專利名稱：金黃色葡萄球菌腸毒素a、b基因pcr同步檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR 同步檢測試劑盒。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，簡稱金葡菌)是動物和人類化膿感染中最常見的病原菌，在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到， 因而食品受其污染的機會很多。食品受其污染后，不僅腐敗變質，而且部分菌株產生葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal Enterotoxins，SEs)。腸毒素是一類結構相關，毒力相似，抗原性不同的胞外蛋白質。根據其抗原性可將其分為5個血清型SEA、SEB、SEC、SED和SEE，這五類稱為經典腸毒素(其中SEC中包括SEC1、SEC2和SEC3三種亞型)，也是全球食物中毒中最常見的血清型。各型腸毒素均可引起細菌性食物中毒，其中以A、D型引起的食物中毒最多，B型和C型次之。金黃色葡萄球菌在pH值低于5的條件下很少腸毒素，當pH值高于9. 8時，無論何型腸毒素都不能產生。葡萄球菌在牛奶和谷粉粥上于20 37°C下經4 8h產生毒素，在 5 6°C低溫下18d產生毒素或不產生毒素。在含水分、蛋白質和淀粉較多的食品中，葡萄球菌較易繁殖并產生毒素，如帶菌的生肉餡，于37°C下經18 19h產生毒素，若在肉餡中加入少量饅頭碎屑，在同樣溫度下只經過8h就能產生毒素，可見淀粉對形成毒素有促進作用。引起金黃色葡萄球菌腸毒素中毒的食品主要為肉、奶、魚、蛋類及制品等動物性食品。糕、涼拌切粉、剩大米飯和米酒等也曾引起過中毒；熟肉類如在熟后污染了致病葡萄球菌，又在20 30°C的環境下放置較長時間，則極易引起中毒；奶和奶制品以及用奶制作的冷飲和奶油糕點常是引起中毒的食品；油煎雞蛋、熏魚、油浸魚罐頭等含油脂較多的食品，在污染上致病性葡萄球菌以后也能產生毒素。金黃色葡萄球菌在空氣中養分低時較易產生毒素，因此帶有此菌的食品，在通風不良的高溫下放置，極有利此菌生長并產生毒素。 當食品污染了葡萄球菌并同時污染了其它微生物時，葡萄球菌的繁殖則受到抑制。如食品經加熱，原有的各種微生物已被殺死，拮抗微生物也不復存在，熟后再一次被葡萄球菌污染，則將會促進葡萄球菌的生長并形成毒素。金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在世界各地均有發現。常發生于夏秋季節，這是因為氣溫較高，有利于細菌繁殖。但在冬季，如受到污染的食品在溫度較高的室內保存，葡萄球菌也可繁殖并產生毒素。當此細菌數> IO6個/克時，產生的腸毒素可引起食物中毒等病癥。目前，檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的方法有酶聯免疫雙抗法，雙向瓊脂擴散法。酶聯免疫雙抗法的缺點是易受食物成分及葡萄球菌蛋白A的影響，檢測時間長，費用較高，不利于在基層單位推廣使用。雙向瓊脂擴散法檢測時間長，靈敏度低
發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在于提供金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR 同步檢測引物、其檢測試劑盒和檢測方法。本發明提供一種金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測引物，其為SEAB-F =TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAG (SEQ ID No. 1)SEAB-R :GTTACACCACCATACATRCAAG(SEQ ID No. 2)。其中，所述的引物擴增片段為SEA的566-670bp的片段和SEB的338_472bp的片段，PCR擴增產物長度分別為105bp和135bp。根據電泳結果，即可判斷為何種腸毒素基因。本發明還提供含有上述引物的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測試劑盒，所述試劑盒還可包括PCR緩沖液、dNTPs、無菌超純水和Taq DNA聚合酶等。本發明還提供應用上述的試劑盒在食品中食品中檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B 基因的方法，其包括1)提取食品中的DNA;2)以步驟1提取的DNA為模板進行PCR擴增；3)對PCR產物進行電泳檢測。其中，所述的PCR反應體系為每20μ 1的反應液中，含有10-50ng的模板、 20-3(^] 各上下游引物、10\ 0 緩沖液2“ 1,0. 15-0. 25mM 的 dNTPs，1-1. 5U 的 Taq DNA 聚合酶，無菌超純水補足體積。其中，所述的PCR反應條件為951預變性41^11，951變性308，50 541退火 30 60s，72°C延伸lmin，共25 30個循環，最后72°C延伸lOmin。取5 10 μ 1 PCR擴增產物點樣于3%瓊脂糖凝膠中進行檢測，電壓為90V，電泳時間為40min，然后于凝膠成像系統中成像，觀察PCR擴增產物有無預期的DNA特異性片段。本發明開發了同步檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因引物和試劑盒。本發明的檢測試劑盒能準確靈敏地檢測食品中的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B, DNA最低檢測濃度為 3. 58ng，而且與其他細菌無交叉反應，特異性好，同時樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本低于傳統的腸毒素檢測方法，而且本發明試劑保存時間長，無放射性污染。本發明對解決大批量樣品的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B的現場檢測技術具有重要的現實意義。


圖1為簡并引物SEAB特異性的瓊脂糖凝膠電泳分析圖。M =DNA Marker B ；1,8 金黃色葡萄球菌SEA ；2，9 金黃色葡萄球菌SEB ；3 陰性對照；4 金黃色葡萄球菌；5 表皮葡萄球菌；6 大腸桿菌；7 沙門氏菌。 圖2為金黃色葡萄球菌腸毒素B的DNA靈敏性試驗瓊脂糖凝膠電泳分析圖。M =DNA Marker B ；1,2 :358ng ；3，4 35. 8ng ；5，6 3. 58ng ；7，8 :358pg ；9，10 35. 8pg。圖3為SEA、SEB在同一個PCR反應管中反應的電泳分析圖。M =DNA Marker B ；1 SEA、SEB在同一 PCR反應管中擴增的結果。圖4為細菌菌數10倍系列稀釋的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳分析圖。M =DNAMarker B ；1 :2X106cfu/ml ；2 :2X 105cfu/ml ；3 :2X 104cfu/ml ；4 :2X 103cfu/ml ；5 :2X 102cfu/ml ； 6 :1. 9 X IO1CfVml ；7 陰性對照。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1簡并引物檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B的PCR試劑盒的組建(1)簡并引物 SEAB 上、下游各 15πιΜ，100μ 1。(2) IOX PCR 緩沖液(含 Mg2+20mM)，1. 5ml。(3) dNTPs (IOmM)，1. 5ml。(4)無菌超純水，3. Oml。(5) Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1)，100 μ 1。實施例2試劑盒操作取簡并上游引物0. 5μ 1，簡并下游引物0. 5μ 1，10XPCR緩沖液2μ 1，dNTPs 0. 5μ l,Taq DNA聚合酶0. 5 μ 1，無菌超純水補足至20 μ 1，放入0. 2ml的離心管中，把提取的菌體DNA 1 μ 1加入上述體系中，總體積為20 μ 1，離心混勻后置PCR儀上進行自動化擴增反應。提取菌體DNA的方法①將Iml無水乙醇、Iml氨水和Iml石油醚加入到5ml人工污染金黃色葡萄球菌腸毒素A、B的乳品樣品中，混勻。②混合物以12000xg，離心lOmin。棄去上清液，剩余的沉淀用300 μ 1 10mM/L TE(pH7. 8)溶解。將Syl(IOmgAil)的溶葡萄球菌酶加入到上述液體中，37°C水浴lh，期間不斷劇烈振蕩。③將50μ1 10%的SDS加入上述液體中，煮沸5min。④將等體積的氯仿加入上述混合液中，充分振蕩混勻，17000xg離心lOmin，棄沉
淀，保留上清液。⑤將上清液移入一新的離心管中，用0. 1倍體積2. 5M乙酸銨(pH5. 4)，2. 5倍體積預冷無水乙醇和5 μ 1 (10mg/ml)糖原沉淀DNA，混合物17000xg，離心20min。DNA沉淀干燥后用50 μ 1 TE溶解，置于-20°C備用。反應條件為95°C預變性4min，95°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸lmin，共30 個循環，最后72°C延伸IOmin。取5 μ 1 PCR擴增產物點樣于3%瓊脂糖凝膠中進行檢測，電壓為90V，電泳時間為 40min，然后于凝膠成像系統中成像，觀察PCR擴增產物有無預期的DNA特異性片段。結果表明，在IOObp和130bp左右出現兩條特異的條帶，而陰性對照則無條帶出現。實驗例1以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌為對照菌，利用上述檢測方法同時對金黃色葡萄球菌腸毒素SEA菌株，金黃色葡萄球菌腸毒素SEB菌株和對照菌株進行PCR檢測，然后對PCR擴增產物進行電泳檢測，實驗結果見圖1。由圖可知，簡并引物 SEAB只對金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB菌出現PCR陽性擴增反應，對照組未出現特異性片段，該簡并引物顯示了良好的特異性。實驗例2靈敏性實驗提取的金黃色葡萄球菌腸毒素B的DNA經紫外分光光度計檢測并計算其濃度。DNA定量測定方法將提取的DNA模板進行適度稀釋，用紫外分光光度計測定260nm波長下的 OD值，DNA含量=OD260 X 50 μ g/ml (雙鏈DNA) X 10 (稀釋倍數)，經計算得DNA含量=358ng/ μ 1，將其逐步10—1 ； 10_2 ； 10_3 ； 10_4 ； 10_5稀釋，分別取1 μ 1為模板進行PCR反應，確定DNA最低檢測濃度為3. 58ng,電泳結果見圖2所示。實驗例3簡并引物同時檢測腸毒素A、B的實驗分別取SEA、SEB菌的DNA 1μ 1為模板，加入到同一個PCR反應管中，無菌超純水 12 μ 1，其余用量不變，PCR反應條件也不變，電泳結果見圖3，由圖可知SEA、SEB菌的PCR 特異性片段已擴增出并分離開，說明特異性簡并引物SEAB既可以分別檢測金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、SEB菌，又可以檢測出一個樣品中是否同時含有金黃色葡萄球菌腸毒素SEA、 SEB菌。不但減少了引物用量，節約成本，而且縮短了檢測時間，提高檢測效率。實驗例4菌體靈敏性實驗本實驗不可以直接進行菌體PCR，因為金黃色葡萄球菌的細胞壁比較厚，煮沸不能破壞其細胞壁，因此必須提取其DNA。本實驗的目的就要建立一種能夠同時快速檢測食品中 A型和B型金黃色葡萄球菌的PCR方法。以金黃色葡萄球菌腸毒素SEB菌株作為檢測菌，營養肉湯過夜增菌培養后用無菌生理鹽水做一系列10倍稀釋，再經平板菌落計數得知各梯度濃度為2X106、2X105、 2X 104、2X 103、2X 102、1. 9X IOlJcfuAil,分別用PCR方法進行檢測。檢測結果表明本方法的靈敏性為2X103cfu/ml，顯示了較好的靈敏性，電泳結果見圖4所示。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。實驗例5本發明試劑盒檢測生牛乳中的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B實施例1的試劑盒檢測了 50份生牛乳，結果見表1可知，其中有3份被檢出含有 SEA，有4份被檢出含有SEB，有2份含有SEA和SEB，產毒素率為18%。本試驗結果與Mork 等及Jorgensen等報告生鮮乳中葡萄球菌產毒素率分別為38.0%和22. 1% [73]，基本一致。表1金黃色葡萄球菌及其腸毒素的檢測結果
權利要求
1.金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測引物，其為SEAB-F TGATAAATAYAAAGRKAAAffAMGTAGSEAB-R :GTTACACCACCATACATRCAAG。
2.含有權利要求1所述引物的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測試劑盒。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包含PCR緩沖液、dNTPs、無菌超純水和Taq DNA聚合酶。
4.應用權利要求2或3所述的試劑盒在食品中檢測金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因的方法，其包括1)提取食品中的DNA;2)以步驟1提取的DNA為模板進行PCR擴增；3)對PCR產物進行電泳檢測。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應體系為每20μ 1的反應液中，含有10-50ng的模板、20-30pM各上下游引物、10XPCR緩沖液2μ 1、0. 15-0. 25mM的 dNTPs, 1-1. 5U的TaqDNA聚合酶，無菌超純水補足體積。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反應條件為95°C預變性 4min, 95°C變性30s，50 54°C退火30 60s，72°C延伸lmin，共25 30個循環，最后72°C 延伸lOmin。
全文摘要
本發明公開了一種金黃色葡萄球菌腸毒素A、B基因PCR同步檢測引物、其檢測試劑盒和檢測方法。本發明提供的同步檢測引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1和2所示。本發明還提供含有所述引物的PCR檢測試劑盒。本發明的檢測試劑盒能準確靈敏地檢測食品中的金黃色葡萄球菌腸毒素A、B，DNA最低檢測濃度為3.58ng，而且與其他細菌無交叉反應，特異性好，同時樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，成本低。
文檔編號C12N15/11GK102181547SQ201110092430
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月13日 優先權日2011年4月13日
發明者劉繼超, 周偉明, 姜鐵民, 陳歷俊 申請人:北京三元食品股份有限公司