專利名稱：NBS Profiling鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源的方法
技術領域：
本發明涉及應用NBS Profiling分子技術，調查植物品種或資源與潛在親本的起源關系。本發明描述了 NBS Profiling在植物雜交育種中雜交后代的雜種真實性的早期鑒定、及具有重要經濟和研究價值植物品種或材料的親本起源鑒定中的方法。
背景技術：
NBS Profiling是一種基于生物核苷酸結合位點-亮氨酸富集重復序列 (nucleotide-binding site-leucine-rich repeat, NBS-LRR)高度保守的特點，設計 NBS 引物，通過PCR擴增獲得特異性分子片段或標記的方法。已知植物抗病基因都具有幾個高度保守的NBS-LRR區域，針對植物抗病基因和抗病基因同源序列NBS-LRR保守序列設計發明的NBS Profiling技術，是一種高度可靠的DNA多位點文庫構建、且可以免費使用的技術，具有與AFLP、ISSR分子標記技術相似的顯性多位點標記體系的特點。自C. G van der Linden (Theoretical and Applied Genetics (2004) 109: 384 - 393 "Efficient targeting of plant disease resistance loci using NBS profiling"(禾用 NBS Profi 1 ing有效標定植物病害抗性位點))建立NBS Profi 1 ing技術以來，已成功的應用于許多重要作物，如馬鈴薯、番茄、水稻、大麥、萵苣、葡萄等的抗病基因的分離鑒定和序列分析。現代植物育種，經常利用野生資源與栽培品種的雜交，將野生資源中的抗逆、抗病等重要性狀的基因轉移到栽培種中。但由于種間雜交親緣關系遠、且無法完全去雄或隔離授粉，雜交后獲得的后代有些不是真正的雜交種。對于像球根花卉水仙、郁金香、百合，木本植物金絲桃、杜鵑花、蘋果等生長周期長的植物，如果能在種子苗早期將非雜交后代的自交苗識別去除，可以節省栽培管理這些材料的大量人力、物力，將大大的降低育種成本。此外， 了解和弄清一些長期使用，但親本來源不清、性狀優良栽培品種的親本來源，有助于這些品種的性狀改良。現有鑒定植物雜交后代或品種與親本遺傳關系的方法中，傳統的形態學方法存在從種子播種到植株長成、開花結果耗時長，受環境因素影響大等缺點；分子細胞遺傳學方法-基因原位雜交(genomic in situ hybridization, GISH )雖然能夠有效的鑒定親本與雜交后代的遺傳關系，但該方法從染色體制片開始到完成鑒定至少需要一周以上，非常耗時耗力，操作人員必須具有豐富的經驗和好的操作技能才能應用這項技術，因此實際應用受到了極大的限制。

發明內容
本發明的目的是為了克服現有鑒定技術周期長、費時費力、或技術要求高等缺點， 提供一種新的鑒定雜交后代雜種性、物種起源的方法。本發明的發明人研究得出通過比較NBS Profiling擴增片段的相似性，可高效準確地分析鑒定植物雜交后代的雜種性或栽培品種與潛在親本的遺傳關系。本發明所述的一種NBS Profiling鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源的方法，按以下步驟進行
(1)供DNA提取的幼葉的采集與保存；
(2)總DNA的分離純化；
(3)進行酶切反應，對酶切反應產物進行檢測，DNA限制性酶消解和末端受體連接；
(4)NBS Profiling擴增，包括兩步PCR反應；
(5)擴增片段的聚丙烯酰胺膠分析和植物雜交后代雜種性、物種起源的判定。采用本發明方法，可以早期快速地鑒定植物育種雜交后代的雜種性，提高育種效率；可以比較鑒定一些親本來源不清、性狀優良栽培品種的親本起源，輔助這些品種的性狀改良；可以追溯鑒定一些重要植物資源的親本起源，促進這些資源的進一步應用。NBS Profiling可以鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源，理論推導可能是由于NBS序列高度保守、能夠穩定遺傳給后代的特點，雜交后代的NBS序列應該和其母本和(或)父本一致。


附圖1 NBS特異引物NBS-GLPL及限制性內切酶TfeaI組合的水仙花yVarci^^s tazetta (cv. iSoleil d，or，)(泳道 1,2)，iTete-Q-Tete'(泳道 3，4)， 和 Narcissuscyclamineus (泳道 5，6) NBS profiling 的帶型特征‘T6te-(5-T6te，所有的條帶都能追溯到Ar. iazeiia和Λ的條帶中。附圖2 NBS特異引物NBS5A及限制性內切酶i&el組合的金絲桃 perforatum (HP)與 Elite amber (EA)及其雜交后代(泳道 I、2、3)的 NBS profiling 帶型特征雜交后代的帶型與其母本(HP)的帶型完全相同。
具體實施例方式本發明提供了一種NBS Profiling鑒定雜交后代雜種性、植物起源的方法，具體的方法如下
1.供DNA提取的幼葉的采集與保存
采集待鑒定基因型，如雜交親本及其雜交后代、或品種及其潛在親本的幼嫩葉片，立即放入液氮中將其快速冷凍，隨后轉移到_18°C _80°C低溫下貯存供DNA分離提取；
2.總DNA的分離純化
DNA的質量是影響NBS Profiling成功最重要的因子之一；
采用常用的 Fulton 法(Plant Molecular Biology Reportor, 1995, 13(3) 207-209) 或 CTAB 法(Nucleic Acids Research, 1980, 8(19) 4321-43 )提取幼嫩植物組織的 DNA，用0. 8% 1. 5%瓊脂糖電泳和紫外檢測DNA的濃度和純度，DNA濃度應達到1 μ 1 100 ng 以上，DNA純度0D26Q/28Q值應介于1. 8 2. 0之間；提取DNA貯藏于_20°C冰箱，于反應前取部分稀釋用于NBS Profiing鑒定；
3.DNA的限制性酶消解和末端受體連接 (1)酶切反應
取上述步驟2獲得的植物總DNA，用7&al、i&el等四堿基識別位點的限制性內切酶將其切割為不同大小的DNA片段；以TfeaI為例的10 μ 1酶切反應體系如下1 μ + Rsal 緩沖液 1 μ 1 + 蒸餾水 7 μ 1 + DNA 1 μ 1 (100 ng 400 ng)；酶切反應于37°C恒溫條件下反應4h4h或過夜，將反應板置于65°C水浴鍋中IOmin 20min中止反應；
(2)酶切反應產物檢測
采用0. 8%-1. 5%瓊脂糖電泳檢測酶切反應產物，選擇能夠把植物總DNA切割成不同長度、連續分散的DNA片段的內切酶，用于下一步酶切、末端受體連接反應；
(3)DNA限制性酶消解和末端受體連接
這一步是在使用限制性內切酶切割總DNA的同時，將一個末端受體連接到新產生的 DNA末端上。末端受體分為平端受體(適用于i&el外的限制性內切酶)和i&el特異的受體兩種；
平端受體(blunt adapter)序列為
5' ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA 3，
3' NH2TTCATATCTAGGGT 5' -P; Msel特異的受體序列為
5' ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA 3' 3' NH2TTCATATCTAGGGTAT 5'；
酶切和受體連接的反應體系(60 μ 1體系為例):5x AFLP緩沖液12 μ 1 +末端受體 3 μ 1 + 蒸餾水 36 μ 1 +ATP (10 mM)6 μ 1 + 限制性酶 1 μ 1 + Τ4 連接酶(5 U/μ 1) 1 μ 1 + DNA (100 ng 400 ng) 1 μ 1 ；酶在加完所有試劑后最后一步加入；
酶切和連接反應于37°C恒溫條件下反應4h4h或過夜，將反應板置于65°C水浴鍋中 IOmin 20min中止反應；反應產物置于4 °C或-20 °C冰箱貯藏；
加60 μ 1蒸餾水到上述酶解-連接反應產物將其稀釋一倍后，供下一步的NBS Profiling擴增反應使用； 4. NBS Profiling 擴增 NBS Profiling擴增包括兩步PCR反應 (1)第一次PCR擴增
第一步PCR擴增反應是線性的，25 μ 1反應體系為步驟3稀釋的酶解-連接反應產物 5 μ 1 + NBS 特異引物 2 μ 1 + 受體引物(10 pMol/ul) 2 μ 1 + dNTP (5mM) 1 μ 1 + IOx PCR 緩沖液 2. 5 μ 1 + DNA Taq 聚合酶 0. 08 μ 1 + 蒸溜水 12. 42 μ 1 ；
PCR擴增反應為95°C 預變性 15 min ；95°C 變性30s，55°C-60°C退火 100s，72°C 延伸2 min，共30個循環；72°C延伸20min后10°C保存。其中退火溫度NBSl、NBS5、NBS6、NBS GLPL 引物為 55° C，NBS2、NBS3 引物為 60° C ； 受體引物序列為
5' GTTTACTCGATTCTCAACCCGAAAG 3'； NBS特異引物序列如下
NBSGLPL 5，TGYRRAGGAYTRCCWYTAGC3 NBS1:5，GCIARffGTffGTYTTI C C Y R A I CC 3'；NBS2:5，GTffGTYTTICCYRAI C C I S S C AT 3'；NBS3:5，GTffGTYTTI CC YRAIC C I S S C A TI C C 3，NBS5A5YYTKRTHGTMITKGA T G A T G T ]T G G 3NBS 6: 5' YYTKRTHGTMITKGATGATATITGG3'； 其中 Y=C 或 T ；R=A 或 G ；W=A 或 T ;S=C 或 G ；K=G 或 T ；H=A 或 C 或 T ；M=A 或 C ；A=Adenine (腺嘌呤)！I=Is0Ieucine (異亮氨酸)； (2)第二次PCR擴增
第二步PCR擴增反應是指數性擴增，以4 (1)中第一次擴增的PCR產物為DNA模板， 加入NBS特異引物和標記受體引物進行PCR反應。10 μ 反應體系為4 (1)中第一次擴增的PCR產物5μ1 + IRD 700標記的受體引物(1 pmolM)0. 6 μ 1 + NBS特異引物(10 pMol/ul)2 μ 1 + dNTP (5mM) 0. 4 μ 1 + IOx PCR 緩沖液 1 μ 1 + DNA Taq 聚合酶 0. 04 μ 1 +蒸餾水2. 66 μ 1，除延伸溫度由100s減為40s，PCR循環減為20個循環外，其余與第一次PCR反應條件相同；
5.擴增片段的聚丙烯酰胺膠分析和植物雜交后代雜種性、物種起源的判定將上述4 (2)中標記的PCR產物進行聚丙烯酰胺膠電泳分離，以LiCor DNA分析儀 (LI-COR Inc, Lincoln, USA)上的操作為例，操作技術如下加入0. 5 1. 5倍體積的溴酚藍上樣緩沖液到4 (2)中標記的第二次PCR產物中，混勻樣品于94° C條件下變性5 min 后，立即轉移到冰上至加樣結束，然后將其保存于4° C或-20° C冰箱；根據待鑒定材料的不同，在進行植物雜交后代雜種性鑒定時，即鑒定育種中雜交后代是否為真雜種的情況時， 上樣時按親本1 -雜交后代-親本2的順序排列樣品；對于鑒定某個品種或資源的起源親本的情況，上樣時按已知親本或潛在親本1 -待鑒定的品種或資源-潛在親本2的順序排列樣品；每一樣品的加樣量為0.4 μ Γ0. 5 μ 1 ；所述的植物雜交后代雜種性、物種起源的判定是如果雜交后代的擴增條帶一部分與父本相同和一部分與母本相同，且所有條帶都能追溯到雜交親本中，說明這一雜交后代為真雜種；如果雜交后代的擴增條帶與母本的條帶完全相同，說明這一雜交后代為自交種；具有待鑒定的品種或資源的所有條帶的潛在親本組合是該待鑒定的品種或資源的親本。針對上述第一種情況，分析親本1-后代-親本2樣品聚丙烯酰胺膠電泳分離的帶型特征，如果雜交后代的擴增條帶一部分與父本相同、一部分與母本相同，且所有條帶都能追溯到雜交親本中，說明這一雜交后代為真雜種，應該保留做進一步的分析觀察；如果雜交后代的擴增條帶與母本的條帶完全相同，說明這一雜交后代為自交種，應將其拔出扔掉，節省后期工作相應的人力物力。同理，針對上述第二種情況中那些親本起源不詳的重要栽培品種或資源，將可能的親本按上述方式一一排列，具有待鑒定的品種或資源所有條帶的那一對潛在親本組合既是該品種或資源的親本。在第二種情況中，由于該方法只是在最后一步聚丙烯酰胺膠電泳分離NBS Profiling擴增片段時，將不同潛在親本按不同組合上樣，因此可以大量的比較鑒定不同的潛在親本材料，工作效率高。實施例
實施例1 水仙花品種Narcissus ‘Tgte_di-Tgte’未知親本的鑒定水仙花品種Narcissus ‘TgteHgte’，是一個早春栽培品種，由于其多花、花色亮麗 (金黃色)、株型矮化適于盆栽、抗性好、易于栽培管理等優點，自1949年培育至今仍然非常流行，占有當今歐洲早春市場40%的份額。由于‘Tgte-0-Tgte’是一個完全不育的三倍體， 使其難于在進一步的育種中應用。育種家試圖根據‘Tgte-0-Tgte’原來的培育途徑，利用其親本重新合成具有‘Tgte-0-Tgte’優點的不同花色的新品種。但培育‘Tgte-0-Tgte，的一個親本一直是未知的。根據記載，‘Tgte-0-Tgte’來自分屬于兩個不同亞屬的水仙花Λ cyclamineus (Narcissus subgenus)禾口tazettaSoleil d ' Or (Hermione subgenus)的雜交后代N.
'Cyclataz',從N. ‘ Cyclataz'開放式授粉后代中選育獲得。由于開放式授粉中供給花粉的親本是隨機的，所以培育‘Tgte-0-Tgte’的一個親本一直是未知的。因此‘Tgte-0-Tgte’ 未知親本的鑒定對于培育更多具有‘Tgte-0-Tgte’優良性狀的新品種具有重要意義。根據‘Tgte-0-Tgte，的性狀及染色體數推測與N. ' Cyclataz'雜交的未知親本可能為況 cyclamineus (species), N. papyraceus (species)、Topolino (cultivar)或與它們相關的種或品種。利用NBS Profiling鑒定其親本的具體方法如下
1.植物材料
采集已知親本況 cyclamineus, N. tazettaSoleil d Or 禾口潛在親本Λ cyclamineus (同前)、Λ papyraceus (species)、Topolino (cultivar)白勺幼嫩口十片，立艮口放入液氮中將其快速冷凍，隨后轉移到_80°C低溫下貯存供DNA分離提取； 供試的所有水仙花材料由荷蘭瓦赫寧根大學、植物育種組提供；
2.總DNA的分離純化
米用 Fulton 法(Microprep protocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous plants (Microprep 法提取番禾口其它草本植物 DNA 的操作)，Plant Molecular Biology Reportor, 1995, 13(3) 207-209)提取水仙花幼嫩植物組織的 DNA， 1%瓊脂糖電泳和紫外檢測DNA的濃度和純度，DNA濃度達到1 μ 300 ng -1 μ 1 2000 ng，DNA純度0D26(1/28(1值介于1. 85-1. 95之間；提取DNA貯藏于_20°C冰箱，于反應前取部分稀釋用于NBS Profiing鑒定；
3.DNA的限制性酶消解和末端受體連接
(1)酶切反應
取上述步驟2獲得的植物總DNA，用7&al、i&el限制性內切酶將其切割為不同大小的 DNA片段。酶切反應體系為10 μ 1體系，以T&al為例的反應體系(10 μ 1體系)如下-.Rseil 1 μ 1 + Rsal 緩沖液 1 μ 1 + 蒸餾水 7 μ 1 + DNA 1 μ 1 (300 ng)；
酶切反應于37°C恒溫條件下反應4h4h或過夜，將反應板置于65°C水浴鍋中15 min 中止反應；
(2)酶切反應產物檢測
采用1%-1. 5%瓊脂糖電泳檢測酶切反應產物，限制性內切酶7&al、i&el均能把水仙花幼葉總DNA切割成不同長度、連續分散的DNA片段；
(3)DNA限制性酶消解和末端受體連接
在上述3 (2)確定適宜限制性內切酶的基礎上，在限制性內切酶切割總DNA的同時， 將一個末端受體連接到新產生的DNA末端上-,Rsal的酶切-連接反應體系使用平端受體， Msel酶切-連接反應體系使用i&eI的特異受體；
酶切-受體連接的反應體系(60 μ 1體系)為5x AFLP緩沖液12 μ 1 +末端受體3 μ 1 + 蒸餾水 36 μ 1 +ATP (10 mM) 6 μ 1 + 限制性酶 1 μ 1 + Τ4 連接酶(5 U/μ 1) 1 μ 1 + DNA (300 ng) 1 μ 1 ；酶在加完所有試劑后最后一步加入；
酶切和連接反應于37°C恒溫條件下反應Mi或過夜，將反應板置于65°C水浴鍋中15min中止反應。反應產物置于4 °C或-20 °C冰箱貯藏；
加60 μ 1蒸餾水到上述酶解-連接反應產物將其稀釋一倍后，供下一步的NBS Profiling擴增反應使用；
4.NBS Profiling 擴增
(1)第一次PCR擴增
第一次PCR擴增反應體系為(25 μ 1體系):步驟3稀釋的酶解-連接反應產物5 μ + NBS 特異引物 2 μ 1 + 受體引物(10 pMol/ul)2 μ 1 + dNTP (5mM) 1 μ 1 + IOx PCR 緩沖液 2·5μ1 + DNA Taq 聚合酶(Hotstart，購于 Qiagen 公司)0.08 μ 1 + 蒸餾水 12. 42 μ ；
PCR擴增反應為95°C 預變性 15 min ；95°C 變性30s，55°C-60°C退火 100s，72°C 延伸2 min，共30個循環；72°C延伸20min后10°C保存；其中退火溫度NBS1、NBS5、NBS6、NBS GLPL 引物為 55° C，NBS2、NBS3 引物為 60° C ；
(2)第二次PCR擴增
以4( 1)中第一次擴增的PCR產物為DNA模板，加入相應的NBS特異引物和標記受體引物進行第二次PCR反應；反應體系為(10 μ 1體系)4 (1)中第一次擴增的PCR產物5 μ 1 + IRD 700 標記的受體引物(1 ρπιο1/μ1)0. 6 μ 1 + NBS 特異引物(10 pMol/ul) 2 μ 1 + dNTP (5mM) 0.4 μ 1 + IOx PCR 緩沖液Ιμ + DNA Taq 聚合酶(Dreams，購于BioChain 公司)0.04 μ 1 +蒸餾水2. 66 μ 1 ;PCR擴增反應與第一次PCR反應條件相似，但延伸溫度由IOOs減為40s、PCR循環減為20個循環；
5.擴增片段的聚丙烯胺膠分析和植物雜交后代雜種性、物種起源的判定
上述4 (2)中標記的第二次PCR產物于LiCor DNA分析儀(LI-COR Inc, Lincoln, USA)上進行聚丙烯胺膠電泳分離；加入10 μ 1溴酚藍上樣緩沖液到第二次PCR產物中，與樣品混勻總體積20 μ 于94° C條件下變性5 min后，立即轉移到冰上至加樣結束，然后將其保存于4° C或-20° C冰箱；
聚丙烯胺膠電泳按已知親本或潛在親本1 - Tgte-0-Tgte’ -已知親本或潛在親本2 的順序上樣，每一樣品的加樣量為0.5 μ ；
用不同的NBS引物與限制性酶組合，NBS Profiling在iTete-Q-Tete'上獲得358條多態性條帶，見表表1 ；如附圖1 :NBS-GLPL/7&aI組合的例子所示，N. cyclamineus和Λ tazettaSoleil d ’ Or 具有 ‘Tgte-di-Tgte，的所有 NBS Profiling 條帶，iTete-Q-Tete'的所有條帶都能追溯到況cyclamineus和Λ tazettaSoleil d，Or中，其它的材料則不具有這一帶型特征。因此給N. ' Cyclataz'提供花粉的未知親本是Λ cj^^^i/^m，水仙花育種人利用已知親本或來自相同組系的其它種或品種重新合成類似‘Tgte-0-Tgte’特征的新品種成為可能。 表1不同的限制性酶/NBS引物組合在‘Tgte-0-Tgte’上擴增的多態性條代數及其與親本況cyclamineus禾Π N. tazetta，Soleil d’Or’的相似性
權利要求
1.NBSProfiling鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源的方法，按以下步驟進行(1)供DNA提取的幼葉的采集與保存；(2)總DNA的分離純化；(3)進行酶切反應，對酶切反應產物進行檢測，DNA限制性酶消解和末端受體連接；(4)NBS Profiling擴增，包括兩步PCR反應；(5)擴增片段的聚丙烯酰胺膠分析和植物雜交后代雜種性、物種起源的判定。
2.根據權利要求1所述的NBSProfiling鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源的方法， 其特征在于所述的(1)供DNA提取的幼葉的采集與保存是采集待鑒定的雜交親本及其雜交后代、或品種及其潛在親本的幼嫩葉片，立即放入液氮中將其快速冷凍，隨后轉移到-18°C _80°C低溫下貯存供DNA分離提取；所述的(2)總DNA的分離純化是采用常用的Fulton法或CTAB法提取幼嫩植物組織的 DNA,用0. 8% 1. 5%瓊脂糖電泳和紫外檢測DNA的濃度和純度，DNA濃度達到100 ng/ μ 1 以上，DNA純度OD26W值介于1. 8 2. 0之間，所提取的DNA貯藏于_20°C冰箱，于反應前取部分稀釋用于NBS Profiing鑒定；所述的(3)進行酶切反應，對酶切反應產物進行檢測，DNA限制性酶消解和末端受體連接是①酶切反應是取步驟(2)獲得的植物總DNA，用feal或i&el四堿基識別位點的限制性內切酶將其切割為DNA片段，酶切反應于37°C恒溫條件下反應4h-6h或過夜，將反應板置于 65°C水浴鍋中IOmin 20min中止反應；②酶切反應產物檢測是采用0. 8%_1· 5%瓊脂糖電泳檢測酶切反應產物，選擇能夠把植物總DNA切割成不同長度、連續分散的DNA片段的內切酶，用于下一步酶切、末端受體連接反應；③DNA限制性酶消解和末端受體連接是在使用限制性內切酶切割總DNA的同時，將一個末端受體連接到新產生的DNA末端上，末端受體分為平端受體和i&el特異的受體兩種；所述的平端受體的堿基序列為 5' ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA 3，， 3， NH2 TTCATATCTAGGGT 5' -P 所述的i&el特異的受體的堿基序列為 5' ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA 3' 3' NH2- TTCATATCTAGGGTAT 5'酶切和受體連接的反應體系60 μ 1總體系中有切AFLP緩沖液12 μ 1 +末端受體 3 μ 1 + 蒸餾水 36 μ 1 + ATP (10 mM)6 μ 1 + 限制性酶 1 μ 1 + Τ4 連接酶(5 U/μ 1) 1 μ 1 + DNA (100 ng 400 ng) 1 μ 1，酶在加完所有試劑后最后一步加入；酶切和連接反應于37°C恒溫條件下反應4h4h或過夜，將反應板置于65°C水浴鍋中 IOmin 20min中止反應，反應產物置于4 °C或-20 °C冰箱貯藏；加60 μ 1蒸餾水到所述的酶解-連接反應產物將其稀釋一倍后，供下一步的NBS Profiling擴增反應使用； 所述的(4)NBS Profiling擴增，包括兩步PCR反應是 ①第一次PCR擴增第一步PCR擴增反應，25 μ 1反應體系為步驟(3)稀釋的酶解-連接反應產物5 μ + NBS 特異引物 2 μ 1 + 受體引物(10 pMol/ul) 2 μ 1 + dNTP (5mM) 1 μ 1 + IOx PCR 緩沖液2. 5 μ 1 + DNA Taq聚合酶0. 08 μ 1 +蒸餾水12. 42 μ 1 ；PCR擴增反應條件為95°C預變性15 min ;95°C變性30s，55 °C -60 °C退火 100s, 72°C延伸2 min，共30個循環；72°C延伸20min后10°C保存；其中退火溫度NBS1、 NBS5、NBS6、NBS GLPL 引物為 55° C，NBS2、NBS3 引物為 60° C ； 受體引物序列為5' GTTTACTCGATTCTCAACCCGAAAG 3'； NBS特異引物序列如下NBS LPL 5' TGYRRAGGAYTRCCffYTAGC 3' NBS 1: 5' GCIARWGTWGTYTTICCYRAICC3' NBS 2: 5' GTWGTYTTICCYRAICCISSCAT3' NBS 3: 5' GTffGTYTTI CC YRAICCISSCATICC 3' NBS 5A: 5' YYTKRTHGTMITKGATGATGTITGG3' NBS 6: 5' YYTKRTHGTMITKGATGATATITGG3'； ②第二次PCR擴增第二步PCR擴增反應是以步驟(4)①中第一次擴增的PCR產物為DNA模板，加入NBS特異引物和標記受體引物進行PCR反應，10 μ 1反應體系為步驟(4)①中第一次擴增的PCR 產物5μ1 + IRD 700標記的受體引物(1 pmolM)0. 6 μ 1 + NBS特異引物(10 pMol/ul) 2 μ 1 + dNTP (5mM) 0. 4 μ 1 + IOx PCR 緩沖液 1 μ 1 + DNA Taq 聚合酶 0. 04 μ 1 + 蒸餾水2. 66 μ 1 ；PCR擴增反應條件除延伸溫度由IOOs減為40s，PCR循環減為20個循環外， 其余與第一次PCR反應條件相同；所述的(5)擴增片段的聚丙烯酰胺膠分析是將步驟(4)②中標記的PCR產物進行聚丙烯酰胺膠電泳分離，加入0. 5^1. 5倍體積的溴酚藍上樣緩沖液到步驟(4)②中標記的第二次PCR產物中，混勻樣品于94° C條件下變性5 min后，立即轉移到冰上至加樣結束，然后將其保存于4° C或-20° C冰箱；當鑒定植物雜交后代雜種性時，上樣按親本1 -雜交后代-親本2的順序排列樣品；當鑒定物種起源時，上樣按已知親本或潛在親本1 -待鑒定的品種或資源-潛在親本2的順序排列樣品；每一樣品的加樣量為0.4 μ Γ0. 5 μ ； 所述的植物雜交后代雜種性、物種起源的判定是如果雜交后代的擴增條帶一部分與父本相同、一部分與母本相同，且所有條帶都能追溯到雜交親本中，說明這一雜交后代為真雜種； 如果雜交后代的擴增條帶與母本的條帶完全相同，說明這一雜交后代為自交種；具有待鑒定的品種或資源所有條帶的潛在親本組合是該待鑒定的品種或資源的親本。
3.根據權利要求1或2所述的NBSProfiling鑒定植物雜交后代雜種性、 物種起源的方法，其特征在于所述的鑒定物種起源的品種是鑒定水仙花品種 Narcissus iTete-O-Tete^。
4.根據權利要求1或2所述的NBSProfiling鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源的方法，其特征在于所述的鑒定植物雜交后代雜種性的鑒定金絲桃種間雜交后代。
全文摘要
本發明是NBS Profiling鑒定植物雜交后代雜種性、物種起源的方法，涉及應用NBS Profiling分子技術領域。該方法(1)提供DNA提取的幼葉的采集與保存；(2)總DNA的分離純化；(3)進行酶切反應，對酶切反應產物進行檢測，DNA限制性酶消解和末端受體連接；(4)NBS Profiling擴增，兩步PCR反應；(5)擴增片段的聚丙烯酰胺膠分析和植物雜交后代雜種性、物種起源的判定。該方法可早期快速地鑒定植物育種雜交后代的雜種性，提高育種效率；比較鑒定一些親本來源不清、性狀優良栽培品種的親本起源，輔助這些品種的性狀改良；追溯鑒定一些重要植物資源的親本起源，促進這些資源的進一步應用。
文檔編號C12Q1/68GK102191331SQ201110118999
公開日2011年9月21日 申請日期2011年5月10日 優先權日2011年5月10日
發明者吳景芝, 吳紅芝, 金壽林, 陳溪 申請人:云南農業大學