專利名稱：腸出血性大腸桿菌的主要血清型o157核酸篩查方法
技術領域：
本發明屬于疫病檢驗領域，具體涉及一種基于環介導等溫擴增技術的腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157核酸篩查方法。主要應用于腸出血性大腸桿菌主要血清型0157 的核酸檢測。
背景技術：
腸出血性大腸桿菌(EHEC)是大腸桿菌的一個亞型，EHEC分為157、沈、111等血清型，主要致病菌株為0157 :H7，可引起感染性腹瀉，因能引起人類的出血性腸炎而得名。2011 年5月，德國爆發腸出血性大腸桿菌病。據羅伯特 科赫研究所6月觀日公布的最新疫情通報，德國一個多月來腸出血性大腸桿菌感染病例累計達3901例，截至27日，死亡患者已達47人。報告還指出，本次德國疫情與以往產志賀毒素大腸桿菌造成的疫情不同，其特點為一、感染病例中溶血性尿毒綜合征重癥病例所占比例達25%，遠高于以往疫情；二、溶血性尿毒綜合征病例中成人患者約占89%，且多數是女性。而以往產志賀毒素大腸桿菌感染者多數是兒童，且沒有明顯性別差異；三、以往疫情致病菌大多數是血清型0157型大腸桿菌，這次則是0104型；四、本次感染的潛伏期平均為8天，以往是3到4天。自1982年美國首次發現因大腸桿菌0157:H7致病菌引起的食物中毒以來，腸出血性大腸桿菌0157:H7疫情開始逐漸擴散和蔓延，相繼在英國、加拿大、日本、澳大利亞、南非等多個國家引起發病。1989年美國密蘇里州240余人因飲用水感染，死亡4人，1995年美國西海濱因“漢堡包”造成700余人發病，4人死亡。1992年南非由于飲水和糧食不衛生造成上千人發病。日本，于1984年首次出現該病感染，1990 1995年共發生8起由該菌引起的中毒事件，1996年5 8月間，日本包括岡山、廣島、名古屋、神戶、東京等在內的30多個都、 府、縣的小學、保育學校及幼兒園中多次發生集體食物中毒，發病人數達到9000人以上，以致上百所小學停課、幼兒園關門。我國在1987年就發現由此菌引起的散在感染，近年來已陸續有十多個省份在食品、家禽、家畜、昆蟲和腹瀉病患者中檢出該致病菌。美國，于2006 年9月中旬爆發“毒菠菜”事件，10月26，洛杉磯電，美國加利福尼亞州衛生官員沈日說， 調查表明，“毒菠菜”污染事件可能是因為野豬將大腸桿菌帶到了菠菜田里。加州衛生服務部的調查人員于當天晚間召開新聞發布會說，自9月中旬以來，已有204人因食用加州東部薩利納斯谷地生產的“毒菠菜”而患病，其中3人死亡。迄今美國有沈個州發現食用“毒菠菜”的患者，加拿大也有一個省被殃及。大腸桿菌通常存在于動物的腸內，并通過糞便物傳播。未煮過的農產品、未消毒的原料奶、未經高溫滅菌的果汁以及被污染的水和肉類中，都容易寄生這種細菌，但并非每種大腸桿菌都會致病。0157:H7感染包括無癥狀感染，輕度腹瀉，出血性結腸炎及其并發癥。 感染0157 H7后潛伏期一般為3 4天，長者達10天，臨床癥狀輕重不一，輕者無癥狀或僅有輕度腹瀉。及上呼吸道癥狀，大多在5 10天內痊愈，典型病例表現為突然發生的劇烈腹痛和非血性腹瀉，數天后出現血性腹瀉，無糞質，不發熱或僅有輕度發熱，血白細胞計數增多，感染7天后，可發生嚴重的溶血性尿素綜合癥(HUS)，發生率約3% 10%，暴發流行時比例稍低，HUS表現為在腹痛、腹瀉癥狀好轉后突然出現溶血性貧血癥狀(如醬油尿，進行性貧血，黃疸等)、腎功能衰竭癥狀(水腫、少尿或無尿，尿毒癥狀，高血鉀等)和出血癥狀 (便血、嘔血、硬腦膜下出血或視網膜出血，皮膚傷亡斑少見)。由于HUS存在廣泛的微血管血栓形成，可導致多臟器多系統損害如腦、心血管系統、肝、胰等，30%病例可發生腦功能不全，(如各種意識障礙，活動障礙和肌張力異常)40%病例有輕而短暫的肝損害。心血管系統受損可表現為高血壓，急性期絕大多數有輕度可逆性、易控制的高血壓，與腎素活性相關性不大，循環內皮素可能起重要作用。并發HUS的病死率較高，早期達30 % 50 %，近年來由于診斷、治療水平的提高死亡率大大下降。另一嚴重的并發癥是栓塞性血小板減少性紫癜(TTP)，臨床表現與HUS相似，但神經系統癥狀較多而腎臟損害較少，TTP死亡率亦可高達 30% 50% .目前腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157的檢測方法主要是微生物培養鑒定及多重PCR檢測技術。(1)大腸桿菌培養，結果可信度高，并能做細菌藥敏試驗，但需時過長， 應用受到限制，同時由于腸出血性大腸桿菌主要血清型0157菌株多為烈性人獸共患傳染病菌，對實驗室安全要求較高，不利于腸出血性大腸桿菌主要血清型0157的普遍篩選。(2) 聚合酶鏈反應(PCR)，特異性較差，優點是敏感度可達98% 100%，但是其需要PCR擴增儀、凝膠電泳等相關昂貴設備，不利于現場快速測定。21世紀初，Notomi T等開發了一種新穎的恒溫核酸擴增理論，即所謂的環介導等溫擴增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)，其特點是針對靶基因的8個區域設計6種特異引物，利用一種鏈置換Bst DNA聚合酶在恒溫條件(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應，短時間擴增效率可達到IO9-IOltl個拷貝。直接靠擴增副產物焦磷酸鎂沉淀的濁度或顯色反應進行判斷是否發生反應。該方法不需要模板的熱變性、 長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，LAMP法具有高特異性、高效性、快速、廉價 (不需要特定的貴重檢測設備，只需要簡單結構的恒溫箱)、易檢測(直接進行目測判斷) 等特點。

發明內容
本發明提供一種基于環介導等溫擴增技術的腸出血性大腸桿菌主要血清型0157 核酸篩查方法，LAMP檢測技術的檢測高于常規檢測法100-200倍，有力地解決了傳統的微生物培養鑒定方法檢出率較低的問題；另外由于經典聚合酶鏈反應(PCR)擴增技術對儀器設備要求較高(如PCR擴增儀，瓊脂凝膠電泳系統等)、技術較為復雜，不利于其在基層醫療防疫、檢驗檢疫機構的普遍應用，而LAMP檢測技術只需要簡單機構的恒溫箱，檢測時間短 (0. 5-1.0小時)、特異性高(針對靶基因的8個區域設計6種特異引物)等特點，可以使用基因擴增技術在現場監測中廣泛使用。本發明是這樣實現的一種腸出血性大腸桿菌主要血清型0157核酸篩查方法，通過使用特異性引物，利用環介導等溫擴增技術體系擴增靶基因的特定區域，在設置陽性和陰性對照的情況下，從分子水平對腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157進行核酸篩查；所述特異性引物為
權利要求
1. 一種腸出血性大腸桿菌主要血清型0157核酸篩查方法，其特征在于，通過使用特異性引物，利用環介導等溫擴增技術體系擴增靶基因的特定區域，在設置陽性和陰性對照的情況下，從分子水平對腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157進行核酸篩查；所述特異性引物為引物類別序列組成F3前外引物5’ -CACACTTATTGGATGGTCTCA-3‘B3后外引物5’ -TAGGCTGGGGAAACTAGG-3‘FIP前內引物5’ -GGCCTTGTTTCGATGAGTTTATCTGTTTTCTAACTAGGACCGCAGAGG-3’BIP后內引物5’ -CTGTCCACACGATGCCAATGTTTTTAATTAATTCCACGCCAACC-3’LoopF環狀引物5’ -CAAGGTGATTCCTTAATTCCTCTCT-3‘LoopB環狀引物5’ -GCACCCTATAGCTGAGGATCT-3‘
2.根據權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157核酸篩查方法，其特征在于，利用環介導等溫擴增技術擴增腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157的特定靶核酸序列區域。
3.根據權利要求1所述腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157核酸篩查方法，其特征在于，所述的陰陽性對照檢測體系中，陽性對照質控菌株購買于中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)，ATTCC編號7007 ，陽性對照質控品為利用天根基因提取試劑盒提取的大腸桿菌0157的基因，陰性對照質控品為不相同于擴增細菌靶基因的DNA，并使用電泳分析、 沉淀分析或STOR Green I熒光染料顯色法同時檢測陰陽對照和腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157靶基因擴增產物。
4.根據權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157核酸篩查方法，針對腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157中的genbank登錄號為S83460的rfbE基因設計環介導等溫擴增特異性引物。
5.根據權利要求1所述腸出血性大腸桿菌的主要血清型0157核酸篩查方法，其特征在于，所用的環介導等溫擴增反應體系是2x U-LAMP Mix 10ul，其組成成分40mM Tris-HCl、pH8. 8、20mM KCl、20m M(NH4)2SO4UOmM MgSO4^O. 2% Triton X_100、2. 4mM dNTP、 1. 6M甜菜堿；所述引物混合物2ul，其終濃度組成為F3為0. 2umol/L，B3為0. 2umol/L,FIP 為 1. 6umol/L, BIP 為 1. 6umol/L, LF 為 0. 8umol/L, LB 為 0. 8umol/L ；模板 DNA Iul、BSt 聚合酶1. 5ul、補超純水至20ul ；反應程序63°C 30分鐘一80°C 3分鐘一10°C保存。
全文摘要
本發明公開了一種基于環介導等溫擴增技術的腸出血性大腸桿菌的主要血清型O157核酸篩查方法。利用環介導等溫擴增(LAMP)技術來進行，通過使用特異性引物，利用LAMP技術平臺擴增靶基因的特定區域，在陽性和陰性對照和內對照檢測體系的輔助下，從分子水平對腸出血性大腸桿菌的主要血清型O157進行核酸篩查。本發明的方法具有簡便、經濟、快速、靈敏和特異的特點，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/19GK102268480SQ20111020289
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者張沙秋, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農業大學