專利名稱：甘藍型油菜BnPABP3啟動子的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程和生物技術領域。具體涉及一種甘藍型油菜&1PABP3啟動子(命名為PBnPABP3，以下相同)，同時還涉及一種甘藍型油菜&1PABP3啟動子的制備方法。 本發明還涉及含有該啟動子或其同源核苷酸序列的載體和涉及利用該啟動子在油菜及其它植物基因工程中的應用。
背景技術：
植物啟動子在基因的表達調控中起著關鍵作用。基因表達調控是多種因素綜合作用的結果。一般按照一個事件的先后順序，基因的調控分為轉錄水平調控、翻譯水平調控以及蛋白質加工水平調控等。基因編碼的蛋白質和RNA及其次級代謝產物對于維持生物體的整個生命活動極其重要。任何基因表達調控的錯誤都會對生命造成嚴重后果。因此，對于基因表達調控的機理研究一直是分子生物學研究的熱點。轉錄水平的調控最為重要。啟動子是轉錄水平調控的重要元件，也是基因工程表達載體的一個重要組成部分。在某種程度上，啟動子決定了基因表達的時空順序以及表達強度。所以，研究啟動子的功能序列對于基因表達調控機制以及日漸成熟的植物基因工程具有非常重要的意義。啟動子在構建能夠高水平表達異源表達載體的過程中起到關鍵作用，它決定了外源基因的轉錄效率和基因的表達水平。植物轉基因育種所用的啟動子可分為組成型和特異型兩類。組成型啟動子驅動的外源基因在轉基因植株的所有發育時期和組織中穩定表達。對許多雙子葉植物的轉化，通常都使用含花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子或胭脂氨酸合成酶nos啟動子的質粒載體，而在單子葉植物轉化中最常用的是含有水稻肌動蛋白Act啟動子，玉米泛素Ubi啟動子及35S啟動子的質粒載體(關麗英等，轉基因植物中外源基因的有效表達及其安全評價。首都師范大學學報。2002,23( :52-56)。但是很多時候外源基因在受體植物中的持續高效表達不僅造成生物體內能源的浪費，而且在所有組織中的表達有可能對植株本身具有毒害作用，甚至引起轉基因安全問題(Jia S-R. Environment and food biosafty assessment of transgenic plants. Advanced of Bioengineer. 1997,17(6) :37-42 ；Morris S H,Adley C. C. Irish public perceptions and attitudes to modern biotechnology :an overview with a focus on GM foods. Trends in Biotechnology, 2001,19(2) :43-48)。因此，誘導型啟動子和組織特異性啟動子的研究和應用日益受到育種工作者的重視。在轉基因植物中鑒定的誘導型啟動子包括熱激啟動子，來源于菠菜硝酸還原酶的誘導型啟動子等(關麗英等，轉基因植物中外源基因的有效表達及其安全評價。首都師范大學學報。2002,23( :52-56)。但是誘導型啟動子的應用也具有一定限制，對受體植物進行的外在條件處理，如熱激，激素處理等可能引起生物體內一系列的生理生化反應而不利于植株的正常生長。而且化學調控系統中用作誘導物的甲基脫S皮質醇(dex，dexamethasone)、雌二醇(estradiol)禾口四環素(tetracycline)者β對生態環境有害，不宜用于生產實踐。而使用植物體內本身的組織特異性啟動子就可以避免這種問題。顯然，外源基因的組織特異性表達必將有效提高轉基因作物的生物安全性。近年來在這方面已經取得很大成就。在不同組織中特異性表達的各類啟動子已不斷得到研究(宋揚等，植物組織特異性啟動子研究。生物技術通報。2007，(4) :21-24).油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計民生具有重要影響。 隨著轉基因技術的成熟，轉基因油菜必然會面臨轉基因安全風險的輿論。用在油菜種子中完全不表達的啟動子來啟動目的基因的表達是解決這個問題的一個可行方法。達到既提高油菜各方面品質，又不引起食用油安全風險的目的。因此，本發明開發了一個甘藍型油菜內源啟動子。通過熒光定量PCR檢測表明該啟動子驅動的內源基因在植株的根、莖、葉片、花蕾、角果中高量表達。通過檢測報告基因 ⑶S的表達特征證明啟動子驅動的基因在根部、莖部、葉片、花蕾以及角果皮中高量表達而種子中不表達。我們的結果預示著該基因的啟動子在轉基因植物中具有相當的應用前景。

發明內容
本發明的目的是在于提供了一種甘藍型油菜PBnPABP3啟動子，該啟動子的時空表達模式可用于研究基因的表達形式，優點在于，來源于植物內源的組織特異性啟動子能夠精確定位所調控的基因，驅動目的基因在轉基因植物的特定組織或時期表達，避免造成植物自身能源和物質的浪費，提高外源基因在轉基因植物中的表達效率，限制其表達部位。可應用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全轉基因研究。本發明的另一個目的是在于提供了一種甘藍型油菜Pbhpabp3啟動子的制備方法。該方法通過對甘藍型油菜基因組進行基因組步移，獲得甘藍型油菜？__3序列。其優點在于操作簡單，結果穩定可靠。本發明的再一個目的是在于提供了一種含有植物高效表達啟動子的重組載體，其含有所述的啟動子核苷酸序列。該載體大小適合，在植物中易與轉化，所帶有的標記基因 GUS表達強度高，容易檢測。通過這個載體轉化擬南芥可以獲得GUS基因在植物中高效表達的擬南芥轉基因植株。本發明還有一個目的是在于提供了一種甘藍型油菜PBnPABP3啟動子在花藥、花粉粒中的應用。Pbhpabp3的功能能夠反映油菜&1PABP3基因的功能，即在發育過程中具有重要功能；在該啟動子的驅動下，目的基因主要在植株的花藥、花粉粒中精細表達，而種子中完全不表達。這一具有組織特異性表達的啟動子在植物創建不育系、人工創建種質資源等基因工程和轉基因安全(食用、花粉漂流)中具有應用價值。為了實現上述的目的，本發明采用如下技術方案為了獲得本發明，發明人對油菜發育過程中的相關基因進行了深入和全面的研究，結果發現一種新的啟動子。該啟動子驅動的內源基因在植物的花藥、花粉粒中高效表達。根據本發明的一個方面，上述目的可以通過提供一種啟動子來實現，所述啟動子能夠特異性驅動基因在植物中高效表達，所述啟動子含有SEQ ID No. 1核苷酸序列或與SEQ ID No. 1實質上同源的核苷酸序列。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供含有所述啟動子的核苷酸序列的重組載體來實現。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體轉化的微生物來實現。根據本發明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述微生物轉化的轉基因植物來實現。1、一種甘藍型油菜啟動子PBnPABP3的制備方法，其步驟是1. 1ΡΒηΡΑΒΡ3驅動的內源基因的表達模式本發明所用油菜為甘藍型油菜(Brassica napus L.)。供試材料播種于大田，正常
田間管理。從大田生長條件下生長的植株上取根、莖、葉、花蕾，角果每種材料至少取三個重復，每個重復至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮中，_80°C保存。利用Trirol 提取試劑盒的要求進行RNA的提取。熒光定量PCR儀為RTTM-Cycler (博奧生物有限公司)，采用油菜Actin作為內標基因(登錄號 AFl 11812)，Actin 基因引物為 5 ‘ -CTGGAATTGCTGACCGTATGAG-3 ‘ 和 5 ‘ -ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG-3 ‘。PBnPABP3 驅動的內源基因引物為 5 ‘ -GGGAAGATGATAGGAAGGAAA-3'和 5 ‘ -CTGGTGCTCTAATCTGTGAAAA-3‘。熒光定量PCR反應每組實驗均完成三個生物學重復，每個生物學重復至少做三次技術重復。分別檢測？__3驅動的內源基因在油菜組織(根、莖、葉、花、角果)中的表達。用比較Ct法(Δ Δ Ct)計算基因的相對表達量。通過2_Δ 估算目的基因的相對表達量禾口系統誤差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001,Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2_Δ ΔcTMethod. METHODS 25,402-408)。在計算相對表達量時，以花蕾的樣本為參照，即將其值轉換成1 (標準值)，其它樣品再與其比較，獲得相對表達值。1. 2基因組步移克隆PBnPABP3序列利用SDS裂解法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社)提取基因組DNA，按照基因組步移試劑盒(購自Clontech公司，產品代號Cat. No. 638904)操作程序，進行基因組步移。具體步驟為提取基因組DNA 25口1^0.1“8/^0，分別用核酸內切酶0儀I、EcoR V、PvuII和Mu I酶切，純化后加入接頭形成四個不同的基因組DNA庫，用作首次基因組步移第一輪PCR模板，根據目的基因保守序列設計特異性引物GSPl(表幻與基因組步移試劑盒(購自Clontech公司，產品代號Cat. No. 638904)內上游接頭引物API (表幻進行擴增。第二輪PCR以第一輪PCR產物的50倍稀釋液(水稀釋液)為模板，同樣方法設計的特異性引物63 2(表幻和接頭引物々 2(表幻進行擴增，隨后進行第二輪基因組步移。所有PCR反應均為50 μ L擴增體系模板 1 μ L, dNTPs 0. 2mM,引物 0. 5mM, LATaq 酶 1. 25 單位，10XLA-PCMxiffer (含 MgCl2) 5 μ L，補水至 50 μ L。反應條件均為94°C 預變性 Imin ;98°C 10s, 72 °C 6min 7 個循環；98°C 10s，67°C 6min 33個循環；72 °C延伸lOmin。PCR產物經1.0% (質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技北京有限公司，以下相同)純化回收后，連接到PMD18-T載體(購自TaKaRa公司，以下相同)，轉化gold菌株 (購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)的感受態細胞，挑取陽性克隆，酶切驗證后測序，得到目的基因上游的側翼序列，此序列包括Pbhpabp3驅動的內源基因的起始密碼子至 GSP2之間的區段和該基因的啟動子序列。根據獲得的序列，設計擴增啟動子區域片段的弓丨物 PBnFABp3S 5 ‘ -CAGAAGCTT (HindiII) AATTAAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-3 ‘和 PBnFABP3A 5' -GACATCTAGA(XbalI)GCTCGTGCGTTTACCTTTTTAGAGAA-3 ‘，以基因組 DNA 為模板，進行 PCR擴增。所有引物的5'端含有Hind III酶切位點，3'端含有)(ba I酶切位點。反應體系為 25 μ L 內含IXPCR buffer, MgCI 1. 5mmol/L，dNTPO. 2mmol/L(毫摩爾每升)、引物濃度為0. 5mol/L, Pfu酶1. 5單位，模板約lOOng，根據具體情況設置循環參數。PCR產物經 1.0% (質量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠檢測，凝膠回收試劑盒回收各目的缺失片段。 按各回收的缺失片段載體(0.3pmol缺失片段0. Ipmol載體片段)=3 1的比例混合樣品，加入T4DNA連接酶5單位，1 X反應緩沖液，無菌水補充體積至25ml，16°C過夜連接反應。凍融法轉化大腸桿菌gold菌(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社，96-99)感受態細胞中。涂布于含有氨芐青霉素50 μ g/mL的 LB固體培養基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859 X 104Pa 下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)平板上，37°C培養過夜，各挑選白斑三個，做菌落PCR 檢測(反應體系為 25 μ L 內含=IXPCR buffer.，MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L〔毫摩爾每升〕、引物濃度為0. 5mol/L, Pfu酶1. 5單位，用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版， 根據具體情況設置循環參數)，將陽性重組子接種于含氨芐青霉素50 μ g/mL的液體LB培養基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121°C，6. 859X 1041 下高壓消毒15分鐘。4°C冷藏備用)，37°C下200r/min振蕩培養過夜，小量堿法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學出版社)提取質粒，Hind IIIAba I 酶切質粒lyg，0.8% (質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測正確的陽性重組克隆， 命名為pMD18-PBnPABP3(將目的片段連入pMDIS-T載體構建而成，以下相同)，為了確保載體中啟動子的序列信息，以 Ml3F/M13R 為引物(Ml3 F5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，； M13R5，-GTAAAACGACGGCCAGT-3，)，將 pMD18-PBnFABP3 進行序列測定，分析結果，獲得了 PBnFABP3 其序列為SEQ ID NO 1所示核苷酸序列。1. 3啟動子序列生物信息學分析將所克隆序列用BLASTN(http://www. . ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)進行同源比對。啟動子核心元件和上游順式作用元件用啟動子預測軟件http://WWW. fruitfly. org/ seq—tools/promoter. html 禾口 PLACE(Higo et al. , Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database (J). Nucleic Acids Research. 1999,27 297 300)http:// www. dna. affrc. go. jp/PLACE/進行預測。得到可能的核心啟動子序列和上游啟動子元件。2、一種甘藍型油菜啟動子Pbhpabp3在轉基因植株的花藥、花粉粒中的應用，其步驟是2. 1ΡΒηΡΑΒΡ3植物表達載體的構建和根癌農桿菌菌株EHA105(購于上海滬尚生物科技有限公司以下相同)的轉化構建的重組載體是將質粒pBI121 (購自TaKaRa公司)上的35S啟動子用技術方案1中克隆得到？__3片段替換而來。為完成此目的，首先用》^ I/Hind III雙酶切克隆載體 pMD18-PBnPABp3 的啟動子片段，同時用 Xba I/Hind III 酶切 pBI121 (Chen, P. Y.，Wang， C. K. , Soong, S.C. To, K. Y. Complete sequence of the binary vector pBI121 and itsapplication in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Mol. Breed. 11, 287-293)質粒。酶切反應在37度培養箱中進行，約4-6個小時之后，用(質量體積比。 以下相同)瓊脂糖膠電泳檢測。將克隆載體PMDIS-Pbiipabp3酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按pMD18-PBnPABP3酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段(150ng小失片段50ng大片段)=3 1 的比例(摩爾濃度比)混合樣品，加入T4 DNA連接酶5單位，IOX反應緩沖液，無菌水補充體積至20 μ L，16°C連接過夜。轉化后，在含有卡那霉素(50 μ g/mL)的固體LB培養基平板上篩選，挑斑做菌落PCR，以及提質粒，經酶切驗證正確的重組質粒命名為pBI-PBnPAEP3。利用凍融法(步驟如下1 取0. 2ml感受態農桿菌，于冰水中緩慢融化。2 加入約2 μ g重組質粒 DNA,輕輕混勻，冰浴30min后，投入液氮速凍lmin，然后37°C水浴5min，融化細胞。3 加入 800μ 1不含抗生素YEP液體培養基，28°C輕搖培養4-5h。4 :12000rpm，30s，去上清，細胞重懸于0. 2mlYEP培養基。5 將培養物均勻涂布在含Rif (50mg/L)，Str (50mg/L)和Kan (50mg/ L)的瓊脂板上培養2天，待平板上出現轉化子后挑菌檢測)將pBI-PBnPAEP3轉入根癌農桿菌EHA105(購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)，用卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)雙抗性平板篩選，挑斑，菌落PCR檢測驗證。2. 2PBnPABP3 的功能分析2. 2. 1ΡΒηΡΑΒΡ3植物表達載體PBI-Pbiipabp3在擬南芥中的遺傳轉化及轉基因植株篩選參照文獻中的方法進行擬南芥轉化Oiang X. R. et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature,2006, 1:1-6)。制備含有構建好載體的根癌農桿菌EHA105(前面已述)菌液，在轉化前一天轉入含有卡那霉素50yg/ml、利福平50yg/ml的LB液體培養基中，28°C過夜培養。第二天，用紫外分光光度計(SPEK0L 1300)于276nm納米波長下檢測菌液的吸光值，當菌液的吸光值達到在1.6-2.0之間時取出。室溫00-25°C，以下相同)以4000g離心lOmin，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%蔗糖(質量體積比)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養皿中，轉化前加入終濃度為0.02% (體積比)的Silwet 1-77(購自北京五洲元業科貿中心，以下相同)。混勻后把待轉化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數15秒，取出植株。轉化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養。第二天將塑料袋揭開，放在光強的地方培養。隔一周再做一次轉化。培養一個月左右收獲種子，種子在培養箱或者日光下干燥3-5 天。將轉化收獲的TO代種子用70% (體積比)酒精和0.01% (質量比)的升汞分別表面消毒3分鐘和10分鐘，然后用蒸餾水洗滌數次(5 7次)，然后均勻地吹打到MS固體篩選培養基(MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液IOml ；MS有機母液IOml ；MS鐵鹽IOml ； 肌醇IOml ；蔗糖30g ；用IM NaOH調PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入8g瓊脂粉可配置成固體培養基。各種母液配方見表1)表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養箱(光周期16 (白天)/8 (黑暗)小時，溫度白天22°C，暗周期20°C )培養。根據表達載體上所特有的卡那霉素抗性篩選陽性苗。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片，提取DNA，進行PCR陽性檢測(反應體系為25 μ L內含IXPCR buffer.，MgCI 1. 5mmol/L, dNTP 0. 2mmol/L (毫摩爾每升)、引物濃度為0. 5mol/L，Pfu酶1. 5單位，模板約 lOOng，根據具體情況設置循環參數)，結果表明獲得了轉基因陽性苗。表IMS培養基母液配方
權利要求
1.一種分離的啟動子/7^ra，其序列為SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的一種分離的啟動子，其特征在于所述的啟動子含有重組載體 pBI-Aum。
3.權利要求1所述的一種甘藍型油啟動子的制備方法，其步驟是A、油菜啟動子引物設計利用SDS裂解法提取油菜DNA，按照基因組步移試劑盒操作程序，進行基因組步移，步移進行兩輪PCR擴增，克隆獲得油菜ΡΒηΡΑΒΡ3，步移所用引物是APl 5' - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3' ；GSPl 5' - TTGATCAGCCGCAACCACTGGAGATTG -3，；ΑΡ2 5' - ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3，；GSP2 5' - TGATCAATCATTGTCGACGGTGCAACCC -3，；B、甘藍型油菜啟動子制備是根據基因組步移試劑盒說明，取5μ 1 DNA用々ra I酶切，檢測其純度，體系如下DNA 5 μ 1, Dra I 1. 6 μ 1, IOXbuffer 2 μ 1，無菌水補齊至 20 μ 1，37°C，過夜，用 1 %質量體積比瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，分別用產生平末端的限制性內切酶々raljcoTtYIraII 和StoI在100 μ 1體系內酶切2. 5μ g的基因組DNA，四種限制性內切酶的反應體系如下 DNA 2.5 yg ,限制性內切酶 8 μ 1, IOXbuffer 10 μ 1，無菌水補齊至 100 μ 1,37°C 過夜，酶切完成后純化，純化步驟如下向酶切液中加入10 μ 1的3Μ NaOAc和50 μ 1的 95%體積比乙醇，-20°C下沉淀3小時，然后12000rpm離心15分鐘，70%體積比乙醇洗滌兩遍，12000 rpm離心5分鐘，室溫下晾干，用20 μ 1無菌水溶解，純化完成后加入特異性接頭，反應體系如下10XT4 ligase buffer 2.0 μ 1，上述酶切處理的DNA 8.0 μ 1，Τ4 Iigase 1 μ 1，特異性接頭14.0 μ 1，無菌水補至20 μ 1，16°C過夜，將連接液用雙蒸水稀釋10倍，保存于-20°C，建立了四個經限制性內切酶處理并連有特異性接頭的DNA庫，以其為模板進行兩輪PCR反應，第一輪PCR反應以GSPl和APl為引物，體系如下10 Xbuffer 5 μ l,dNTPs mixture 1.0 μ 1，GSPl 2.5 μ Ι,ΑΡΙ 2.5 μ l,Taq 酶 0· 2 μ 1，稀釋的DNA庫 0. 1μ 1，無菌水補至50μ 1，反應程序如下94°C Imin ；98°C IOs，72°C 2min，共7個循環； 980C 10s，68°C 2min，共33個循環；72°C lOmin，第二輪PCR以第一輪PCR反應產物50倍稀釋液做為模板，以GSP2和AP2為引物進行擴增，反應體系如下=IOXbuffer 5 μ 1，dNTPs mixture 1. O μ 1,GSP2 2.5 μ 1, AP2 2.5 μ 1, Taq 酶 0· 2 μ 1，稀釋模板溶液 1.0 μ 1， 無菌水補至50 μ 1，反應程序同第一輪PCR，完成后回收純化第二輪PCR產物，并與T載體連接，經測序獲得P臓ΒΡ3全長序列。
4.權利要求書1所述的一種分離的啟動子在花藥中的應用。
5.權利要求書1所述的一種分離的啟動子在花粉粒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種甘藍型油菜BnPABP3啟動子(PBnPABP3)啟動子的制備方法及其應用。利用基因組步移方法克隆PBnPABP3序列應用SDS裂解法提取基因組DNA，在不同體系中，分別用核酸內切酶DraI、EcoRⅤ、PvuII和StuI酶切DNA，和接頭片斷連接后，以其為模板進行第一輪PCR擴增，第二輪PCR以第一輪PCR產物的50倍稀釋液為模板進行擴增，獲得PBnPABP3。PBnPABP3在植物花藥、花粉粒中的應用。該啟動子具有驅動外源基因表達的功能，其表達部位在植物的花藥、花粉粒中，在油菜食用油安全性和提高作物品質方面，人工創建不育系、恢復系，豐富種質資源等方面，該啟動子具有應用潛力。
文檔編號C12N15/113GK102220325SQ20111012210
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月12日 優先權日2011年5月12日
發明者劉勝毅, 劉越英, 石磊, 董彩華, 黃軍艷 申請人:中國農業科學院油料作物研究所