專利名稱：一種內皮細胞生長因子融合蛋白及其在再生醫學中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，涉及利用基因重組技術制備一種內皮細胞生長因子(VEGF)與免疫球蛋白Fc (Fe)的融合蛋白(VEGF-Fc)，該融合蛋白可作為基質化內皮細胞生長因子用于組織工程、再生醫學相關的細胞大批量擴增及內皮/血管誘導修復等應用研究。
背景技術：
材料的抗凝血及血管化問題一直是組織工程和再生醫學研究中所面臨的瓶頸之一，尤其是對于尺寸超過200 μ m的再生組織，血管化的不足會導致細胞氧氣及營養物質的供應不足進而導致組織內部細胞凋亡1。為了解決這一問題，有專家提出一方面可以在體外移植血管，另一方面可以設計出一種新型生物材料在體內誘導血管再生2。然而，血管內皮細胞的粘附、增殖和生存能力是實現組織血管再生的重要因素。研究表明，細胞外基質可有效調控細胞行為，如細胞的粘附、增殖、遷移、細胞形貌和細胞間的分化。因此，我們通過研究制備可溶性生物信號分子的細胞外基質化，為血管內皮細胞的粘附、生長和增殖構建良好的細胞外微環境。人工細胞外基質通過模擬天然細胞外基質的結構和特性，影響細胞生存和生物學功能。人工細胞外基質來源主要分為三類天然生物大分子(如膠原、海藻酸、透明質酸等)、 化學合成聚合物(如PLA、PGA、PLGA、PEG等)以及近年發展起來的基因重組型細胞外基質 (如基質蛋白結構依賴型融合蛋白、生長因子型融合蛋白和鈣粘素依賴型融合蛋白)。其中， 天然生物大分子以其良好的生物相容性和生物降解性而廣泛用于組織工程領域。然而，這種細胞外基質具有機械性能差，使用過程中不穩定的缺點。化學合成聚合物雖然機械性能強，但其生物相容性差，易弓I起免疫應答反應。與前兩種人工細胞外基質相比，基因重組蛋白型細胞外基質不僅可特異性增強靶細胞與細胞外基質的相互作用，而且可用于構建一種安全、可控的細胞外微環境達到調控細胞的黏附、增殖、遷移等細胞生物學行為的目的。組織工程研究中，VEGF作為促進血管新生的有效特異性活性信號分子，已被廣泛應用于促進新血管的生成3，4。有報道指出，VEGF通過與細胞外受體KDR結合而激活細胞內信號通路，進一步影響內皮細胞的粘附、增殖及其功能表達。近年來，已報道了多種固定、緩慢釋放VEGF以提高其生物學活性的生物材料相關技術。例如①利用材料的肝素化通過生物親和域物理固定并緩釋VEGF，該方法雖可一定程度上避免VEGF的生物降解，提高 VEGF的生物活性，促進內皮細胞的增殖，但這種物理修飾的方法不能定量調控VEGF的固定及其釋放行為1，5；②利用化學鍵合交聯法固定生長因子，其結果均顯示出該方法雖能部分改善VEGF持久促進內皮細胞增殖及血管再生的性能，但在化學反應過程中會有部分生長因子的固有生物學活性喪失6，7;③利用可注射水凝膠包埋而達到生長因子持續釋放的目的，進而起到誘導人血管內皮細胞形成毛細血管的作用。但利用這種方法，生長因子仍然以可溶性狀態存在且其半衰期僅為4小時，VEGF的生物活性仍有待提高。

發明內容
本發明目的是克服現有技術存在的上述不足，針對改善內皮細胞生長微環境的研究，利用基因重組技術，提供一種可基質化的內皮細胞生長因子融合蛋白(即VEGF-Fc融合蛋白)并開發其在再生醫學中的應用。本發明旨在提供含有目的基因(VEGF、Fe)的真核細胞蛋白表達基因質粒，如 pcDNA3. I-VEGF-Fc,以及由所述的基因質粒制得的VEGF-Fc融合蛋白。該融合蛋白不僅提高了生長因子的穩定性，并可作為一種可基質化內皮細胞生長因子提高組織工程、再生醫學相關生物材料的內皮細胞特異親和性，改善材料快速誘導內皮/血管修復等功能。本發明提供的含有目的基因(VEGF、Fe)的真核細胞表達基因質粒，是采用基因重組PCR技術擴增目的基因VEGF和Fc序列，并分別通過雙酶切連接并嵌入真核細胞表達基因質粒載體(如PCDNA3. 1)中，得到含有雙功能目的基因(VEGF-Fc)片段的真核細胞表達基因質粒。本發明還提供了一種可基質化應用的內皮細胞生長因子融合蛋白(VEGF-FC)，由所述的基因質粒經真核細胞基因轉染、表達及蛋白A親和層析色譜柱分離純化而制得。本發明還提供了一種上述VEGF-Fc融合蛋白做為細胞外基質固定化的內皮細胞生長因子的應用，其通過物理包埋或(/及)疏水作用用于材料本體或(/及)材料表面修飾， 提高材料的親水性，改善材料的生物相容性。其使用濃度范圍為lOng/ml-lOOOng/ml。其中，上述VEGF-Fc融合蛋白通過Fc可在疏水材料表面自組裝分子層的作用，將 VEGF-Fc融合蛋白有序固定于疏水材料表面，實現VEGF的基質化固定，提高材料的內皮細胞特異親和性，促進內皮細胞的黏附、增殖；并可用于普通細胞培養皿表面修飾及大批量擴增VEGF受體陽性表達的內皮細胞。其具體方案如下
(1)將純化后的VEGF-Fc融合蛋白用PBS稀釋至lOng/ml-lOOOng/ml，浸泡疏水性生物材料(如聚苯乙烯培養板)；
(2)在4°C至 37°C，孵育 0. 5-24h.
(3)棄上清，用PBS淋洗1-3遍，除去未穩定固定的融合蛋白VEGF-Fc ；
(4)在疏水性生物材料表面使融合蛋白VEGF-Fc基質化進行內皮細胞培養。通過細胞表面VEGF受體的介導，促進VEGF受體陽性表達細胞與基質化VEGF-Fc 融合蛋白的特異性粘附，改善生物材料的細胞特異親和性，提高其細胞的增殖及分化功能的表達。并可用于促進誘導干細胞向內皮細胞定向分化、快速誘導材料表面內皮化，改善材料的抗凝血性能、提高材料誘導血管新生的能力。
本發明的優點和積極效果
一，本發明利用基因工程原理和技術手段，將內皮細胞生長因子與免疫球蛋白Fc段融合，制備了具有VEGF和Fc雙功能的融合蛋白。二，本發明通過免疫球蛋白Fc片段使VEGF以有活性的二聚體形式存在，一方面提高VEGF的穩定性，另一方面利用Fc段與蛋白質A特異性結合利于融合蛋白的后期純化。三，本發明的融合蛋白通過Fc的可通過疏水作用自組裝形成單分子層，實現疏水材料表面固定修飾，在材料表面形成一種基質化內皮細胞生長因子，提高材料的親水性，改善材料的生物相容性，加強了內皮細胞與材料的特異性相互作用。四，本發明的VEGF-Fc融合蛋白通過基質化固定可以有效的促進內皮細胞的粘附、增殖和分化功能表達，不僅可促進材料的快速內皮化，提高材料抗凝血性能，同時還可促進實現組織工程、再生醫學相關種子細胞的批量擴增。五，本發明的VEGF-Fc融合蛋白提高內皮細胞生長因子的活性，并通過基質化固定可促進干細胞向內皮細胞的定向誘導分化，改善材料的血管新生誘導能力。

圖1是重組質粒構建示意圖2是重組質粒鑒定。①DNA分子標記；②質粒載體PCDNA3. I-Fc (6112bp);③重組質粒 pcDNA3. I-VEGF-Fc 經 BamHI 和 NotI 雙酶切(573bp，6112bp)； 圖3是純化融合蛋白鑒定；
圖4是VEGF-Fc融合蛋白基質化用于細胞培養示意圖； 圖5是VEGF-Fc融合蛋白基質化對內皮細胞粘附的影響；
圖6是VEGF-Fc融合蛋白基質化對內皮細胞增殖的影響。A 培養液中添加VEGF-Fc融合蛋白促進血管內皮細胞增殖；B =VEGF-Fc融合蛋白基質化固定改善其促進內皮細胞增殖的生物活性；
圖7是VEGF-Fc融合蛋白基質化對血管內皮細胞形態的影響(A:聚賴氨酸鋪板；B 聚賴氨酸鋪板培養液中添加生長因子VEGF ；C 聚賴氨酸鋪板培養液中添加VEGF-Fc融合蛋白；D =VEGF-Fc融合蛋白基質化固定鋪板；a’，b’，C’和d’分別是a，b, c和d圖中方框處放大圖)；
具體實施方式
實施例1
本發明研究的基本策略是利用基因重組技術將人血管內皮生長因子和免疫球蛋白Fc 段進行融合，得到含有目的基因(VEGF、Fe)的質粒pcDNA3. I-VEGF-Fc0以pET28A-VEGF質粒為模板，利用合成的引物特異性擴增VEGF基因。1%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，將膠回收PCR產物經BamHl V和AfoiI雙酶切后，插入pcDNA3. 1 BamHl V和NotY位點之間(圖1)。重組表達質粒經BamHI和NotI雙酶切電泳鑒定，顯示切出與目的基因大小一致的DNA片段(573bp)，將此質粒載體命名為pcDNA3. I-VEGF-Fc (圖 2)。實施例2
將實例1構建的含有目的基因的質粒pcDNA3. I-VEGF-Fc轉染293F細胞，收集細胞上清液，利用rProtein A FF柱對VEGF - Fc融合蛋白進行純化。純化的融合蛋白利用抗VEGF 抗體通過免疫印跡檢測，圖中沒有其他非特異性曝光條帶出現，只有一條與預計分子量大小(46KD)相似的條帶。此結果說明，本發明制備得到了 VEGF-Fc融合蛋白(圖3)。將得到的融合蛋白修飾疏水材料表面形成一種內皮細胞生長因子融合蛋白基質用于內皮細胞培養，如示意圖(圖4)所示。
實施例3本發明通過MTT法檢測在不同修飾的聚苯乙烯培養皿表面內皮細胞的黏附情況，進而考察VEGF-Fc融合蛋白基質對內皮細胞粘附的影響。以聚苯乙烯培養板粘附細胞為100%，接近81. 25%的細胞能黏附到VEGF-Fc融合蛋白基質化表面修飾的培養板上；而只有17. 5%的細胞黏附到涂有IgG的培養板上。結果表明VEGF-Fc融合蛋白基質化，其可通過VEGF受體介導顯著提高血管內皮細胞的粘附(圖 5)。 實施例4
本發明中通過細胞增殖實驗進一步表明與溶液中添加VEGF相比，溶液中添加 VEGF-Fc融合蛋白可有效促進內皮細胞的增殖且隨培養時間的延長VEGF-Fc融合蛋白可以更好的維持細胞增殖活性(圖6)。我們可以得出結論=VEGF-Fc融合蛋白可有效延長VEGF 在體外的生物活性，VEGF-Fc融合蛋白基質化可以持久地促進內皮細胞增殖。實施例5
本發明中利用免疫熒光染色技術進一步評價了 VEGF-Fc融合蛋白基質化對內皮細胞生長形態的影響(圖7)。比較內皮細胞分別培養于聚賴氨酸修飾培養板、聚賴氨酸修飾培養板并于培養基中分別添加VEGF、VEGF-Fc融合蛋白，以及VEGF-Fc融合蛋白修飾培養板形成的VEGF-Fc融合蛋白基質化表面，其結果表明黏附于VEGF-Fc融合蛋白基質化表面的內皮細胞表達更多的肌動蛋白纖維且在觀察時間范圍內(48h)細胞形態穩定，細胞骨架緊密排列，形成類似血管內皮層緊密排列的結構；而黏附于聚賴氨酸修飾且培養基中添加VEGF的內皮細胞，在培養早期細胞伸展良好且出現胞間連絲，但在培養48小時之后，這些細胞的胞間連絲消失。
參考文獻
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權利要求
1.一種表達血管內皮細胞生長因子(VEGF)和免疫球蛋白Fc (Fe)融合蛋白的基因質粒，即利用基因工程手段將VEGF和Fc結構域基因重組構建真核細胞表達VEGF和Fc雙功能融合蛋白的基因質粒。
2.—種VEGF-Fc融合蛋白，由權利要求1所述的基因質粒經真核細胞基因轉染、表達及分離純化而制得。
3.—種權利要求2所述的VEGF-Fc融合蛋白的應用，用于材料本體或材料表面修飾，提高材料的親水性，改善材料的生物相容性。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于用于提高材料的內皮細胞特異親和性，促進內皮細胞的黏附、增殖及批量擴增。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于用于促進誘導干細胞向內皮細胞定向分化、快速誘導材料表面內皮化，改善材料的抗凝血性能、提高材料誘導血管新生能力。
全文摘要
本發明利用基因重組技術構建了一種內皮細胞生長因子VEGF與免疫球蛋白G的Fc結構域的融合蛋白(VEGF-Fc)。該融合蛋白一方面可以更好地維持VEGF的生物活性，延長其半衰期，另一方面將其通過疏水作用固定于二、三維生物材料的本體或其表面，改善材料的生物相容性及其與內皮細胞的特異親和性，促進內皮細胞的黏附、增殖及誘導干細胞向內皮細胞定向分化，提高材料抗凝血及誘導血管新生的生物活性。
文檔編號C12N5/071GK102260702SQ20111020253
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日 公開號201110202533.發明者于美華, 杜鳳移, 楊軍 申請人:南開大學