纖維素材料的濃度越高越好。即，其上限為可以對液體培養基進行攪拌混合的限度的量。因為如果液體培養基不能攪拌，微生物就不能均一地混合在液體培養基中，培養就不能正常進行。液體培養基中紙漿濃度的上限根據攪拌設備的性能，可以為 20、15、10 或 8% ff/V0天然纖維素材料中，除紙、紙漿以外的材料，例如、啤酒粕、麥茶抽提粕、小麥麥糠和果實的渣餅等優選地在導入液體培養基時進行前處理。優選的前處理為，例如粉碎處理和脫木質素處理。如從這些天然纖維素材料除去木質素，則堅固的細胞壁被破壞，使得纖維素容易利用，酶的生產也變得容易。另外通過對天然纖維素進行粉碎處理，可以更有效地進行脫木質素處理。脫木質素處理的方法雖然沒有特別限定，例如可舉出以下方法在像氫氧化鈉那樣的強堿性物質存在下，或者在像硫酸或磷酸那樣的強酸性物質存在下，高溫加熱，使其分解的方法；通過微生物使其分解的方法；在高溫 高壓下通過水熱處理使其分解的方法。如果考慮到對處理設備和環境的負荷，優選高溫·高壓下通過水熱處理使其分解的方法。另外，還可以進一步進行加熱殺菌等對液體培養基的原料通常進行的前處理。所謂氨態氮指的是氨或由氨衍生的銨鹽中含有的氮。而所謂的氨基態氮指的是胺或由胺衍生的氨基化合物中含有的氮。含有氨態氮或氨基態氮的化合物，例如為硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨、氨水、尿素、氨基酸及其鹽(例如，亮氨酸、谷氨酸鈉)。其中，作為氮源適用于本發明的液體培養基的特別優選的化合物是硫酸銨。其理由是價格低，而且很容易得到。液體培養基中氨態氮或氨基態氮的濃度，以銨的摩爾數表示，為30 660mM。優選 40 580mM。如果濃度低于30mM，纖維素酶、特別是β -葡聚糖酶的產量有時增大量不大。 另外，該濃度如果超過660mM，酶的生產率將降低。另外，液體培養基中氨態氮或氨基態氮的濃度優選地根據液體培養基中天然纖維素材料濃度進行增減，例如，天然纖維素材料濃度為4% W/V時，如果考慮到成本等因素，優選50mM。g -葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法人們已經了解木霉屬絲狀菌是纖維素糖化所需要的纖維素酶的生產菌。本發明中使用的屬于木霉屬的微生物只要是能生產纖維素酶，沒有特別限定。屬于木霉屬的微生物優選里氏木霉或綠色木霉。特別優選里氏木霉。絲狀菌里氏木霉和綠色木霉的菌學性質例如在E. G. Simmons, Abst. 2nd International Mycological Congress (美國福羅里達州 Tampa，1077 年 8 月)618 頁中有報道。液體培養使用通常的通氣攪拌培養設備，使用上述本發明的液體培養基，培養溫度為20 33°C，優選為觀 30°C，培養pH為4 6，培養4 10天。從培養最初就使用上述液體培養基的情況下，液體培養基中含有的成分(例如、碳源和氮源)的濃度相當于本發明的培養方法中上述成分的初期濃度。在培養過程中也可以向液體培養基中追加廢菌體。由于隨著培養進行，培養基中的廢菌體被分解，有時通過補充廢菌體可以提高纖維素酶的產率。在追加廢菌體的情況下，在培養過程中也可以根據需要適當追加天然纖維素材料、氨態氮或氨基態氮。然后通過離心分離、過濾等眾所周知的方法從該培養液中除去菌體，可得到木霉屬絲狀菌培養上清液。在木霉屬絲狀菌培養液或培養上清液中含有高濃度的目的的纖維素酶，即β-葡聚糖酶和木聚糖酶。得到的培養液或培養上清液的β -葡聚糖酶活性在30U/ml以上，優選在50U/ml 以上，更優選在60U/ml以上，更優選在70U/ml以上。而該培養液或培養上清液的木聚糖酶活性在25U/ml以上，優選在30U/ml以上，更優選在40U/ml以上，更優選在50U/ml以上。培養液或培養上清液的葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性中的任一個如果低于上述下限，對于目的是有效利用天然存在的各種各樣纖維素資源的效果就要降低。另外，上述半纖維素酶活性可以通過以來自“oat spelts”的木聚糖為底物的酶加水分解后生成的還原糖與DNS反應，以540nm的吸光度的增加量進行定量。更具體來說，向1. 9ml 木聚糖底物溶液中(將Sigma公司生產的“Xylan，from oat spelts”溶解在200mM醋酸緩沖液(pH4. 5)中)加入0. Iml培養液或培養上清液，然后于40°C下準確進行10分鐘酶反應后，加^ilDNS試劑(含有0. 75%二硝基水楊酸、1. 2%氫氧化鈉、22. 5%酒石酸鈉鉀4水和物、0. 3%乳糖1水和物)，進行充分混合，停止反應。為了對反應停止液中含有的還原糖量進行定量，將反應停止液于沸騰水浴中準確加熱15分鐘。 然后冷卻到室溫后，通過測定540nm的吸光度以相當于木糖的還原糖量進行定量。1單位的半纖維素酶活性以于40°C下反應10分鐘的條件下，1分鐘生成相當于1 μ mol木糖的還原糖的酶量表示。本發明中所謂的“對屬于木霉屬的微生物進行培養”指的是像技術常識那樣對該微生物進行培養的操作。即，在以制造葡聚糖酶和木聚糖酶為目的，進行液體培養的方法中，只要至少存在在上述本發明的液體培養基中培養屬于木霉屬的微生物的過程，該培養方法屬于本發明的方法。一旦進行培養，液體培養基的營養由于屬于木霉屬的微生物的消費而減少。因此， 在培養末期，培養基中的碳源和氮源(包括有機氮源)的濃度低于規定的濃度，結果可能在不屬于本發明液體培養基的培養基中培養屬于木霉屬的微生物。即便在這樣場合，例如在開始培養時刻，使用的液體培養基屬于含有規定濃度的碳源、氮源的本發明的液體培養基時，至少在培養初期是在本發明的液體培養基中培養屬于木霉屬的微生物，所以該培養方法當然屬于本發明方法。另外，在這樣特別是從培養開始時刻起就大量含有碳源的情況下，如上所述，考慮到對液體培養基進行攪拌混合時的方便性，優選地將碳源、氮源濃度的上限限制在某一程度。相反，即使在培養初期，培養基中的碳源或氮源濃度比規定濃度低，使用不屬于本發明的液體培養基的培養基進行培養，只要例如，在培養開始后再追加，使培養基中的碳源或氮源濃度達到規定濃度以上時，由于之后在本發明的液體培養基中培養了屬于木霉屬的微生物，所以該培養方法也屬于本發明方法。纖維素原料的分解或糖化方法通過本發明的方法得到的β -葡聚糖酶和木聚糖酶可用于對纖維素原料進行分解或糖化。這里所說的纖維素原料可為合成纖維素或天然纖維素資源。所謂合成纖維素表示作為纖維素粉末已經流通的材料。所謂天然纖維素資源可舉出甘蔗渣、稻秸、麥秸、啤酒粕、木材等。本發明由于可以同時高效生產葡聚糖酶和木聚糖酶，所以特別適于對甘蔗渣、稻秸、麥秸、啤酒粕等天然纖維素資源的糖化。
纖維素資源的分解或糖化方法只要是使用眾所周知的方法就可以，沒有特別限制，舉一例子，使作為底物的纖維素原料懸浮于水性介質中，添加上述培養液或培養上清液，一邊攪拌或震蕩，一邊加溫進行糖化反應的方法。代替顯示纖維素分解活性的上述培養液或培養上清液，也可以使用其干燥物、或使干燥物分散或溶解于水后的液體。纖維素原料最好預先進行脫木質素。懸濁方法、攪拌方法、上述混合液的添加方法、添加順序、它們的濃度等反應條件可以按照能夠以更高收率獲得葡萄糖那樣進行適當調整。此時的反應液的pH和溫度只要是處于不使酶失活的范圍內就可以，一般來說，在常壓下進行反應時，溫度可設定在30 70°C、pH為3 7的范圍。另外，該壓力、溫度、pH 也可以像上述那樣，按照能夠以更高收率獲得葡萄糖那樣進行適當調整，然而常壓下，在醋酸或磷酸緩沖液中，優選在溫度50 60°C、pH4 6的范圍下進行。反應時間一般為6 147小時、優選24 72小時。通過纖維素的糖化，可以得到含有葡萄糖的水溶液。得到的水溶液可以根據需要， 實施脫色、脫鹽、除酶等精制處理。精制方法只要是眾所周知的方法沒有特別的限制，例如， 可以使用活性碳處理、離子交換樹脂處理、色譜分析處理、精密過濾、超濾、反滲透過濾等過濾處理、晶析處理等，可以單獨使用這些處理方法，也可以使用2種以上處理方式組合。通過上述方法精制了的葡萄糖為主要成分的水溶液可以直接使用，也可以根據需要，通過干燥使其固化。干燥方法只要是眾所周知的方法，沒有特別限制，例如，可以使用噴霧干燥、冷凍干燥、鼓式干燥、薄膜干燥、板式干燥、氣流干燥、真空干燥等，可以單獨使用這些方法，也可以使用2種以上處理方式組合。實施例以下通過實施例對本發明進行更具體說明，但本發明并不限定于這些實施例。實施例1將里氏木霉QM9414接種在Mandel培養基中，在與本實施例中說明的同樣條件進行培養，得到培養液。將得到的培養液經離心分離機(BECMAN COULTER公司生產“Avanti HP-25”)分離，進行集菌。使該菌體殘渣于約60°C下干燥約M小時，獲得廢菌體。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在下培養7 天，使孢子充分形成。然后在帶擋板的500mL容量三角燒瓶中像下述那樣準備IOOmM的液體培養基將作為Mandel培養基碳源的結晶纖維素置換為復寫紙3% (3g/100ml)，另外添加作為無機氮源的硫酸銨，而將作為有機氮源的多價胨換成上述廢菌體，廢菌體濃度按照分別達到0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%、3. 0%的方式添加，再用磷酸或氫氧化鈉將pH調整到4. 8。接下來液體培養基用高壓釜在121°C下進行15分鐘的加熱滅菌。然后將1白金圏的培養了的里氏木霉接種于該液體培養基，于、ISOrpm下震蕩培養7天。在第7天，對培養液進行離心分離，測定上清液的β -葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。(酶活性的測定) 對上述得到的培養液進行酶活性測定。 β -葡聚糖酶活性，使用Mega-Zyme公司生產的β -葡聚糖酶測定試劑盒，通過對以色素標記了的葡聚糖為底物進行酶分解生成的染色片段進行吸光度測定。具體來說，向0. ImL偶氮大麥葡聚糖底物溶液中加入0. ImL培養液，于40°C下準確進行10分鐘酶
11反應后，加0. 6mL停止液(含有4 %醋酸鈉、0. 4 %醋酸鋅、80 %甲氧基乙醇(pH5)〕，放置5 分鐘，停止反應。然后離心分離后，測定上清液590nm的吸光度。1單位的β-葡聚糖酶活性以在40°C、反應10分鐘條件下，以1分鐘內生成相當于1 μ mol葡萄糖的還原糖的酶量表示。
而木聚糖酶活性，通過以來自“oat spelts”的木聚糖作為底物的酶加水分解生成的還原糖與DNS反應，通過MOnm吸光度的增加值進行定量。更具體來說，向1. 9ml的
木聚糖底物溶液[將Sigma公司生產的“Xylan，from oat spelts”溶解于200mM醋酸緩沖液(PH4. 5)]中加入0. ImL培養液，于40°C下準確進行10分鐘酶反應后，加入4mLDNS試劑 (含有0. 75%二硝基水楊酸、1. 2%氫氧化鈉、22. 5%酒石酸鈉鉀4水和物、0. 3%乳糖1水和物)充分混合，使反應停止。為了對反應停止液中含有的還原糖量進行定量，將反應停止液于沸騰水浴中準確加熱15分鐘。然后冷卻至室溫后，通過測定540nm的吸光度，以相當于木糖的還原糖量進行定量。1單位的木聚糖酶活性以于40°C、10分鐘的反應條件下，1分鐘生成相當于Iymol木糖的還原糖的酶量表示。結果如圖1所示。參考例1將Mandel培養基的作為碳源的結晶纖維素(Fluka BioChemika生產、商品名微晶纖維素PH101)的濃度調整為1%，而將作為有機氮源的多價胨換成像實施例1那樣得到的廢菌體，分別按照濃度達到0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%、3. 0%的方式進行添加，像實施例 1那樣準備液體培養基。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上于下，培養7天，使孢子充分形成，將1白金圏的該孢子接種于液體培養基，于^°C、 ISOrpm下，震蕩培養7天。在第7天，對培養液進行離心分離，像實施例1那樣測定β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結果如圖2所示。實施例2使用實施例1中得到的培養上清液(3%復寫紙、1. 5%的廢菌體)以及參考例1中得到的培養上清液(1%微結晶纖維素培養基、1. 5%的廢菌體)，進行纖維素原料的糖化試驗。作為供糖化用的纖維素原料，準備稻秸和日本造紙化學公司生產的纖維素“KC-FL0CK”。 稻秸用以下方法進行脫木質素處理。對稻秸進行微粉碎，然后懸浮于0. 3Ν的NaOH中，于120°C下處理15分鐘，用水充分洗凈后，進行干燥。纖維素原料的糖化，將由纖維素原料0. Sg、培養上清液9. 0ml、lM醋酸緩沖液(PH4. 8) :0. 2ml構成的溶液(纖維素原料8%溶液)于50°C、pH4. 8下震蕩48小時，進行糖化，對生成的葡萄糖用葡萄糖Cl-Test Wako (和光純藥工業)進行測定。結果如圖3和圖4所示。實施例3從啤酒的制造過程中收集啤酒粕，于0. 3N氫氧化鈉水溶液中在121°C下通過15分鐘的高壓釜處理除去木質素，充分水洗后，使其干燥。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在下培養7 天，使孢子充分形成。然后在帶擋板的500mL容量三角燒瓶中像下述那樣準備IOOmM的液體培養基將作為Mandel培養基碳源的結晶纖維素置換為上述脫木質素處理后的啤酒粕 3% (3g/100ml)，另外添加作為無機氮源的硫酸銨，而將有機氮源換成0.2%多價胨，或者與實施例ι同樣地得到的廢菌體，按照廢菌體濃度分別達到o.s^u.o^d.o^d.o^那樣添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將PH調整到4. 8。將1白金圏的培養的里氏木霉接種于該液體培養基，于^°C、ISOrpm下震蕩培養7天。在第7天，對培養液進行離心分離，用與實施例1同樣地方法測定上清液的葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結果如圖5所示。實施例4使用丸粒麥茶(7寸t 卜公司生產)與開水，熬出麥茶。除去作為水溶液的麥茶，將剩下的粕水洗后，使其干燥，得到麥茶抽提粕。將得到的麥茶抽提粕進行粉碎處理，于0. 3Ν氫氧化鈉水溶液中在121°C下通過15 分鐘的高壓釜處理除去木質素，充分水洗后，使其干燥。得到的麥茶抽提粕于0. 3N氫氧化鈉水溶液中在121°C下通過15分鐘的高壓釜處理除去木質素，充分水洗后，使其干燥。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在下培養7 天，使孢子充分形成。然后將作為Mandel培養基碳源的結晶纖維素置換為5%的上述脫木質素處理后麥茶粕(3g/100ml)，其他使用與實施例3同樣的方法操作，對得到的培養液進行酶活性測定。結果如圖6所示。實施例5對小麥麥糠(昭和產業社制)進行粉碎處理，于0. 3N氫氧化鈉水溶液中在121 °C 下通過15分鐘的高壓釜處理除去木質素，充分水洗后，使其干燥。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在下培養7 天，使孢子充分形成。然后在500mL容量帶擋板的三角燒瓶中像下述那樣準備IOOmM的液體培養基將作為Mandel培養基碳源的結晶纖維素置換為上述脫木質素處理后的小麥麥糠 5% (5g/100mL)，另外添加1 %作為無機氮源的硫酸銨，而將作為有機氮源的多價胨換成像實施例1那樣得到的廢菌體，按照濃度分別達到0. 5 %、1. 0 %、2. 0 %、3. 0 %、4. 0 %、5. 0 % 那樣添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將PH調整到4. 8。然后將1白金圏的培養的里氏木霉接種于該液體培養基，于^°C、ISOrpm下震蕩培養7天。在第7天，對培養液進行離心分離， 用與實施例1同樣的方法測定上清液的葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結果如圖7所不。實施例6使用粉碎裝置(AM0S公司生產“錘磨機”)將蘋果果實(品種“富士”)粉碎，接著使用蘋果搾汁裝置(月島-ANDRITZ生產“軋輥式榨汁過濾機”)進行搾汁。從搾汁機回收渣餅，進行水洗、干燥。得到的蘋果渣餅于0. 3N氫氧化鈉水溶液中在121°C下通過15分鐘的高壓釜處理除去木質素，充分水洗后，進行干燥，實施粉碎處理，使其大小均一后使用。將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在下培養7 天，使孢子充分形成。然后在500mL容量帶擋板的三角燒瓶中像下述那樣準備IOOmM的液體培養基將作為Mandel培養基碳源的結晶纖維素置換為4% (4g/100mL)上述進行了脫木質素處理的蘋果榨汁粕，另外添加作為無機氮源的硫酸銨，而將作為有機氮源的多價胨換成像實施例1那樣得到的廢菌體，按照濃度分別達到0. 5%、1. 0%、2. 0%、3. 0%那樣添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將PH調整到4. 8。然后將1白金圏培養的里氏木霉接種于該液體培養基，于^°C、ISOrpm下震蕩培養7天。在第7天，對培養液進行離心分離，用實施例1同樣的方法測定上清液的β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結果如圖8所示。參考例2將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在下培養7 天，使孢子充分形成。然后在500mL容量帶擋板的三角燒瓶中像下述那樣準備IOOmM的液體培養基將作為Mandel培養基碳源的結晶纖維素置換為復寫紙3% (3g/100mL)，另外添加作為無機氮源的硫酸銨，而將作為有機氮源的多價胨換成玉米浸漬液(Corn Steep Liquor :CSL)，按照濃度分別達到0. 5 %、1. 0 %、2. 0%、3. 0%那樣添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將PH調整到4.8。然后將1白金圏培養的里氏木霉接種于該液體培養基，于^°C、 ISOrpm下震蕩培養7天。在第7天，對培養液進行離心分離，用與實施例1同樣的方法測定上清液的β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結果如圖9所示。參考例3將里氏木霉QM9414(NBRC 31329)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上在下培養7 天，使孢子充分形成。然后在500mL容量帶擋板的三角燒瓶中像下述那樣準備IOOmM的液體培養基將作為Mandel培養基碳源的結晶纖維素置換為復寫紙3% (3g/100mL)，另外添加
作為無機氮源的硫酸銨，而將作為有機氮源的多價胨按照濃度分別達到0.5%、1.0%、 2.0%、3.0%的方式添加之后，用磷酸或氫氧化鈉將pH調整到4.8。然后將1白金圏培養的里氏木霉接種于該液體培養基，于^°C、ISOrpm下震蕩培養7天。在第7天，對培養液進行離心分離，用與實施例1同樣的方法測定上清液的葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性。結果如圖10所示。產業上利用的可能性能夠同時高效生產對稻秸等天然纖維素資源的糖化極其有用的葡聚糖酶和木聚糖酶，可利用于由纖維素資源制造乙醇的生物量制造乙醇。
權利要求
1.一種葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有廢菌體的液體培養基作為有機氮源，對屬于木霉屬的微生物進行培養的工序。
2.根據權利要求1所述的葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征是在于，所述廢菌體在所述液體培養基中的濃度為W/V以上。
3.根據權利要求1或2所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述廢菌體在所述液體培養基中的濃度為2 10% W/V。
4.根據權利要求1 3中任一項所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述廢菌體的原料是屬于木霉屬的微生物。
5.根據權利要求1 4中任一項所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述屬于木霉屬的微生物為里氏木霉。
6.根據權利要求1 5中任一項所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述液體培養基還含有作為碳源的天然纖維素材料以及作為氮源的氨態氮或氨基態氮。
7.根據權利要求1 6中任一項所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述天然纖維素材料在所述液體培養基中的濃度為2% W/V以上。
8.根據權利要求6或7所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，所述天然纖維素材料為選自紙漿、啤酒粕、麥茶抽提粕、小麥麥糠以及蘋果渣餅中的至少一種。
9.根據權利要求1 8中任一項所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，其特征在于，在培養的過程中對所述液體培養基追加廢菌體。
10.一種用于培養屬于木霉屬的微生物的液體培養基，其含有廢菌體作為有機氮源。
11.根據權利要求10所述的液體培養基，其特征在于，含有w/ν以上的所述廢菌體。
12.一種β -葡聚糖酶和木聚糖酶，其是使用權利要求1 9中任一項所述方法制造的。
13.—種纖維素資源的分解或糖化方法，其特征在于，使用權利要求12所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶。
全文摘要
一種以低成本制造對含有木聚糖的纖維素資源具有優良分解能力的纖維素酶。一種β-葡聚糖酶和木聚糖酶的制造方法，包括使用含有廢菌體的液體培養基作為有機氮源，對屬于木霉屬的微生物進行培養的工序。
文檔編號C12R1/885GK102482654SQ20108003713
公開日2012年5月30日 申請日期2010年8月17日 優先權日2009年8月24日
發明者福田和郎 申請人:朝日集團控股株式會社