專利名稱：鹿茸神經生長因子(deer ngf)提取及其制備方法
技術領域：
本發明屬于鹿茸提取物的醫用或食用制品領域。更具體地來說，本發明涉及由鹿茸提取神經生長因子(DEER NGF)的方法以及由該方法制備的富含神經生長因子的鹿茸提取物。另外，本發明還涉及該鹿茸提取物在藥品、食品和保健品等方面的應用。
背景技術：
鹿茸(鹿尚未骨化的幼角)和鹿角作為傳統的中藥材，具有強筋健骨、補腎壯陽、疏通血脈等功效，自古以來就被廣泛應用于配制成為各種滋補藥品、食品、保健品和化妝品。通過現代藥物化學研究分析，鹿茸中含有許多種生理活性成分，包括磷脂、生物胺類化合物、前列腺素、維生素、氨基酸、無機鹽、不飽和脂肪酸、皮質醇等。隨著現代生物技術高速發展，人們發現鹿茸中除了含有上述各種生理活性成分之外，其中還含有胰島素樣生長因子(IGF-1)、胰島素、人生長激素(HGH)、促生長釋放因子(GHRF-6)、神經生長因子(NGF)、表皮生長因子(EGF)、成纖維生長因子(FGF)等大分子活性蛋白質。以上各種活性成分，尤其是各種活性蛋白質，相互協同作用，發揮功效。其中，神經生長因子具有突出的藥理作用。
神經生長因子對神經組織具有多種營養性生物效應，能夠促進神經元生長、分化，修復神經損傷，因此可治療多種神經疾病，如老年性癡呆癥、帕金森氏癥、神經末梢炎癥等(參見中國專利CN1144693A、CN1304772A)。此外，神經生長因子還具有免疫調節、抑制某些腫瘤的有絲分裂、促進創口組織的修復反應等作用。
然而，在傳統的鹿茸加工過程中，鹿茸直接粉碎后服用，顆粒較大，造成吸收效率低下；有時，鹿茸的加工需要經過加熱煎煮、烘干等步驟，高溫會使其中的NGF等蛋白質變性，從而降低乃至喪失它們的功效。另一種傳統的加工方式是將鹿茸浸泡在高濃度酒精含量的酒中，制成藥酒服用。但是由于酒中含有高濃度的作為有機溶劑的酒精，會使NGF等蛋白質變性，而且從大顆粒鹿茸中也不利于溶解出NGF等蛋白質，因而會導致鹿茸中的NGF利用效率低下，造成資源浪費。另外，高濃度酒精含量的藥酒也限制了每次的服用量。
為了提高鹿茸材料的使用效率，人們嘗試了各種方法提取鹿茸中富含神經生長因子的有效成分。例如，中國專利CN1133651C披露了一種從蛇毒中提取NGF的方法，預處理后，需要經過三步層析，生產工藝復雜而且條件較為苛刻；中國專利CN1104095A中公開了一種含有NGF的鹿茸生長因子制劑，預處理后，需要對鹿茸浸提液進行超濾、CM-32柱層析和Sephadaex G50柱層析，不但需要換層析柱，而且沒有提供洗脫峰的圖譜，收集到的所謂活性峰只有標號，需要重新摸索才能重復該方法。
針對現有技術中存在的缺陷，經過長期艱苦的研究摸索，本發明人獲得了一種提取鹿茸神經生長因子的方法，該方法通過階段梯度洗脫，預處理后，僅僅需要一步層析就可以獲得高純度的神經生長因子，大大簡化了生產工藝的復雜程度，便于在大規模生產中控制質量，節約成本。

發明內容
本發明的發明目的在于提供提取鹿茸神經生長因子的方法以及由該方法制備的富含神經生長因子的鹿茸提取物，并提供了該鹿茸提取物在藥品、食品、保健品和化妝品等方面的應用。
具體而言，在第一個方面，本發明提供了一種提取鹿茸神經生長因子的方法，其包括，對鹿茸浸提液進行一步陽離子交換層析和階段梯度洗脫。其中，術語“一步”指的是在本發明的方法中，僅僅在同一種層析柱(即陽離子交換層析柱)上進行上樣和洗脫，而不包括進行其他層析的步驟。本發明由于只進行一種層析，因此工藝較之現有技術更簡單，節約了生產成本，適合在大規模生產中推廣。陽離子交換層析是本領域普通技術人員所熟知的，優選那些已經商品化的。在本發明的一個具體實施方式
中，陽離子交換層析優選為CM-Cellulose32柱層析。術語“階段梯度洗脫”指的是分階段洗脫，每階段用含不同NaCl濃度和/或不同pH的緩沖液進行洗脫。緩沖液是本領域普通技術人員所熟知的，如常用于多肽、蛋白質溶解的緩沖液(參見《分子克隆試驗指南》(科學出版社，2002年))。優選陽離子交換層析和階段梯度洗脫包括，將鹿茸浸提液調節至pH3～5并使鹿茸浸提液中的NaCl濃度達到0.3～0.5mol/L，然后上樣于陽離子交換層析柱，再依次用含0.7～0.85mol/L NaCl的pH3～5的緩沖液、含0.7～0.85mol/L NaCl的pH6～8的緩沖液和含0.9～1.1mol/L NaCl的pH6～8的緩沖液進行洗脫，收集含鹿茸神經生長因子的峰。目前已經有成熟的方法來檢測神經生長因子，優選用本發明實施例中的活性檢測方法來確定含鹿茸神經生長因子的峰并收集。優選可以包括進一步濃縮的步驟。
本文中，鹿茸浸提液指的是用水或緩沖液對鹿茸進行浸漬而得的提取液，其中含有鹿茸中的水溶性成分，包括神經生長因子。本發明優選選用新鮮鹿茸或冷藏的新鮮鹿茸作為原材料，這樣有利于最大限度地保存NGF的含量和活性。本文中所用的術語“新鮮”指的是采集鹿茸后6小時內就開始進行加工制備本發明的納米化制品或進行冷藏了，優選加工或冷藏不遲于采集后的3小時，更優選不遲于1小時，最優選不遲于20分鐘。本文中所用的術語“冷藏”指的是將鹿茸保存于0℃以下的環境中，優選保存于-20℃的環境中。優選浸提鹿茸前先將鹿茸粉碎(如，切片、研磨、勻漿和/或超聲波破碎)，這樣有利于提高浸提出有效成份的效率。通過離心和/或過濾等方式，可以收集鹿茸浸提液，去除不溶物質。
優選本發明第一個方面的方法，其依次包括如下步驟(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；(2)將鹿茸浸提液調節至pH4并使鹿茸浸提液中的NaCl濃度達到0.4mol/L，然后上樣于CM-Cellulose32柱，再依次用含0.8mol/L NaCl的pH4的緩沖液、含0.8mol/L NaCl的pH7的緩沖液和含1mol/L NaCl的pH7的緩沖液進行洗脫，收集含鹿茸神經生長因子的峰。
在第二個方面，本發明提供了一種具有神經生長因子活性的鹿茸提取物的制備方法，其包括，對鹿茸浸提液進行一步陽離子交換層析和階段梯度洗脫。其中，術語“一步”指的是在本發明的方法中，僅僅在同一種層析柱(即陽離子交換層析柱)上進行上樣和洗脫，而不包括進行其他層析的步驟。本發明由于只進行一種層析，因此工藝較之現有技術更簡單，節約了生產成本，適合在大規模生產中推廣。陽離子交換層析是本領域普通技術人員所熟知的，優選那些已經商品化的。在本發明的一個具體實施方式
中，陽離子交換層析優選為CM-Cellulose32柱層析。術語“階段梯度洗脫”指的是分階段洗脫，每階段用含不同NaCl濃度和/或不同pH的緩沖液進行洗脫。緩沖液是本領域普通技術人員所熟知的，如常用于多肽、蛋白質溶解的緩沖液(參見《分子克隆試驗指南》(科學出版社，2002年))。優選陽離子交換層析和階段梯度洗脫包括，將鹿茸浸提液調節至pH3～5并使鹿茸浸提液中的NaCl濃度達到0.3～0.5mol/L，然后上樣于陽離子交換層析柱，再依次用含0.7～0.85mol/L NaCl的pH3～5的緩沖液、含0.7～0.85mol/L NaCl的pH6～8的緩沖液和含0.9～1.1mol/L NaCl的pH6～8的緩沖液進行洗脫，收集含鹿茸神經生長因子的峰。目前已經有成熟的方法來檢測神經生長因子，優選用本發明實施例中的活性檢測方法來確定含鹿茸神經生長因子的峰并收集。優選可以包括進一步濃縮的步驟。更優選本發明第一個方面的方法，其依次包括如下步驟
(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；(2)將鹿茸浸提液調節至pH4并使鹿茸浸提液中的NaCl濃度達到0.4mol/L，然后上樣于CM-Cellulose32柱，再依次用含0.8mol/L NaCl的pH4的緩沖液、含0.8mol/L NaCl的pH7的緩沖液和含1mol/L NaCl的pH7的緩沖液進行洗脫，收集含鹿茸神經生長因子的峰。
在第三個方面，本發明提供了本發明第一個方面的方法提取的鹿茸神經生長因子。該NGF對神經組織具有多種營養性生物效應，能夠促進神經元生長、分化，修復神經損傷。在本發明的具體實施方式
中，該NGF能促使神經節長出長而密的突起，活性達到1.5×104BU/mL。
在第四個方面，本發明提供了本發明第二個方面的方法制備的具有神經生長因子活性的鹿茸提取物。該鹿茸提取物具有神經生長因子活性，能夠促進神經元生長、分化，修復神經損傷。在本發明的具體實施方式
中，該鹿茸提取物能促使神經節長出長而密的突起，活性達到1.5×104BU/mL。
在第五個方面，本發明提供了含有本發明第四個方面的鹿茸提取物的制劑。鹿茸提取物可以和藥學上可接受的輔劑組合從而加工各種制劑。藥學上可接受的輔劑包括藥學上可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等，它們與活性成分相容。運用藥學上可接受的輔劑制備制劑對本領域普通技術人員來說是公知的。本發明的制劑優選為單位劑量形式，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續釋放或延遲釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑等劑型，從而適合各種給藥形式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等的給藥形式。在本發明的具體實施方式
中，制劑優選為鹿茸神經生長因子凍干劑，其由本發明第四個方面的鹿茸提取物冷凍干燥而得。
在第六個方面，本發明提供了本發明第三個方面的鹿茸神經生長因子、本發明第四個方面的鹿茸提取物或本發明第五個方面的制劑在制備用于促進神經元生長或分化的藥品、食品和/或保健品中的應用。在第七個方面，本發明提供了本發明第三個方面的鹿茸神經生長因子、本發明第四個方面的鹿茸提取物或本發明第五個方面的制劑在制備用于修復神經損傷的藥品、食品和/或保健品中的應用。由于NGF能夠促進神經元生長、分化，修復神經損傷，因此可治療多種神經疾病或改善這些疾病的癥狀，如老年性癡呆癥、帕金森氏癥、神經末梢炎癥等。
對于藥品來說，可以對需要促進神經元生長或分化和/或需要修復神經損傷的患者進行給藥。給藥的劑量和形式一般由醫師根據患者的具體情況(如年齡、體重、性別、病情、患病時間、身體狀況等)確定。一般而言，NGF計，給藥的劑量為0.001～100mg/kg患者體重，優選為0.01～1mg/kg，優選為0.02～0.1mg/kg。給藥形式可以根據各種藥物制劑的劑型來確定，適合的給藥形式有口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內、皮下、眼內、皮內或經過皮膚等給藥形式，優選使用口噴劑或膠囊劑口服給藥。
對于食品和/或保健品來說，由于是天然制品，而且鹿茸本身有著悠久的使用歷史，健康人服用一定量的本發明的NFG、提取物或制品有助于維持其正常的神經元生長、分化，具有健腦的功效。本發明的NFG、提取物或制品可以單獨作為食品和/或保健品使用，也可以添加到其他食品和/或保健品中使用，例如，可以添加到常規的飲料、食品和/或保健品中配合應用。
本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復敘述過一樣。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見了。


圖1顯示了NGF離子交換層析圖譜，其中箭頭所指的峰為鹿茸神經生長因子所在的峰。
圖2顯示了NGF的SDS-PAGE圖譜，其中左邊的條帶為鹿茸神經生長因子，而右邊的條帶為分子量標記。
具體實施例方式
實施例1，鹿茸的預處理取新鮮鹿茸0.5kg，用冷凍切片機將鹿茸切成厚度為1～2mm的切片，然后加入適量(200mL)預冷的去離子水在4℃用勻漿機進行粉碎，勻漿操作進行至勻漿中沒有可見的組織塊時結束。對勻漿物以5000轉/分鐘(rpm)離心20分鐘，取上清液。在沉淀中加入200mL預冷的去離子水，重懸沉淀后再次以5000rpm離心20分鐘，取上清液。然后，重復上述重懸、離心過程一次，取上清液。合并各次離心分離所得的上清液，裝入截留分子量10000Da的透析袋(購自Sigma公司)，于4℃對0.02mol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)透析30分鐘，然后換磷酸鉀緩沖液重復透析，共進行6次，得到經預處理后的鹿茸浸提液850mL。
實施例2，鹿茸神經生長因子的層析純化及凍干劑的制備向850mL實施例1中得到的鹿茸浸提液中加入95mL 0.5mol/L HAc-NaAc緩沖液(pH4.0)，使得溶液的pH值降至4.0，然后再向其中加入固體NaCl，使溶液中的NaCl終濃度為0.4mol/L，充分混勻后靜置10分鐘，然后，5000rpm離心5分鐘。取900mL上清液上樣于CM-Cellulose32柱(5.5cm×10cm)(購自Pharmacia公司)，然后進行階段梯度洗脫。階段梯度洗脫時依次以10mL/分鐘的流速使用400mL含0.8mol/L NaCl的0.5mol/L HAc-NaAc緩沖液(pH4.0)、350mL含0.8mol/L NaCl的0.5mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)和500mL含1mol/L NaCl的0.5mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)進行洗脫并用紫外檢測儀在280nm波長處進行檢測(洗脫圖譜如圖1所示)。通過如實施例3所述的檢測方法檢測各個洗脫級分經透析得到的產物，發現如圖1中“目的蛋白峰”所指的峰為鹿茸神經生長因子。因此，收集該目的蛋白峰，裝入截留分子量3500Da的透析袋，于4℃對0.02mol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)透析30分鐘，然后換磷酸鉀緩沖液重復透析，共進行6次。由此得到純化的鹿茸神經生長因子溶液180mL。將溶液裝入透析袋，用聚乙二醇20000進行濃縮。然后將濃縮液冷凍，然后在-70攝氏度下用冷凍干燥機進行冷凍干燥，得到鹿茸神經生長因子凍干劑172mg。
實施例3，神經生長因子的檢測根據《分子克隆試驗指南》(科學出版社，2002年)和翟雷等的測試方法(微生物學免疫學進展，1999，27(1)43-46)檢測鹿茸神經生長因子。將實施例2得到的鹿茸神經生長因子溶液進行SDS-PAGE(15％聚丙烯酰胺分離膠、4％積層膠、10mA恒流電泳)，電泳結束后以考馬斯亮蘭染色，電泳凝膠照片如圖2所示，在分子量約14kD處有神經生長因子單一條帶，通過圖像分析得其純度達到96％。用雞胚背根神經節的生長來檢測NGF的生物活性在加入緩沖液的空白對照組中，雞胚背根神經節沒有突起生長；而在加入實施例2純化后得到的鹿茸神經生長因子溶液的實驗組中，雞胚背根神經節長出長而密的突起，活性為1.5×104BU/mL，比活為1.57×104BU/mg(參比品為鼠源NGF，購自Sigma公司)。
權利要求
1.提取鹿茸神經生長因子的方法，其包括，對鹿茸浸提液進行一步陽離子交換層析和階段梯度洗脫。
2.具有神經生長因子活性的鹿茸提取物的制備方法，其包括，對鹿茸浸提液進行一步陽離子交換層析和階段梯度洗脫。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述陽離子交換層析為CM-Cellulose32柱層析。
4.根據權利要求1-3之任一的方法，其中所述陽離子交換層析和階段梯度洗脫包括，將鹿茸浸提液調節至pH3～5并使鹿茸浸提液中的NaCl濃度達到0.3～0.5mol/L，然后上樣于陽離子交換層析柱，再依次用含0.7～0.85mol/L NaCl的pH3～5的緩沖液、含0.7～0.85mol/L NaCl的pH6～8的緩沖液和含0.9～1.1mol/LNaCl的pH6～8的緩沖液進行洗脫，收集含鹿茸神經生長因子的峰。
5.根據權利要求1-4之任一的方法，其依次包括如下步驟(1)粉碎鹿茸并浸提出鹿茸浸提液；(2)將鹿茸浸提液調節至pH4并使鹿茸浸提液中的NaCl濃度達到0.4mol/L，然后上樣于CM-Cellulose32柱，再依次用含0.8mol/L NaCl的pH4的緩沖液、含0.8mol/L NaCl的pH7的緩沖液和含1mol/L NaCl的pH7的緩沖液進行洗脫，收集含鹿茸神經生長因子的峰。
6.權利要求1、3-5之任一的方法提取的鹿茸神經生長因子。
7.權利要求2-5之任一的方法制備的具有神經生長因子活性的鹿茸提取物。
8.鹿茸神經生長因子凍干劑，其由權利要求7所述的鹿茸提取物冷凍干燥而得。
9.權利要求6所述的鹿茸神經生長因子、權利要求7所述的鹿茸提取物或權利要求8所述的鹿茸神經生長因子凍干劑在制備用于促進神經元生長或分化的藥品、食品和/或保健品中的應用。
10.權利要求6所述的鹿茸神經生長因子、權利要求7所述的鹿茸提取物或權利要求8所述的鹿茸神經生長因子凍干劑在制備用于修復神經損傷的藥品、食品和/或保健品中的應用。
全文摘要
本發明涉及由鹿茸提取神經生長因子(DEER NGF)的方法，其包括對鹿茸浸提液進行一步陽離子交換層析和階段梯度洗脫。另外，本發明還涉及由該方法制備的富含神經生長因子的鹿茸提取物以及該鹿茸提取物在藥品、食品和保健品等方面的應用。
文檔編號A61K38/18GK101020715SQ20071006760
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月15日 優先權日2007年3月15日
發明者朱成鋼, 王利忠 申請人:王利忠