專利名稱：寬宿主譜噬菌體的人工改造技術的研究的制作方法
技術領域：
本發明屬食品安全檢測領域，是生物技術在食品安全檢測方面的探索性應用。
背景技術：
近年來，食品安全問題日益突出，其中由食源性致病菌引起的食源性疾病已成為最嚴重的公共衛生問題之一，這不僅危害到廣大人民群眾的切身利益，還影響到經濟的可持續發展和社會的和諧穩定。食源性致病菌日趨嚴重的危害形勢提示我們目前食源性致病菌的檢測方法還不能完全滿足目前食品安全檢測工作的需要，必須進一步建立和完善有效的食品安全檢測技術及監控體系，其中重中之重的工作是建立高通量、快速、靈敏的檢測方法。本研究以成功篩選的野生型大腸桿菌噬菌體為切入點，進行人工改造噬菌體基因組從而“拓寬”噬菌體宿主譜的研究，探究人工“拓寬”噬菌體宿主譜的可行性，為建立高通量、 快速、靈敏的新型食源性致病菌的快速檢測方法提供新思路。

發明內容
本發明目的是提供一種可以同時檢測多種食源性病原菌的噬菌體。該方法簡單， 檢測時間短。所述方法包括野生烈性噬菌體的篩選、較寬裂解譜的烈性噬菌體的篩選、噬菌體基因組的人工改造。1)分離鑒定野生型大腸桿菌烈性噬菌體，人工誘導、培育噬菌體宿主譜從自然環境中分別篩選幾株大腸桿菌的野生型烈性噬菌體，進行噬菌體的培養、 增殖并與宿主菌增殖(標準大腸桿菌)培養，根據噬菌斑的大小及透明程度觀察并確定噬菌體的天然裂解譜，將篩選到的烈性大腸桿菌噬菌體進行純化、滴定、保存；2)初步改造篩選噬菌體裂解譜并進行噬菌體生物學特性的研究將篩選到的烈性大腸桿菌噬菌體與多種非宿主菌(即主要食源性致病菌沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、腸出血性大腸埃希菌0157 :H7、蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌)進行交叉培養，觀察其天然裂菌譜(方法同上)，篩選獲得可供人工改造的較寬裂解譜的烈性噬菌體(Kl)(可以篩選3株以上不同裂解譜的噬菌體，分別用于下述實驗步驟中，便于提高實驗效率，方法基本一致)；3)噬菌體Kl基因組的改造及報告基因的插入基因組的改造包括基因的插入、刪除、定點突變等方式。本研究采用敲除目的基因的方法對基因組進行改造，首先提取噬菌體Kl的全基因組DNA并用生物信息學的方法對全基因組DNA分析，找到特異性吸附基因所在位置。選擇基因組和特異性基因中都不含有的限制性內切酶酶切位點對Kl基因組進行酶切，然后將該片段克隆后再通過重疊PCR方法敲除特異性基因，然后再連接到原先的基因組位置。最后將改造后的片段與其他酶切片段按順序連接起來，構建報告噬菌體基因組，即獲得人工改造后的Kl基因組。
具體實施方式
實施例1分離鑒定野生型大腸桿菌烈性噬菌體，人工誘導、培育噬菌體宿主譜從自然環境中分別篩選5株大腸桿菌的野生型烈性噬菌體，進行噬菌體的培養、 增殖并與宿主菌增殖(標準大腸桿菌)培養，根據噬菌斑的大小及透明程度觀察并確定噬菌體的天然裂解譜，篩選到的烈性大腸桿菌噬菌體的噬菌斑的直徑在Icm以上，滴度在 5X1014CFU/ml以上，并進行純化保存。2初步改造篩選噬菌體裂解譜并進行噬菌體生物學特性的研究將篩選到的烈性大腸桿菌噬菌體與多種非宿主菌(即主要致病性致病菌沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、腸出血性大腸埃希菌0157 :H7、蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌)進行交叉培養，觀察其天然裂菌譜(方法同上)，篩選獲得可供人工改造的較寬裂解譜的烈性噬菌體(Kl)(可以篩選3株以上不同裂解譜的噬菌體，分別用于下述實驗步驟中，便于提高實驗效率，方法基本一致)。所獲得的較寬噬菌體的噬菌斑的直徑在Icm以上，滴度在1 X 1012CFU/ml以上，并且至少對3種以上的致病菌有裂解作用。3噬菌體Kl基因組的改造及報告基因的插入基因組的改造包括基因的插入、刪除、定點突變等方式。本研究采用敲除目的基因的方法對基因組進行改造，首先提取噬菌體Kl的全基因組DNA并用生物信息學的方法對全基因組DNA分析，找到特異性吸附基因所在位置(目前研究結果表明，編碼λ噬菌體尾絲的J基因編碼的J蛋白是決定噬菌體的特異性吸附，Τ4系列噬菌體識別宿主特異性的基因是g37p)。選擇基因組和特異性基因中都不含有的限制性內切酶酶切位點對Kl基因組進行酶切(如果該酶切位點不宜選取，可先選取特異基因外側的大片段酶切，然后將該片段克隆后再通過重疊PCR方法敲除特異性基因，然后再連接到原先的基因組位置)。最后將改造后的片段與其他酶切片段按順序連接起來，構建報告噬菌體基因組，即獲得人工改造后的 Kl基因組。(報告基因Luc的插入與特異基因的敲除的順序不分前后，依實驗情況需要決定)4將改造后的基因組回轉到原先的噬菌體中，并檢測改造后的噬菌體的噬菌譜將改造后的基因組轉化入大腸桿菌toplO中，然后將噬菌體Kl侵染轉化后的大腸桿菌toplO，逐步篩選獲得改造后的噬菌體K2，運用實例2中的步驟和方法，篩選并檢測改造后的一株寬裂解譜噬菌體，實驗結果表明該噬菌體可以同時檢測5種食源性致病菌，檢測時間為3小時，滴度為lX1012CFU/ml，檢測靈敏度為95. 3%。
權利要求
1.本發明涉及一種人工改造噬菌體拓寬其宿主譜的方法，其特征在于所述方法包括下述步驟a)野生烈性噬菌體的篩選從自然環境中分別篩選幾株大腸桿菌的野生型烈性噬菌體，進行噬菌體的培養、增殖并與宿主菌增殖(標準大腸桿菌)培養，根據噬菌斑的大小及透明程度觀察并確定噬菌體的天然裂解譜，將篩選到的烈性大腸桿菌噬菌體進行純化、滴定、保存；b)較寬裂解譜的烈性噬菌體的篩選Kl將篩選到的烈性大腸桿菌噬菌體與多種非宿主菌進行交叉培養，觀察其天然裂菌譜(方法同上)，篩選獲得可供人工改造的較寬裂解譜的烈性噬菌體(Kl)(可以篩選3株以上不同裂解譜的噬菌體，分別用于下述實驗步驟中，便于提高實驗效率，方法基本一致)；c)噬菌體基因組的人工改造本技術采用敲除目的基因的方法對基因組進行改造，首先提取噬菌體Kl的全基因組DNA并用生物信息學的方法對全基因組DNA分析，找到特異性吸附基因所在位置g37p。
2.根據權利要求Ia所述的野生烈性噬菌體的篩選，其特征在于所篩選到的噬菌體的噬菌斑的直徑在Icm以上，滴度在5X1014CFU/ml以上，保存品應無雜菌。
3.根據權利要求Ib所述的較寬裂解譜的烈性噬菌體的篩選，其特征在于篩選到3株以上，能對盡可能多的主要食源性致病菌(即沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、腸出血性大腸埃希菌0157 :H7、蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌)起裂解作用的噬菌體。
4.根據權利要求Ic所述的噬菌體基因組的人工改造，其特征在于敲除每種噬菌體基因組中的特異性吸附基因g37p，將敲除后的基因組通過大腸桿菌做中間的載體回轉到原噬菌體中。
全文摘要
本發明公開了一種人工改造噬菌體拓寬其宿主譜的方法，屬于食品安全檢測領域，是生物技術在食品安全檢測方面的探索性應用。方法包括野生烈性噬菌體的篩選、較寬裂解譜的烈性噬菌體的篩選K1、噬菌體基因組的人工改造、將敲除后的基因組通過大腸桿菌做中間的載體回轉到原噬菌體中，將改造后的基因組通過大腸桿菌top10回轉到原先的噬菌體中，并檢測改造后的噬菌體的噬菌譜。本發明篩選并得到改造后的一株寬裂解譜噬菌體，實驗結果表明該噬菌體可以同時檢測5種食源性致病菌，檢測時間為3小時，滴度為1×1012CFU/ml，檢測靈敏度為95.3％。
文檔編號C12N15/09GK102181403SQ20111000411
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月11日 優先權日2011年1月11日
發明者吳涵, 龐勇, 張鳴鏑, 方珍, 李洪山, 潘風光, 秦亞楠, 趙婭婭, 邢賀欽, 郭娜 申請人:吉林大學