專利名稱：一種促進冷凍胚胎解凍后體外發育的培養液的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業-畜牧獸醫領域，具體地說，涉及一種促進冷凍胚胎解凍后體外發育的培養液。
背景技術：
胚胎冷凍是長期保存動物種質資源的一項實用技術。胚胎冷凍技術的發展和應用減少了時間和空間對胚胎操作造成的限制，并可有效避免因家畜的活體運輸所造成的疾病傳播。自Rail和Fahyl985年報道玻璃化冷凍方法以來，該法因不需要昂貴的冷凍設備、操作簡便、冷凍過程短，而受到廣泛的重視，得到迅速的發展。玻璃化冷凍法是利用高濃度冷凍保護劑在快速降溫過程中形成的玻璃態，有效地避免冷凍過程中有害冰晶的形成，從而使胚胎避免所受的物理性傷害1997年，Vajta等報道，用OPS法(open pulled straw，開放式拉長麥管)玻璃化冷凍牛體外生產胚胎獲得成功。在小鼠原核胚、2-細胞胚胎、4-細胞胚胎、桑椹胚、囊胚、孵化囊胚、轉基因胚胎及其他大家畜胚胎的冷凍保存上都得到了廣泛的應用。隨后又有多種可提高冷凍降溫速度的冷凍載體被相繼用于胚胎的冷凍保存，使冷凍降溫速度大大提高，冷凍損傷得以減少。但玻璃化冷凍法所用的高濃度冷凍保護劑對胚胎的化學毒害作用很大，雖然有個例報道復蘇后僅剩1個卵裂球存活的胚胎移植后也獲得了妊娠，但通常認為超過50%卵裂球損傷的胚胎為死亡胚胎，其發育潛能差、著床率約為 1 %。著床率降低的原因可能是損傷后的卵裂球分解代謝產生某些毒性物質，不利于胚胎發育。因此，研究者迄今仍在不斷探索冷凍后解凍胚胎體外培養或移植時胚胎質量提高的方法。褪黑素(Melatonin，MT)是主要由動物松果體分泌的一種吲哚類神經內分泌激素，具有調節生長和繁殖等多方面的生理功能。近年來研究報道表明，MT可以促進卵母細胞的體外成熟和胚胎的體外發育。例如，MT濃度在10_6 10_4mol/L時，能顯著增加小鼠的體外受精率(27.6% vs 43. 9%或40. 4% )，在10_8 10_6mol/L時，可提高胚胎發育到4-細胞胚(16. Ovs 26. 7% )、8_ 細胞胚(12. Ivs. 25. 8 或 23. 5% )和囊胚的比率(8. 9vs 23. 5 或17. 5% MIshizuka等，2000)。常規慢速(細管)冷凍綿羊桑椹胚解凍后在含有MT的發育液中培養Mh，囊胚的孵化率增加，胚胎的退化率降低(Abecia等，200 。另外，在牛胚胎的體外發育液中添加MT的試驗組囊胚發育率68. 85% (42/61)顯著高于對照組50. 79% (32/63) (Papis等，2007)；在豬的卵母細胞體外成熟和孤雌激活胚胎體外發育的研究中也發現，培養液中添加10_9mOl/LMT顯著增加胚胎的卵裂率和囊胚細胞數，囊胚率沒有顯著提高(N.Rodriguez-Osorio等，2007) ； 10ng/mL MT能顯著提高豬卵母細胞體外成熟過程中極體的排出率(84.6% vs75.6% )和孤雌激活后胚胎發育到囊胚的比率，但對卵裂率和囊胚細胞數的影響不顯著(Jung-Teak Kang等，2008)。這些研究說明在不同時期的培養液中添加MT對卵母細胞的體外成熟和胚胎的體外發育都有積極的影響
發明內容
本發明的目的是提供一種促進OPS法玻璃化冷凍胚胎解凍后體外發育的培養液。為了實現本發明目的，本發明的一種促進冷凍胚胎解凍后體外發育的培養液，所述培養液的配方見表1 表1培養液配方
權利要求
1. 一種促進冷凍胚胎解凍后體外發育的培養液，其特征在于，所述培養液的配方見下表
2.根據權利要求1所述的培養液，其特征在于，所述培養液的配方見下表
3.根據權利要求1或2所述的培養液，其特征在于，褪黑素的濃度為10_9 10_7mol/L。
4.根據權利要求3所述的培養液，其特征在于，褪黑素的濃度為10_9mOl/L。
5.權利要求1-4任一項所述的培養液在促進冷凍胚胎解凍后體外發育中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，其是將冷凍胚胎解凍后在權利要求1-4任一項所述的培養液中進行培養，體外發育成囊胚。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于，培養時間為90 96h。
8.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于，所述胚胎為2-細胞胚胎。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述2-細胞胚胎為OPS冷凍后的哺乳動物胚胎。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述2-細胞胚胎為OPS冷凍后的小鼠胚胎。
全文摘要
本發明提供了一種促進胚胎OPS法玻璃化冷凍解凍后體外發育的培養液，其是將冷凍2-細胞胚胎解凍后在含10-9mol/L褪黑素(MT)的培養液中進行培養，提高了胚胎的囊胚發育率、增加胚胎內細胞數，從而提高胚胎的質量，并為進一步開展家畜胚胎的OPS冷凍保存研究提供有益的參考。
文檔編號C12N5/073GK102250832SQ20111014247
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月30日 優先權日2011年5月30日
發明者劉國世, 史文清, 張洪海, 朱士恩, 田秀芝 申請人:中國農業大學