專利名稱：同步檢測spfmv、spvc、spvg和spv2的方法
技術領域：
本發明涉及一種同步檢測SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，屬植物保護領域。
背景技術：
甘薯是世界第七大糧食作物，也是發展中國家繼水稻、小麥、玉米和木薯后的第五大糧食作物，年產量達1億2700萬噸，中國是世界最大甘薯生產國，年產量占世界的 82.7%。甘薯主要靠秧蔓、薯塊進行無性繁殖，極易造成病毒的傳播和積累。病毒病是繼甘薯小象甲后對甘薯生產為害最大的限制性因素之一，每年因病毒侵染造成的甘薯減產高達 30%-50%，中國每年因甘薯病毒病造成的損失高達40億元。據報道侵染甘薯的病毒有20 多種，其中甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)、甘薯C病毒(Sweet potato virus C, SPVC)、甘暮 G 病毒(Sweetpotato virus G, SPVG)禾口甘暮病毒2(Sweetp0tat0 virus 2，SPV2)等四種病毒為甘薯上經常發生的馬鈴薯Y病毒屬成員。 SPFMV幾乎在世界甘薯產區都有發現，常造成甘薯產生褪綠斑或沿葉脈形成紫色羽狀斑紋， SPFMV的RC株系可在某些甘薯品種表面或內部形成褐色龜裂或木栓化，而0株系的癥狀較輕。SPVC過去被認為是SPFMV的C株系，最近的研究表明該株系應該是一個獨立的種，其單獨侵染甘薯不產生明顯癥狀。SPVG最早于中國被發現，目前幾乎在中國甘薯產區都有為害，而SPV2(有的稱為SPVY或IVMV)自臺灣首次發現后，也逐漸在很多國家被報道，SPVG 和SPV2單獨侵染甘薯也往往不產生明顯癥狀。然而，這些病毒在田間往往復合侵染，常造成甘薯產量降低、品質變劣和種性退化，進一步加重了對甘薯的危害。迄今，國內外尚無特別有效的植物病毒病防治藥劑，因此加強甘薯病毒檢測尤其是對四種主要病毒的檢測和監測，對于準確診斷病害和防止病毒的傳播流行具有重要的現實意義，是生產上對甘薯病毒病進行綜合治理的重要措施之一。通常檢測甘薯病毒的方法有鑒別寄主法、電鏡技術、血清學技術和分子生物學技術等。鑒別寄主法中往往將病組織摩擦接種或嫁接至指示植物巴西牽牛(Ipomoeasetosa) 上，而且常常要復合接種甘薯褪綠矮縮病毒(SPCSV)，通過SPCSV的協生作用來觀察待測病毒的癥狀反應，檢測周期長、靈敏度低，還受到季節、環境以及病毒種類等方面的影響，因此已經很少用于甘薯病毒的檢測。由于電鏡技術僅能觀察到病毒的粒體形態，很難準確鑒定出病毒種類，而且設備昂貴，不適合作為甘薯病毒檢測的普通方法。目前應用最為廣泛的甘薯病毒檢測方法是酶聯免疫吸附法(ELISA)和分子生物學技術。ELISA方法檢測周期較短，靈敏度高，一次可以對大規模樣品進行檢測，然而由于SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2在系統進化上關系非常近，具有部分血清學交叉反應，往往造成對一些病毒的漏檢或誤檢。分子生物學技術，尤其是RT-PCR技術不但操作簡單，而且特異性、靈敏度較ELISA方法高，但普通RT-PCR方法每次只能檢測一種病毒，對于多種病毒復合侵染的情況，則需要針對每種病毒進行單獨檢測，工作量大，效率不高。此外，通常的RT-PCR檢測前都需要使用價格昂貴的 RNA提取試劑提取病組織總RNA，導致檢測成本偏高。現有的很多植物病毒多重RT-PCR檢測技術中，每一種病毒均需要一對檢測引物，增加了引物間相互作用的概率，往往容易導致假陰性和非特異性，影響了檢測結果的準確性。 申請號為200810049503. 2的專利公開了一種能同時檢測甘薯潛隱病毒(SPLV)、 SPVG和SPFMV三種甘薯病毒的多重RT-PCR檢測方法，由于SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2在系統進化上關系非常近，該方法設計的引物無法區分SPFMV和SPVC，而且其中的引物SEQ6既能與SPVG的基因組RNA結合也能與SPV2的基因組RNA結合。

發明內容
本發明克服了現有技術在檢測多種病毒復合侵染甘薯時的不足，提供了一種高效、靈敏、特異且低成本的檢測甘薯上發生的SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2四種病毒的方法。本發明的技術方案為(1)引物設計合成(a)設計合成檢測SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的通用反向引物SPFCG^ 5，-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3，，R = A 或 G，Y = C 或 T;(b)分別設計合成檢測SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的正向引物SPFF、SPCF、SPGF和 SP2F，引物序列如下 SPFF:5'-GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3'
SPCF:5'-GTGAGAAAYCTATGCGCTCTGTT-3',
SPGF:5'-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG-3',SP2F:5'-CGTACATTGAAAAGAGAAAACAGGATA-3',其中，Y=C或T；
權利要求
1. 一種同步檢測SPFMV、SPVC, SPVG和SPV2的方法，其步驟為 (1)引物設計合成(a)設計合成檢測SPFMV、SPVC,SPVG和SPV2的通用反向引物SPFCG2R 5，-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3，，R = A 或 G，Y = C 或 T;(b)分別設計合成檢測SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的正向引物SPFF、SPCF、SPGF和SP2F，引物序列如下SPFF:5，--GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3’，SPCF:5，--GTGAGAAAYCTATGCGCTCTGTT-3’，SPGF:5，--GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG-3’，SP2F:5，--CGTACATTGAAAAGAGAAACAGGATA-3',其中，Y =C或 T ；(c)每對引物擴增片段大小及待測病毒為
2.根據權利要求1所述的同步檢測SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其特征在于， 所述CTAB法提取感病植物組織的總核酸為將3 5片病葉疊加在一起，稱取IOOmg左右至研缽中，加入 1.2mL CTAB 緩沖液 CTAB,2 % PVP-40, IOOmMTris-HCl, pH 8.0，1.4麗aCl，20mMEDTA，0. 2%巰基乙醇)；充分研磨后，轉入1. 5mL離心管中，65°C溫浴15 60min ； 13000r/min離心15min，取750μ L上清至一新的1. 5mL離心管，加入等體積氯仿/ 異戊醇(24 1)，渦旋震蕩混勻30s ； 13000r/min離心IOmin,小心轉移600 μ L上清液至一新的1. 5mL離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置lOmin， 13000r/min離心15min，小心地用微量移液器吸出上清；沉淀加入500yL 70%乙醇， 13000r/min離心lOmin，小心地用微量移液器吸出上清，室溫下自然干燥沉淀10 15min ； 加入100 μ L 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)并置于冰上lOmin，用微量移液器反復吹打液體使沉淀充分溶解，-20°C保存備用，也可以將所獲得的總核酸以干粉狀態放入_86°C進行長期保存。
3.根據權利要求1所述的同步檢測SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其特征在于， 所述一步法RT-PCR的反應體系為20 μ L,包括IOyL 2 X Reaction mix (含0. 4mM各dNTP， 、2.4mM MgSO4 的 buffer)、2 μ L 10 μ M 引物 SPFF、0. 4 μ L 10 μ M 引物 SPCF、2. 5 μ L 10 μ M 弓丨物 SPGF、0. 2 μ L 10 μ M 弓丨物 SP2F、2 μ L 10 μ M 弓丨物 SPFCG2R、0. 7 μ L ddH20、l μ L RNA 模板和 1.2yL Enzyme mix (含 Superscript III RT 及 Platinum Taq High Fidelity)。
4.根據權利要求1所述的同步檢測SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其特征在于，所述一步法 RT-PCR 的反應條件為50°C反轉錄 30min，94°C 2min，94°C 30s,60°C 30s、65 68 °C 1 3min，擴增30個循環，72 °C延伸5min后4°C保存。
全文摘要
本發明涉及一種同步檢測SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，屬植物保護領域。通過分別設計合成SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2特異性的正向引物和四種病毒的通用反向引物，CTAB法提取病組織總核酸，采用一步法四重RT-PCR，達到對這四種病毒的同步檢測。所設計的引物特異性強，且四種病毒共用一條反向引物，顯著減少了引物間的相互作用。將CTAB法應用到RNA病毒侵染植物組織的核酸提取中，既能保證RNA質量，又有效降低了檢測成本。反轉錄與多重PCR一步完成，節約了檢測時間。本發明具有快速、高效、特異性強、靈敏度高和成本低廉等優點，能一次實現四種甘薯病毒的同步檢測，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/70GK102230027SQ20111015672
公開日2011年11月2日 申請日期2011年6月10日 優先權日2011年6月10日
發明者包改麗, 左瑞娟, 李凡, 王海寧, 許東林, 譚冠林, 陳海如 申請人:云南農業大學