專利名稱：一種構建百合雜交后代無性系群體的方法
技術領域：
本發明涉及一種構建雜交后代無性系群體的方法，尤其涉及一種構建百合雜交后代無性系群體的方法，屬于植物育種技術領域。
背景技術：
歐美國家在20世紀初即對百合新品種選育技術開展了大量研究，至2008年全球官方登記的百合品種數量已達9465個。歐洲百合育種強國荷蘭每年能推出近200個百合新品種。目前，我國的百合栽培品種幾乎都來自荷蘭，國內百合育種業近年雖有較大進步，但是培育出的百合品種數量仍然無法與國外強國相比。由于我國百合育種起步晚，而百合雜交后代種球的培育周期較長，僅從雜交種子到開花的周期就長達4 5年，選育一個品種至少需要11年時間，如此長的育種周期嚴重制約著百合花卉育種行業的規?；?、產業化發展，難于滿足市場對自育百合新品種的需求。因此，必須加快百合品種的育種進程，對現有的育種技術進行改進，以縮短百合新品種的培育時間。

發明內容
為縮短百合育種周期、加快百合新品種的培育速度、規?；赝瞥霭俸闲缕贩N，本發明提供一種構建百合雜交后代無性系群體的方法。本發明提供的是這樣一種構建百合雜交后代無性系群體的方法，其特征在于經過·下列各步驟
將經過篩選后的百合目標親本經過切割柱頭雜交，于雜交后30 120天之內視果實的生長狀況采集雜交果實進行胚挽救，胚挽救獲得的雜種胚不定芽擴繁至100株以上再進行結球培養，當籽球圍徑生長到3 4cm左右時，出瓶春化處理40 60天，然后把籽球栽培到溫室中連續生長2年，冬季不挖種球，到第5年時，百合雜種后代即形成一個有100株以上個體的正常開花無性系群體。上述雜種胚無性系群體由于在雜種胚不定芽同步擴繁及溫室栽培冬季不起球兩個環節的共同處理下，形成雜種無性系的時間大大縮短，只需5年即可獲得一個性狀穩定可靠的雜種無性系。上述方法的具體步驟如下
A、切去母本百合花柱上部連接柱頭，保留子房以上O.5 Icm的部分，把父本新鮮花粉涂抹于切口處進行授粉；
B、經步驟A授粉后30 120天內，當果實發育停止或緩慢時，采下由子房發育而成的百合蒴果；
C、將步驟B所得百合蒴果進行消毒清洗；
D、從步驟C處理的蒴果中取出種子，擠出幼胚，接種到MS+NAA(0.01 O. 05)mg/L、pH=5. 8的培養基上，在培養溫度為20 25°C，光照強度為2000 5000Lx，光照時間8 12小時/天的條件下，培養30 80天，得到幼苗；E、將步驟D 的幼苗轉接至Ij MS+BA (O. 5 l)mg/L+NAA(0. I O. 5)mg/L、pH=5. 8 的培養基上，在與D步驟相同的培養條件下，進行不定芽群體同步增殖培養，直至不定芽增殖數量達到100株以上，得植株；
F、將步驟E所得植株從基部切下，轉至MS+IBA(0.5 l)mg/L、pH=5. 8 6. O的培養基上，在溫度為18 25°C、避光、全黑暗條件下，進行結球和生根培養150 180天，取出、清洗后，于4 8°C下進行40 60天的低溫春化，得到籽球；
G、將步驟F的籽球于當年8月份栽培到溫室土壤中，按常規管理，連續越二個冬季，在第三個冬季來臨前挖出種球，即獲得有上百株個體的開花無性系群體。所述步驟C的消毒清洗是用體積濃度為70 75%的酒精擦拭百合蒴果表面三次，再用體積濃度為70 75%的酒精浸泡I分鐘，然后在質量濃度為O. 1%的升汞溶液中浸泡15分鐘，最后用無菌水清洗二次。本發明與現有技術相比具有下列優點和效果采用上述方案，可使百合雜種后代無性系群體的獲得年限大大縮短，由11年減少至3年，加快了百合育種速度，提高了培育百合新品種的效率，本發明流程簡單，對于百合遠緣雜交后代的獲得及雜種無性系群體的快速創制具有明顯的效果。另外，克服了假雜種(即由子房壁、種皮等部位長出的不定芽)出現的可能，確保了雜種的真實性,且群體種球的生長較整齊,群體內各個植株的性狀表現一致性較好，能夠滿足百合新品種申報時對一致性和穩定性的要求。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步說明。實施例I
A、將母本東方百合‘Sorbonne’的花柱用刀片切去上部連接柱頭的部分，保留子房以上
O.5cm的部分，把父本‘蘭州百合’的新鮮花粉涂抹于切口處進行授粉，再用錫箔紙包裹住切Π ；
B、步驟A授粉后90天內，當果實發育停止且開始萎縮時，采下由子房發育而成的百合菊果；
C、將步驟B所得百合蒴果用體積濃度為75%的酒精擦拭果實表面3次，再用體積濃度為75%的酒精浸泡I分鐘，然后在質量濃度為O. 1%的升汞溶液中處理15分鐘，最后用無菌·水清洗2次；
D、將經過步驟C處理的百合蒴果剖開，撿出有胚種子并在解剖鏡下用鑷子尖撕去種皮，在胚乳上輕劃一下，擠壓出白色半透明狀的幼胚，接種到MS+NAAO. 01mg/L、pH=5. 8的培養基上，在培養溫度為25°C，光照強度為2000Lx，光照時間12小時/天的條件下，培養4天，得到幼苗；
E、將步驟D的幼苗轉接到MS+BAlmg/L+NAAO.3mg/L、pH=5. 8的培養基上，在與D步驟相同的培養條件下，進行不定芽群體同步增殖培養138天，使不定芽增殖數量達到100株以上，得植株；
F、將步驟E中得到的植株從基部切下后轉至MS+IBAO.8mg/L、pH=6. O的培養基上，在溫度為18°C、避光、全黑暗條件下，進行結球和生根培養150天，待籽球圍徑達到3 4cm時，進行清洗后置于溫度5°C下，經40天的低溫春化，得到籽球；G、將步驟F的籽球于當年8月份栽培到溫室土壤中，按常規管理，連續越二個冬季，在第三個冬季來臨前挖出種球，即獲得有上百株個體的開花無性系群體。實施例2
A、將母本東方百合‘CasaBlanca’的花柱用刀片切去上部連接柱頭的部分，保留子房以上O. 8cm的部分，把父本亞洲百合‘Brunello’的新鮮花粉涂抹于切口處進行授粉，再用錫箔紙包裹住切口；
B、步驟A授粉后57天內，當果實發育緩慢開始發黃時，采下由子房發育而成的百合蒴
果;
C、將步驟B所得百合蒴果用體積濃度為72%的酒精擦拭果實表面3次，再用體積濃度為72%的酒精浸泡I分鐘，然后在質量濃度為O. 1%的升汞溶液中處理15分鐘，最后用無菌 水清洗2次；
D、將經過步驟C處理的百合蒴果剖開，撿出有胚種子并在解剖鏡下用鑷子尖撕去種皮，在胚乳上輕劃一下，擠壓出白色半透明狀的幼胚，接種到MS+NAA0. 02 mg/L、pH=5. 8的培養基上，在培養溫度為20°C，光照強度為3000Lx，光照時間10小時/天的條件下，培養45天，得到幼苗；
E、將步驟D的幼苗轉接到MS+BAO.5mg/L+NAA0. lmg/L、pH=5. 8的培養基上，在與D步驟相同的培養條件下，進行不定芽群體同步增殖培養160天，直至不定芽增殖數量達到100株以上，得植株；
F、將步驟E中得到的植株從基部切下后轉至MS+IBAlmg/L、pH=5.8的培養基上，在溫度為20°C、避光、全黑暗條件下，進行結球和生根培養165天，待籽球圍徑達到4cm時，進行清洗后置于溫度4°C下經60天的低溫春化，得到籽球；
G、將步驟F的籽球于當年8月份栽培到溫室土壤中，按常規管理，連續越二個冬季，在第三個冬季來臨前挖出種球，即獲得有上百株個體的開花無性系群體。實施例3
A、將母本OT百合‘Manissa’的花柱用刀片切去上部連接柱頭的部分，保留子房以上Icm的部分，把父本東方百合‘Bernini’的新鮮花粉涂抹于切口處進行授粉，再用錫箔紙包裹住切口 ；
B、步驟A授粉后30天內，當果實發育緩慢時，采下由子房發育而成的百合蒴果；
C、將步驟B所得百合蒴果用體積濃度為70%的酒精擦拭果實表面3次，再用體積濃度為70%的酒精浸泡I分鐘，然后在質量濃度為O. 1%的升汞溶液中處理15分鐘，最后用無菌水清洗2次；
D、將經過步驟C處理的百合蒴果剖開，撿出有胚種子并在解剖鏡下用鑷子尖撕去種皮，在胚乳上輕劃一下，擠壓出白色半透明狀的幼胚，接種到MS+NAA0. 05 mg/L、pH=5. 8的培養基上，在培養溫度為22°C，光照強度為5000Lx，光照時間8小時/天的條件下，培養80天，得到幼苗；
E、將步驟D的幼苗轉接到MS+BAO.8mg/L+NAA0. 5mg/L、pH=5. 8的培養基上，在與D步驟相同的培養條件下，進行不定芽群體同步增殖培養180天，直至不定芽增殖數量達到100株以上，得植株；
F、將步驟E中得到的植株從基部切下后，轉至生根培養基MS+IBA0.5mg/L、pH=5. 9上，在溫度為25°C、避光、全黑暗條件下，進行結球和生根培養180天，待籽球圍徑達到3cm時，進行清洗后置于溫度8°C下經58天的低溫春化，得到籽球；
G、將步驟F的籽球于當年8月份栽培到溫室土壤中，按常規管理，連續越二個冬季，在第三個冬季來臨前挖出種球，即獲得有上百株個體的開花無性系群體。實施例4
A、將母本東方百合‘CasaBlanca’的花柱用刀片切去上部連接柱頭的部分，保留子房以上O. 8cm的部分，把父本亞洲百合‘Brunello’的新鮮花粉涂抹于切口處進行授粉，再用錫箔紙包裹住切口；
B、步驟A授粉后120天內，當果實發育停止時，采下由子房發育而成的百合蒴果；
C、將步驟B所得百合蒴果用體積濃度為75%的酒精擦拭果實表面3次，再用體積濃度為75%的酒精浸泡I分鐘，然后在質量濃度為O. 1%的升汞溶液中處理15分鐘，最后用無菌水清洗2次；
D、將經過步驟C處理的百合蒴果剖開，撿出有胚種子并在解剖鏡下用鑷子尖撕去種皮，在胚乳上輕劃一下，擠壓出白色半透明狀的幼胚，接種到MS+NAA0. 02 mg/L、pH=5. 8的培 養基上，在培養溫度為20°C，光照強度為2000Lx，光照時間12小時/天的條件下，培養45天，得到幼苗；
E、將步驟D的幼苗轉接到MS+BAO.5mg/L+NAA0. lmg/L、pH=5. 8的培養基上，在與D步驟相同的培養條件下，進行不定芽群體同步增殖培養160天，直至不定芽增殖數量達到100株以上，得植株；
F、將步驟E中得到的植株從基部切下后轉至MS+IBAlmg/L、pH=5.8的培養基上，在溫度為23°C、避光、全黑暗條件下，進行結球和生根培養165天，待籽球圍徑達到4cm時，進行清洗后置于溫度4°C下經60天的低溫春化，得到籽球；
G、將步驟F的籽球于當年8月份栽培到溫室土壤中，按常規管理，連續越二個冬季，在第三個冬季來臨前挖出種球，即獲得有上百株個體的開花無性系群體。以下通過具體實驗闡述本發明。I、將相同的百合雜交組合(母本均為OT百合‘Manissa’，父本均為東方百合‘Bernini ’ )分為A、B兩組，A、B兩組的授粉方法都采用同樣的切割柱頭授粉法；
2、A組用本發明的方法構建百合雜交后代無性系群體，共用時5年，獲得的百合雜交后代無性系群體的長勢旺盛，群體開花時間一致，所有的觀賞性狀表現整齊，并能較好地表現出與父母本的差異，具有明顯的花部性狀特異性。3、B組用常規方法構建百合雜交后代無性系群體，共耗時11年，并且會因群體內植株生長速度不相同而導致高矮不一致。4、A組與B兩組相比，獲得的后代無性系群體的時間縮短了 6年。說明本發明的方法對百合雜交后代無性系的構建有較明顯的加快促進作用。根據百合雜交后代的胚挽救方法及不定芽群體的增殖情況看，常規的胚挽救把子房切片或直接剝出未成熟的種子放在培養基上誘導叢生芽，導致出現假雜種的幾率較高，而且是否為假雜種，則需要通過后代單株開花后才能判定。另外常規方法需要每年冬季都挖出種球并進行冷藏，必然縮短了百合在土壤中吸收養分的時間，導致種球生長速度慢，最終使構建無性系群體的時間延長。而本發明利用剝胚胚挽救結合籽球冬季在土壤中自然越冬的做法，經過5年時間就獲得了穩定、可靠的百合雜種無性系群體，這對百合的育種是非常有利的，具有明顯的經 濟利益。
權利要求
1.一種構建百合雜交后代無性系群體的方法，其特征在于經過下列各步驟 A、切去母本百合花柱上部連接柱頭，保留子房以上O.5 Icm的部分，把父本新鮮花粉涂抹于切口處進行授粉； B、經步驟A授粉后30 120天內，當果實發育停止或緩慢時，采下由子房發育而成的百合蒴果； C、將步驟B所得百合蒴果進行消毒清洗； D、從步驟C處理的蒴果中取出種子，擠出幼胚，接種到MS+NAA(0.01 O. 05)mg/L、pH=5. 8的培養基上，在培養溫度為20 25°C，光照強度為2000 5000Lx，光照時間8 12小時/天的條件下，培養30 80天，得到幼苗； E、將步驟D 的幼苗轉接至Ij MS+BA (O. 5 l)mg/L+NAA(0. I O. 5)mg/L、pH=5. 8 的培養基上，在與D步驟相同的培養條件下，進行不定芽群體同步增殖培養，直至不定芽增殖數量達到100株以上，得植株； F、將步驟E所得植株從基部切下，轉至MS+IBA(0.5 l)mg/L、pH=5. 8 6. O的培養基上，在溫度為18 25°C、避光、全黑暗條件下，進行結球和生根培養150 180天，取出、清洗后，于4 8°C下進行40 60天的低溫春化，得到籽球； G、將步驟F的籽球于當年8月份栽培到溫室土壤中，按常規管理，連續越二個冬季，在第三個冬季來臨前挖出種球，即獲得有上百株個體的開花無性系群體。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟C的消毒清洗是用體積濃度為70 75%的酒精擦拭百合蒴果表面三次，再用體積濃度為70 75%的酒精浸泡I分鐘，然后在質量濃度為O. 1%的升汞溶液中浸泡15分鐘，最后用無菌水清洗二次。
全文摘要
本發明提供一種構建百合雜交后代無性系群體的方法，將經過篩選后的百合目標親本經切割柱頭、雜交、采集后，經萌芽、增殖和結球等胚挽救，由一株擴繁至上百株，待籽球生長后進行春化處理，處理結束后籽球栽培到溫室土壤中，連續越二個冬季，在第三個冬季來臨前挖出種球，即獲得有上百株個體的開花無性系群體。采用該方法，年限大大縮短，由十一年減少至五年，加快了百合育種速度，提高了培育百合新品種的效率，本發明流程簡單，對于百合遠緣雜交后代的獲得及雜種無性系群體的快速創制具有明顯的效果，群體內各個植株的性狀表現一致性較好。
文檔編號A01H1/02GK102907313SQ201210432709
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月3日 優先權日2012年11月3日
發明者崔光芬, 吳麗芳, 王祥寧, 王繼華, 賈文杰, 段青, 唐開學, 馬璐琳, 張藝萍 申請人:云南省農業科學院花卉研究所