專利名稱：高效表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的cho細(xì)胞株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是可以穩(wěn)定高效分泌表達(dá)具有生物活性的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rhNGF)的CHO細(xì)胞株、其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，各種顱腦外傷，急性腦血管意外、脊髓損傷，新生兒缺血性、缺氧性腦病，小兒腦癱和阿爾茨海默病的存活率不斷提高，但神經(jīng)功能的缺損和患者不良預(yù)后使醫(yī)學(xué)界面臨難題。目前中樞神經(jīng)損傷及周圍神經(jīng)損傷成為威脅人類健康的主要疾病。因此，加大腦神經(jīng)保護(hù)類藥物的開(kāi)發(fā)、修復(fù)受損的中樞神經(jīng)及周圍神經(jīng)已成為推動(dòng)這一類藥物市場(chǎng)快速發(fā)展的強(qiáng)大推動(dòng)力。其中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve Growth Factor，NGF)成為近年來(lái)石if究的熱點(diǎn)(Hefti F, Weiner WJ. Ann. Neurol, Nerve growth factor and Alzheimer' s disease. 1986,20 (3) :275-281. Scott SA, Crutcher KA. Nerve growth factor and Alzheimer' s disease. Rev Neurosci. 1994 ；5 (3) :179-211.)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子是最早被發(fā)現(xiàn)，目前研究最為透徹的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子之一，也是至今為止發(fā)現(xiàn)的唯一不僅對(duì)中樞及外周神經(jīng)的正常神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)因子作用，而且具有調(diào)節(jié)神經(jīng)損傷修復(fù)機(jī)能的生物活性分子。從小鼠頌下腺分離的神經(jīng)生長(zhǎng)因子是分子質(zhì)量為 140KD、沉降系數(shù)為7S的復(fù)合物，由α、β、Y 3種肽鏈按α 2 β 2 γ 2的比例構(gòu)成。其中，β 亞單位是7S NGF的活性區(qū)，整個(gè)NGF的生物活性全依賴β亞單位，也稱為2. 5S NGF。研究表明，β亞單位是由兩個(gè)完全相同的肽鏈組成，每個(gè)肽鏈含118個(gè)氨基酸殘基，是由通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合而構(gòu)成二聚體(Shooter EM. Early days of the nerve growth factor proteins. Annu Rev Neurosci. 2001 ;24 :601-6 .)。形成 β 亞單位的兩條肽鏈，其的保守結(jié)構(gòu)主要包括兩對(duì)反向平行的β鏈，β鏈構(gòu)成了 NGF長(zhǎng)而扁平的形狀，其中包括6個(gè)半胱氨酸殘基，組成3對(duì)二硫鍵，這些二硫鍵對(duì)維持NGF的生物活性十分重要，一旦破壞則活性全部喪失(ffhittemore SR, Seiger A. The expression, localization and functional significance of beta-nerve growth factor in the central nervous system. Brain Res. 1987 ；434 (4) :439-464.)。近年來(lái)，2.5S NGF的基因結(jié)構(gòu)也已闡明，位于第一對(duì)染色體的近端短壁上，人、雞、 牛、豚鼠的NGF cDNA相繼被克隆。以小鼠NGF的cDNA為探針，已從人的DNA文庫(kù)中克隆出人類NGF基因。從核苷酸堿基排列可推導(dǎo)氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)人類和小鼠的NGF氨基酸序列的同源性有90%，而且小鼠NGF與人體NGF的結(jié)構(gòu)也具有高度的相似性，生物效應(yīng)也無(wú)明顯的種間特異性。國(guó)內(nèi)自上個(gè)世紀(jì)80年代起即開(kāi)始了鼠NGF純化和應(yīng)用的研究(柳川，李晉萍，華仲慰，等.小鼠頌下腺2. 5S神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化和活性鑒定.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊， 1987，11 28 33 ；沈心亮；潘曉東；白明綱，等，神經(jīng)生長(zhǎng)因子在治療有機(jī)溶劑中毒性周圍神經(jīng)病中的新用途.中國(guó)專利CN99127304.4)，目前我國(guó)研制的注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子在獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)頒發(fā)的一類生物制品新藥證書。2003年武漢海特生物制藥股份有限公司、廈門北大之路生物工程有限公司分別獲得了 SFDA頒發(fā)的生產(chǎn)批文，分別以“金路捷”和“恩經(jīng)復(fù)”上市。2006年SFDA又批準(zhǔn)了舒泰神(北京)藥業(yè)注射用神經(jīng)生長(zhǎng)因子生產(chǎn)，商品名為“蘇肽生”，至此中國(guó)市場(chǎng)形成了三足鼎立的局面。然而，小鼠及其它來(lái)源的非人源NGF畢竟在一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象上不同于人的NGF分子，盡管其純度可以達(dá)到98%以上，仍不能排除長(zhǎng)期大量使用產(chǎn)生抗鼠NGF抗體和引起過(guò)敏反應(yīng)的可能性。 人體產(chǎn)生抗鼠NGF抗體將導(dǎo)致其在體內(nèi)半衰期縮短，影響到臨床治療效果和患者的用藥安全。因此國(guó)內(nèi)外許多研究機(jī)構(gòu)都采用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組人NGF，活性測(cè)定結(jié)果表明，與鼠源性NGF相比，重組人NGF具有良好的生物活性(姜靜，于淑萍，姜桂香， 等.兩步柱色譜法純化CHO表達(dá)的重組人β神經(jīng)生長(zhǎng)因子(β-rhNGF).中國(guó)生物工程雜志.2008; (10) :84 89.；陳勇蔣琳楊軍，等.人β-NGF真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的生物活性.中國(guó)生物制品學(xué)雜志.2005 ；18(6) =457-460.)。但是，由于我國(guó)上游基因重組以及細(xì)胞株構(gòu)建和篩選技術(shù)落后于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家水平，國(guó)內(nèi)構(gòu)建的CHO工程細(xì)胞株不僅還在沿用添加牛血清的有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，而且貼壁CHO細(xì)胞也難以實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，必須經(jīng)過(guò)懸浮培養(yǎng)馴化才可以放大進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。另一方面，重組蛋白的表達(dá)水平較美國(guó)低幾倍甚至幾十倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到國(guó)外的20-30g/年的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的產(chǎn)量，更不用說(shuō)實(shí)現(xiàn)低成本的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化了。例如，我國(guó)批準(zhǔn)上市的國(guó)產(chǎn)CHO細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品僅有兩種 EPO和乙肝疫苗。但盡管這兩種產(chǎn)品的使用劑量只有微克級(jí)水平，其生產(chǎn)還處于非常原始和初級(jí)的狀態(tài)，許多廠家甚至還是用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)(胡顯文，陳惠鵬，湯仲明，等.生物制藥的現(xiàn)狀和未來(lái)(一)歷史與現(xiàn)實(shí)市場(chǎng).中國(guó)生物工程雜志.2004; (12) :95-101.；胡顯文，陳惠鵬，湯仲明，等.生物制藥的現(xiàn)狀和未來(lái)(二)發(fā)展趨勢(shì)與希望.中國(guó)生物工程雜志· 2005 ；25(1) :86-93.)。由于常規(guī)CHO細(xì)胞需要在有牛血清或類似成分存在的情況下貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清或蛋白質(zhì)成分對(duì)重組蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)以及后期的蛋白純化過(guò)程有很大的影響。如果進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化，還需要首先進(jìn)行無(wú)血清馴化，使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基并在其中生長(zhǎng)良好并持續(xù)分泌產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)以降低成本并方便下游純化工藝的開(kāi)發(fā)。細(xì)胞無(wú)血清馴化過(guò)程中往往造成基因工程細(xì)胞株不穩(wěn)定，導(dǎo)致蛋白生產(chǎn)能力下降。當(dāng)前哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清、大規(guī)模、高密度、懸浮培養(yǎng)已經(jīng)成為生物制藥領(lǐng)域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一，并以其研究的深入和快速進(jìn)展成為推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的強(qiáng)大動(dòng)力。但是，已有的重組人NGF研究文獻(xiàn)并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，前人的文獻(xiàn)中并沒(méi)有提示我們通過(guò)何種方法才能得到一種既不用進(jìn)行無(wú)血清馴化培養(yǎng)，又能很方便的進(jìn)行亞克隆篩選獲得高效表達(dá)重組人NGF細(xì)胞株的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的CHO DG44-NGF-118細(xì)胞株，該細(xì)胞株已在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)保藏，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 4541 本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)建立篩選獲得具有穩(wěn)定高效表達(dá)具有生物活性的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rhNGF)的CHO DG44-NGF-118細(xì)胞株的方法，解決上述背景技術(shù)存在的不足，從而建立一種表達(dá)和生產(chǎn)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和生物活性的重組蛋白質(zhì)的技術(shù)平臺(tái)。所述的技術(shù)平臺(tái)通過(guò)利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)技術(shù)和甲基纖維素半固體培養(yǎng)基亞克隆技術(shù)，可以省略已有技術(shù)的無(wú)血清馴化過(guò)程，不僅提高亞克隆成功率，而且還大大方便了重組蛋白質(zhì)的下游純化。其宿主細(xì)胞為經(jīng)過(guò)無(wú)血清懸浮馴化的CHO DG44。所述CHO細(xì)胞株具有編碼SEQ ID No2所示蛋白質(zhì)的核苷酸序列。所述核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。上述的CHO細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)人工合成如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，插入到pOptiVEC-polylinker的多克隆位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒，(2)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入無(wú)血清懸浮馴化的CHO DG44的中，(3)逐步提高氨甲蝶呤濃度的方式加壓篩選，得到混合克隆細(xì)胞，(4)采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基進(jìn)行亞克隆挑選單克隆細(xì)胞株，采用ELISA法檢測(cè)單克隆細(xì)胞株的表達(dá)量，篩選得到高效表達(dá)的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的CHO細(xì)胞株。其中核苷酸序列插入到pOptiVEC-polylinker的)(ba I和Not I酶切位點(diǎn)之間。所述重組質(zhì)粒為p0ptiVEC/NGF-l 18，其制備方法包括如下步驟㈧人工合成如SEQID NO. 1所示的核苷酸序列，并連接到pcDNA3. 1載體上構(gòu)建成功pcDNA3. 1/ NGF-118重組質(zhì)粒，(B)分別用Xba I和Not I雙酶切pcDNA3. 1/NGF-118重組質(zhì)粒和 pOptiVEC-polylinker，然后回收酶切后的NGF基因片段和線性化的pOptiVEC載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用雙酶切法和序列測(cè)定法鑒定陽(yáng)性重組子，獲得p0ptiVEC/NGF-118重組質(zhì)粒。所述氨甲蝶呤濃度為400nM。所述步驟(3)加壓篩選為在含氨甲喋呤濃度為IOnM選擇培養(yǎng)基開(kāi)始加壓篩選，然后按照濃度分別為20nM，40nM, 60nM, 80nM, IOOnM, 200nM和400nM的梯度逐步提高選擇培養(yǎng)基中氨甲喋呤的濃度。所述CHO細(xì)胞株在生產(chǎn)人神經(jīng)生長(zhǎng)因子蛋白質(zhì)藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本申請(qǐng)?zhí)峁┝巳缦碌膶?shí)施方案1.通過(guò)UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor, NGF) NGF基因序列，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，如SEQ ID NO. 1所示，將其插入到pOptiVEC-polylinker 的多克隆位點(diǎn)，形成p0ptiVEC/NGF-118重組質(zhì)粒。2.將pOptiVEC/NGF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入CHO DG44細(xì)胞中，逐漸提高M(jìn)TX濃度進(jìn)行加壓篩選，逐步提高重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)水平。3.對(duì)加壓篩選獲得的表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的混合克隆細(xì)胞，利用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基進(jìn)行亞克隆將獲得高表達(dá)量的單克隆細(xì)胞。4.定量ELISA法測(cè)定單克隆化的穩(wěn)定細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線及rhNGF表達(dá)量變化趨勢(shì)。5.用雞胚背根神經(jīng)節(jié)法(Dorsal root ganglion,DRG)定性檢測(cè)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物活性。6.用大鼠PC12細(xì)胞體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)定性檢測(cè)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物活性。本發(fā)明所建立的高效表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的CHO細(xì)胞株，其中的5號(hào)單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)上清中rhNGF的表達(dá)量最高，達(dá)到25. 5mg/L，命名為CHO DG44-NGF-118。本發(fā)明的CHO DG44-NGF-118細(xì)胞株，其宿主細(xì)胞是適應(yīng)了無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的已馴化CHO-DHFR 缺陷株宿主細(xì)胞CHO DG44，其與已有文獻(xiàn)報(bào)道方法相比的優(yōu)勢(shì)在于現(xiàn)有文獻(xiàn)中所使用的CHO-DHFR缺陷細(xì)胞株需要在有牛血清或類似成分存在的情況下貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清或蛋白質(zhì)成分對(duì)重組蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)以及后期的蛋白純化過(guò)程有很大的影響。如果進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化，還需要首先進(jìn)行無(wú)血清馴化，使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基并在其中生長(zhǎng)良好并持續(xù)分泌產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)以降低成本并方便下游純化工藝的開(kāi)發(fā)。細(xì)胞無(wú)血清馴化過(guò)程中往往造成基因工程細(xì)胞株不穩(wěn)定，導(dǎo)致蛋白生產(chǎn)能力下降，而本發(fā)明使用已馴化好的適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基的CHO-DHFR宿主細(xì)胞CHO DG44可以省略此步驟，有利于提高基因工程CHO細(xì)胞株的穩(wěn)定性。此外，有血清培養(yǎng)中使用的動(dòng)物血清或其它動(dòng)物源性和/或人源性蛋白成分，不僅增加了生產(chǎn)成本，而且還增加了外源致病性微生物污染的機(jī)會(huì)，特別是克-雅氏病(即通常所說(shuō)的瘋牛病)病毒的污染。本發(fā)明中使用的無(wú)血清/無(wú)蛋白合成培養(yǎng)基不含任何動(dòng)物源性和蛋白性成分，馴化后的CHO-DHFR宿主細(xì)胞CHO DG44已經(jīng)在其中得到良好適應(yīng)，且細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)水平與有血清培養(yǎng)基相當(dāng)，其技術(shù)特點(diǎn)在于能支持細(xì)胞在大規(guī)模生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，并有利于泡沫控制。菌株分類CH0細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 4541保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏日期2011年1月5日保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所


圖1 :A09025-1質(zhì)粒酶切鑒定圖譜圖2 :p0ptiVEC/NGF-118質(zhì)粒酶切鑒定圖譜M :DM1000DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. Xba I 和 Not I 雙酶切 pOptiVEC/NGF-118 質(zhì)粒； 2. pOptiVEC/NGF-118 質(zhì)粒圖3 =ELISA檢測(cè)所挑取的M個(gè)單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清圖4 定量ELISA檢測(cè)6孔板中擴(kuò)增的3個(gè)單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清圖5 =Western blotting法檢測(cè)6孔板中擴(kuò)增的3個(gè)單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清M 低分子量蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2，3，4泳道分別為小鼠NGF對(duì)照品，5號(hào)，8號(hào)和20號(hào)單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)上清。圖6 =CHO DG44-NGF-118細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線及重組NGF滴度變化趨勢(shì)圖7 雞胚背根神經(jīng)節(jié)法(DRG)定性檢測(cè)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物活性A，B 雞胚背根神經(jīng)節(jié)(DRG)誘導(dǎo)0小時(shí)；雞胚背根神經(jīng)節(jié)(DRG)誘導(dǎo)48小時(shí)后。 其中，A，C為小鼠NGF(25ng/ml)誘導(dǎo)組；B, D為重組人NGF(25ng/ml)誘導(dǎo)組。圖8 大鼠PC12細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物活性。A，B, C :PC-12細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)0小時(shí)；D, E，F(xiàn) :PC_12細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)；G, H，I PC-12細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)144小時(shí)。其中，A，D，G為陰性對(duì)照組，B, E，H為小鼠NGF(1 μ g/ml) 誘導(dǎo)組；C, F，I為重組人NGF(1 μ g/ml)誘導(dǎo)組。
具體實(shí)施方法本發(fā)明更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法可參見(jiàn)實(shí)施例。本實(shí)施例是用于解釋，而不是以任何形式和方法限制本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的細(xì)胞株、菌株、質(zhì)粒和試劑均為市售產(chǎn)品。實(shí)施例一 p0ptiVEC/NGF-118重組質(zhì)粒的構(gòu)建1.NGF基因的獲得查詢UniProtKB數(shù)據(jù)庫(kù)中人NGF蛋白質(zhì)(P01138)和基因的序列，對(duì)NGF基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，優(yōu)化后的NGF基因核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，委托金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因合成并連接到pcDNA3. 1載體(Invitrogen公司)上，構(gòu)建成功pcDNA3. 1/ NGF-118重組質(zhì)粒，編號(hào)為A09025-1，酶切鑒定圖譜如圖1所示。2. pOptiVEC/NGF-118 重組質(zhì)粒的獲得按照常規(guī)分子克隆技術(shù)操作，將pcDNA3. 1/NGF-118重組質(zhì)粒和 pOptiVEC-polylinker 載體(Invitrogen 公司)分別用 Xba I 和 Not I (大連 Takara 公司)雙酶切，然后使用膠回收試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)回收酶切后的 NGF-118基因片段和線性化的pOptiVEC載體進(jìn)行連接，鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TranslO (北京全式金生物技術(shù)有限公司)，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后利用質(zhì)粒小提試劑盒 (北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)提取質(zhì)粒，通過(guò))(ba I和Not I雙酶切以及插入序列測(cè)定鑒定陽(yáng)性重組子，獲得pOptiVEC/NGF-118重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例二 獲得表達(dá)重組人NGF的CHO DG44細(xì)胞株CHO DG44細(xì)胞是dhfr缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系，購(gòu)自公司。CHO DG44細(xì)胞轉(zhuǎn)染前按說(shuō)明書常規(guī)傳代，以3X IO5細(xì)胞/ml密度接種于含有30ml⑶DG44 培養(yǎng)液的125ml無(wú)菌三角瓶中，使次日細(xì)胞密度能達(dá)到5X IO5活細(xì)胞/ml，轉(zhuǎn)染步驟按 hvitrogen公司的FreeMyle MAX轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行。將15 μ 1 FreeStyle MAX轉(zhuǎn)染試劑和9μ gp0ptiVEC/NGF-118重組質(zhì)粒DNA加入到1. 2ml OptiCHO SFM無(wú)血清培養(yǎng)基中， 輕柔混勻，室溫孵育lOmin。將1. 2ml質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混合液緩慢且均勻的滴入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置0)2培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染Mh后，更換為含有氨甲喋呤濃度為IOnM的CD OptiCHO 培養(yǎng)基進(jìn)行加壓篩選，待細(xì)胞活力和密度恢復(fù)后，分別按照20nM，40ηΜ, 60ηΜ, 80ηΜ, IOOnM, 200ηΜ和400ηΜ的濃度梯度逐步提高選擇培養(yǎng)基中氨甲喋呤的濃度進(jìn)行加壓擴(kuò)增，擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)MTX濃度提高到400ηΜ時(shí)，按3Χ 105/ml的密度接種到125ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)3天后取混合細(xì)胞株的培養(yǎng)上清進(jìn)行定量ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)滴度為3160. 5ng/ml。為了獲得高表達(dá)的單克隆細(xì)胞，按照實(shí)施例三所述的方法對(duì)混合克隆細(xì)胞進(jìn)行了克隆化，以期獲得高表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。實(shí)施例三甲基纖維素半固體培養(yǎng)基亞克隆挑選單克隆細(xì)胞株采用CloneMatrix半固體培養(yǎng)基(購(gòu)自Genetix公司)進(jìn)行克隆化，按照產(chǎn)品使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。簡(jiǎn)而言之，將混合克隆細(xì)胞按IX 107ml的密度接種到100ml含400nM 的MTX的CloneMatrix培養(yǎng)基中，在37°C、5% CO2的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)14天后，挑取獨(dú)立分散、生長(zhǎng)良好的單克隆細(xì)胞，轉(zhuǎn)入96孔板培養(yǎng)，3天后取培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。 根據(jù)ELISA檢測(cè)結(jié)果，選取OD值比較高的單克隆孔細(xì)胞，轉(zhuǎn)入M孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，5天后進(jìn)行 ELISA檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)ELISA結(jié)果，選取OD值比較高的6個(gè)單克隆孔5,8,16，20，22和M轉(zhuǎn)入6孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞密度合適時(shí)凍存細(xì)胞。分別收取各單克隆孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用ELISA試劑盒(R&D公司，DY256)檢測(cè)其rhNGF含量，按試劑盒說(shuō)明書操作。由于在擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程中單克隆孔16，22和M未得到有效擴(kuò)增，只有3個(gè)單克隆細(xì)胞5， 8和20得到擴(kuò)增并進(jìn)行了定量ELISA檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。5號(hào)單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)上清中rhNGF的表達(dá)量最高，達(dá)到1618ng/ml，命名為CHO DG44-NGF-118。取3個(gè)單克隆細(xì)胞株的培養(yǎng)上清進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為10%，轉(zhuǎn)膜后利用兔抗鼠NGF多克隆抗體(SIGMA公司，N6655)進(jìn)行^festern blotting檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，在分子量13KD 左右有一條特異性條帶，與預(yù)期分子量一致。
實(shí)施例四穩(wěn)定細(xì)胞株的生長(zhǎng)曲線及rhNGF滴度變化趨勢(shì)
為檢測(cè)CHO DG44-NGF-118細(xì)胞株的細(xì)胞密度和rhNGF滴度之間的關(guān)系，將 CH0DG44-NGF-118細(xì)胞株按1. 7X 105/ml的密度接種到不含MTX的OptiCHO Medium培養(yǎng)基中，在37°C、5% CO2和130rpm的條件下于500ml錐形瓶中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，每24h取樣檢測(cè)細(xì)胞密度及rhNGF的表達(dá)量。連續(xù)監(jiān)測(cè)9天后，根據(jù)測(cè)定結(jié)果以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為左縱坐標(biāo)，NGF表達(dá)滴度為右縱坐標(biāo)繪制CHO DG44-NGF-118細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞密度及rhNGF滴度變化趨勢(shì)圖，如圖6所示。結(jié)果表明，細(xì)胞接種后如隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞密度逐漸增加，在第6天達(dá)到最大值64 X 106/ml，而rhNGF的滴度則繼續(xù)增加，至第9 天時(shí)rhNGF滴度達(dá)到最高值25. 5mg/L。這提示無(wú)血清懸浮培養(yǎng)有利于高密度培養(yǎng)，在細(xì)胞密度達(dá)到最高后因營(yíng)養(yǎng)成分的消耗和代謝廢物的累積導(dǎo)致細(xì)胞開(kāi)始死亡，細(xì)胞密度下降但 rhNGF表達(dá)卻還在繼續(xù)增加。如果在生物反應(yīng)器中采用流加培養(yǎng)并對(duì)溶氧、PH值、糖度和代謝產(chǎn)物進(jìn)行調(diào)控，還可以獲得更大細(xì)胞培養(yǎng)密度和更高的rhNGF表達(dá)水平。實(shí)施例五背根神經(jīng)節(jié)法(DRG)定性檢測(cè)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物活性為檢測(cè)CHO DG44-NGF-118細(xì)胞株所表達(dá)的rhNGF生物活性，取含有rhNGF的培養(yǎng)上清經(jīng)超濾濃縮后以定量ELISA法進(jìn)行濃度標(biāo)定，然后以市售注射用小鼠NGF (舒泰神藥業(yè)有限公司)為標(biāo)準(zhǔn)參考品品，按照經(jīng)典的雞胚DRG誘導(dǎo)方法進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，具體操作方法如下1.分離雞胚背根神經(jīng)節(jié)將毛玻璃放置超凈臺(tái)水平面上，取雞胚，輕輕去除氣腔面的部分雞蛋殼，觀察到遍布新鮮毛細(xì)血管的內(nèi)膜，破開(kāi)后取出雞胚，斷頸后將雞四肢粘附在毛玻璃上，用小鑷子解剖，去除內(nèi)臟，小心暴露脊柱，將之放置體視顯微鏡底下，觀察的同時(shí)，用微解剖鑷子取出背根神經(jīng)節(jié)，放至用多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)包被過(guò)的M 孔板中，每孔2 3個(gè)神經(jīng)節(jié)，添加Iml的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，放置37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Ih。2. NGF誘導(dǎo)雞胚背根神經(jīng)節(jié)將培養(yǎng)神經(jīng)節(jié)的DMEM培養(yǎng)基更換為DMEM含藥培養(yǎng)基(不同濃度的NGF)，分為待測(cè)NGF樣品和標(biāo)準(zhǔn)品兩組，其中待測(cè)NGF樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用DMEM 培養(yǎng)基做2倍倍比稀釋，每個(gè)樣品做5 6個(gè)稀釋度(應(yīng)稀釋至出現(xiàn)陰性結(jié)果)，培養(yǎng)4 后在倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)節(jié)的狀態(tài)。如圖7所示，與小鼠NGF—樣，我們所表達(dá)的rhNGF 具有良好的生物活性，可以誘導(dǎo)雞胚背根神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)，倒置顯微鏡下可觀察到致密而細(xì)長(zhǎng)的大量神經(jīng)纖維自背根神經(jīng)節(jié)中呈放射狀向四周生長(zhǎng)。實(shí)施例六大鼠PC12細(xì)胞誘導(dǎo)法定性檢測(cè)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物活性NGF可以誘導(dǎo)大鼠嗜鉻神經(jīng)細(xì)胞瘤PC12分化并產(chǎn)生大量放射狀神經(jīng)纖維軸突向四周輻射生長(zhǎng)并相互聯(lián)接。因此，我們以市售注射用小鼠NGF(舒泰神藥業(yè)有限公司)為標(biāo)準(zhǔn)品，采用PC12細(xì)胞誘導(dǎo)法來(lái)檢測(cè)rhNGF的生物活性，具體操作方法如下1.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取小鼠NGF標(biāo)準(zhǔn)品(30 μ g/瓶，生物學(xué)活性彡15000AU)按說(shuō)明書復(fù)溶后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋至15μ g/ml。在5ml離心管中配置標(biāo)準(zhǔn)品溶液，預(yù)稀釋濃度為2 μ g/ml，然后進(jìn)行2倍系列稀釋，共5個(gè)稀釋度，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液轉(zhuǎn)移至M孔板(預(yù)先用多聚賴氨酸包被)，每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)1個(gè)孔，每孔500 μ 1。2.待檢測(cè)樣品溶液的制備將待檢測(cè)樣品用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋至2 μ g/ml，然后進(jìn)行2倍系列稀釋，共5個(gè)稀釋度，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液轉(zhuǎn)移至M孔板(預(yù)先用PLL包被)，每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)1個(gè)孔，每孔500 μ 1，以上操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行。以上操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行。另選擇2個(gè)孔加入陰性對(duì)照溶液500 μ 1 (不含藥物的培養(yǎng)基)，以上操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行。3.活性測(cè)定法PC12細(xì)胞用完全培養(yǎng)基于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)，控制細(xì)胞濃度為每Iml含1.0X IO5 5X IO5個(gè)細(xì)胞。傳代后M 36小時(shí)后，用于生物學(xué)活性測(cè)定。將實(shí)驗(yàn)所用溶液預(yù)溫到37°C。取足量PC12細(xì)胞培養(yǎng)物，離心收集PC12細(xì)胞，重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)基配成每Iml含2 X IO4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，接種于M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中含有NGF標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的孔，每孔500μ 1。置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)，每隔3天更換新鮮的培養(yǎng)基液，維持相同的藥物濃度。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)并照相。如圖8所示，未誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞數(shù)量有所增加，但是未見(jiàn)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，而與小鼠NGF —樣，本發(fā)明所述的rhNGF具有良好的生物活性，可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化及神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)，倒置顯微鏡下可觀察到細(xì)長(zhǎng)呈分支裝的神經(jīng)纖維自PC12細(xì)胞呈放射狀向四周生長(zhǎng)并相互聯(lián)接。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，然而并非任何方式限定本發(fā)明。任何本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員，在本發(fā)明的技術(shù)方案范圍內(nèi)，凡利用上述公開(kāi)的技術(shù)內(nèi)容做出少許改動(dòng)或修飾，應(yīng)視為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.高效表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的CHODG44-NGF-118細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCC No.佔(zhàn)41。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHODG44-NGF-118細(xì)胞株，其宿主細(xì)胞為經(jīng)過(guò)無(wú)血清懸浮馴化的 CHO DG44。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CHO細(xì)胞株，所述CHO細(xì)胞株具有編碼SEQID No. 2所示蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的CHO細(xì)胞株，所述核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
5.權(quán)利要求1-4任一所述的CHO細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)人工合成如SEQID No. 1所示的核苷酸序列，插入到pOptiVEC-polylinker的多克隆位點(diǎn)，得到重組質(zhì)粒，(2)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入無(wú)血清懸浮馴化的CHODG44的中，(3)逐步提高氨甲蝶呤濃度的方式加壓篩選，得到混合克隆細(xì)胞，(4)采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基進(jìn)行亞克隆挑選單克隆細(xì)胞株，采用ELISA法檢測(cè)單克隆細(xì)胞株的表達(dá)量，篩選得到高效表達(dá)的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的CHO細(xì)胞株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其中核苷酸序列插入到pOptiVEC-polylinker的 Xba I和Not I酶切位點(diǎn)之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，所述重組質(zhì)粒為p0ptiVEC/NGF-118，其制備方法包括如下步驟(A)人工合成如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，并連接到pcDNA3. 1載體上構(gòu)建成功pcDNA3. 1/NGF-118重組質(zhì)粒，(B)分別用Xba I和Not I雙酶切pcDNA3. 1/ NGF-118重組質(zhì)粒和pOptiVEC-polylinker，然后回收酶切后的NGF基因片段和線性化的 pOptiVEC載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用雙酶切法和序列測(cè)定法鑒定陽(yáng)性重組子，獲得p0ptiVEC/NGF-118重組質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，所述氨甲蝶呤的最終濃度為400nM。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，所述步驟(3)加壓篩選為在含氨甲喋呤濃度為 IOnM選擇培養(yǎng)基開(kāi)始加壓篩選，然后按照濃度分別為20nM，40nM, 60nM, 80nM, IOOnM, 200nM 和400nM的梯度逐步提高選擇培養(yǎng)基中氨甲喋呤的濃度。
10.權(quán)利要求1-4任一所述CHO細(xì)胞株在生產(chǎn)人神經(jīng)生長(zhǎng)因子蛋白質(zhì)藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及“高效表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的CHO細(xì)胞株及其構(gòu)建方法”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該細(xì)胞株的保藏編號(hào)為CGMCC No.4541，能穩(wěn)定表達(dá)具有生物活性的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rhNGF)。本發(fā)明還公開(kāi)了構(gòu)建該CHO細(xì)胞株的方法，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染、基因擴(kuò)增和對(duì)擴(kuò)增后細(xì)胞系進(jìn)行亞克隆篩選，獲得了適合無(wú)血清懸浮培養(yǎng)的高效表達(dá)單克隆細(xì)胞株。本發(fā)明同時(shí)也公開(kāi)了該CHO細(xì)胞株分泌表達(dá)的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子序列，分泌的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有良好的生物活性，在體外可以維持PC12增殖，誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化以及刺激雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，為大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化制備重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子奠定了良好基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102586190SQ201110004328
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者樂(lè)偉, 劉荷中, 史權(quán)威, 彭璐佳, 葛艷華 申請(qǐng)人:北京華安科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司