專利名稱：：腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A1亞單位活性片段Stx2a₁重組蛋白及表達方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于基因工程
技術領域：
，具體地說涉及一種腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A:亞單位活性片段Stx2a!蛋白的表達方法及應用。
背景技術：
：腸出血性大腸桿菌(EHEC)0157:H7于1975年^f皮首次分離，因其能產生致死性志賀毒素(Shigatoxin,Stx),1982年^L確認為嚴重人獸共患致病菌。其感染具有暴發流行趨勢、強烈的致死性和抗生素治療可加劇病情的危險性等特點，已經成為全球公共衛生問題，對人類健康構成了巨大威脅。同時，EHEC0157:H7培養容易、感染力強、傳播途徑多樣，使其極有可能作為未來軍事戰爭的細菌武器和生物恐怖戰劑；E服C0157:H7的烈性致病因子還有可能用于基因重組新型生物武器一一基因武器的構建。美國疾病控制中心(CDC)已將EHEC0157:H7列為B類生物恐怖病原體嚴加防范。近年來，0157:H7EHEC感染的暴發流行在世界各地接連發生，尤其是日本、美國等。美國食品和藥品監^^管理局(FDA)近期宣布，于2006年9月14日爆發的大規模大腸桿菌感染經流行病學調查已證實，病原菌即為EHEC0157:H7型。感染病例數上升迅速，發現感染病例的地區也已擴大到全美20個州。中國江蘇、安徽省曾于1999年暴發流行EHEC0157:H7感染性腹瀉，患者超過2萬例，死亡177例，流4亍時間7個月(http:〃w麗.szed.com/n/ca505201.htm)。這可能是迄今為止世界上流行規模最大的一次。2001年上述地區又發生疫情，并且范圍擴大到西部、中原地區，甚至在東北、華北及華東少數地區也發生散發的0157:H7感染。目前中國已處于高發流行期，疫情不可能短期消失，必須引起全社會的高度重視。基于這種嚴峻的形勢，中國已將腸出血性大腸桿菌列為21世紀可能對國人衛生健康有重大影響的12種病原」微生物之一。EHEC0157:H7多為食源性或水源性感染，人與人之間或人與家畜之間通過糞口途徑傳^番。感染該菌可4吏人患腹渴、出血性結腸炎(^^orr力ag/cco//〃^HC),還可引發溶血性尿毒綜合癥(化/^//〃<7"re/z/csj^/ro/，HUS)及血栓性血小4反;咸:!y^^瘋(r力ro/z^or/c/^rcwc^oc/fope^/cpo/77wra,TTP)等嚴重并發癥，致死率達5~10%。臨床研究證實使用抗生素可促使0157:H7菌體破裂，"爆發性"釋放致死性志賀毒素(Stx)，從而使患者死亡的危險性增加。因此，2002年中國衛生部制定的EHEC0157:H7感染性腹瀉應急處理預案第5條有關病人的隔離治療規定"EHEC0157:H7病人和疑似病人(包括糞便標本0157:H7抗原膠體金方法檢測陽性的腹瀉病人)禁止使用抗生素，疫區內的其他一般腹瀉病人應慎用抗生素。"。目前國內外尚無可用于治療人EHEC0157:H7感染的特效藥物。因此，尋求特異有效的0157疫苗來防治0157:H7感染已迫在眉睫。志賀毒素(Shigatoxin,Stx)是EHEC的一種最為重要的毒力因子，是導致EHEC0157:H7EHEC感染病人出現HC、HUS的主要原因，也是EHEC0157:H7重要的保護性抗原之一，包括Stxl和Stx2兩個亞類，均由1個A亞單位和5個B亞單位組成，A亞基為毒力亞單位，具有細胞內毒性，能與28SrRNA作用導致蛋白質合成停止，是大腸桿菌0157:H7引起臨床表現的病理基礎;B亞基為結合亞單位，無毒而具有細胞結合特性，能與細胞表面糖鞘脂受體(Gb3)特異結合，從而引導A亞單位發揮作用，其均具有較強的免疫原性。同時，公布的Stx2全毒素的晶體結構解析顯示，A亞單位由A,和A2兩部分通過二碌j建連接組成，毒性的活性中心位于Ai片段的第77位的酪氨酸，此外，A2片段形成螺旋結構插入5個B亞基形成的小孑L中(MarieE.Fraser,Masao，FujinagaMaiaM.Cherney.StructureofShigatoxintype2(stx2)fromEscherichiacoli0157:H7.[J].BiologicalChemistry,2004，279(26):27511-27517)。因此，作為毒素主要毒力片段的Stx2A:是優選的治療藥物設計靶點。申請人實驗室前期將Stx2A!全長序列分別構建在pET-22b、pET-28a、pET-32a、pET-41a、pQE-30、PMXB10等表達載體上，但均未表達(見附圖l)。原因可能是Stx2A,羧基端的疏水性、其本身的空間構象或者是宿主菌中存在一種蛋白抑制其表達等等造成的，同時也與不同的￡cW/菌4朱間發生DNA轉移時存在一種DNA酶抗性融合機制以及具有不同的限制-修飾系統有關。目前國內外尚無Stx2Ai全長序列構建表達的相關研究報道。
發明內容本發明的一個目的是提供一種腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A,亞單位活性片段Stx2a,重組蛋白，其包括1)腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A:亞單位活性片段Stx2a!蛋白和表達載體片段；或2)腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2a:蛋白羧基端經一個或幾個氨基端缺失或添加獲得的與Stx2a!蛋白具有相似功能的蛋白和表達載體片段。其中，上述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2a,蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0:1所示，其編碼核香酸序列如SEQIDNO:2所示。本發明的較佳實施例中，上述的表達載體為pET-22b。本發明的另一目的是提供上述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A:亞單位活性片段Stx2a:重組蛋白的表達方法，其是將截短去掉腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2Ai亞單位羧基端1~20個氨基酸后對應的核香酸序列片段與表達載體連4妻，然后轉化宿主菌進行表達。本發明的較佳實施例中，上述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2Ai亞單位活性片段Stx2a!重組蛋白表達方法，其是將截短去掉腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位羧基端15個氨基酸后對應的核普酸序列片段與表達載體連接，然后轉化宿主菌進行表達。上述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2Ai亞單位活性片段Stx2a!重組蛋白表達方法，具體包含以下步驟1)通過生物信息學軟件分析腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A,亞單位，截短去掉其羧基端1~20個氨基酸后，根據截短后的氨基酸序列對應的核苷酸序列片段設計引物；2)以步驟l)設計的引物、通過PCR擴增腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2a,蛋白基因；3)將所述出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2a:蛋白基因克隆至表達載體，然后轉化至宿主菌；4)誘導表達Stx2a,蛋白；5)純化步驟4)得到的Stx2a!蛋白；6)純化后的31乂2&1蛋白的免疫原性的檢測。其中步驟l)中設計得到的引物為SEQIDN(h4-5;步驟2)中的PCR模板優選為為含志賀毒素2的菌抹99A021;步驟3)中所述的表達載體優選為pET-22b,宿主菌優選為BL21,其中步驟3)中得到的宿主菌BL21中導入了包含腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A,亞單位活性片段Stx2a,蛋白的編碼核苷酸序列SEQIDNO:2的表達載體pET-22b;步驟5)中優選采用免疫親和層析法純化所述Stx2a:蛋白。本發明的另一目的是提供上述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A:亞單位活性片段Stx2a,重組蛋白的應用，其可用于制備4企測試劑盒或抗腸出血性大腸桿菌0157:H7感染的亞單位疫苗。本發明人應用生物信息學對Stx2Ai全長氨基酸序列進行綜合分析，其羧基端約20個氨基酸的抗原性及親水性較弱，在不改變其抗原性的前提下將其羧基端分別截短1-20個氨基酸后對Stx2A^舌性片段進行克隆、表達和保護性免疫的研究，將Stx2Ai羧基端截短氨基酸后的片段命名為Stx2au本發明公開的此截短的EHEC0157:H7Stx2A,亞單位活性片段Stx2a!蛋白的純化方法，純化出的Stx2a!蛋白含量達98%以上。本發明人對Stx2a,的免疫性進行評價，發現構建的活性片段能高效表達并且可以用于疫苗，并且動物實驗中顯示有良好的免疫原性。用純化出的截短的EHEC0157:H7Stx2A!亞單位活性片段Stx2a,重組蛋白免疫5-6周齡的Balb/C小鼠，每次每只小鼠皮下多點及腹部注射蛋白100首次免疫兩周后第二次免疫，以后隔一周免疫一次，共四次，末次免疫后4天取尾血ELISA4全測血清特異性抗體效價，末次免疫后10天進行免疫動物攻毒保護試驗。本發明的主要優點在于用生物信息學預測及分析，Stx2aj至克隆構建獲得高表達的可溶蛋白，經純化后純度高達98%，動物實驗證明Stx2a!可刺激機體產生高效的免疫應答和免疫預防保護作用，說明此活性片段具有良好的免疫原性，特異性好。作為毒素主要毒力片段的Stx2A!是優選的治療藥物設計靶點，因此Stx2A!活性片段的構建表達對今后關于EHEC0157:H7的實驗研究及疫苗和治療制劑、診斷試劑盒等的研制均有重要的意義。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細il明如下。圖1:空載體pQE-30與Stx2Ai全長蛋白重組質粒誘導表達分析(pET-22b、pET-28a、pET-32a、pET-41a等載體與此相同)，其中1、2、3、4:空載體pQE-30經IPTG誘導0小時、1小時、3小時、5小時的表達產物6、7、8、9:重組目的蛋白經IPTG誘導0小時、1小時、3小時、5小時的表達產物M:蛋白marker;圖2:DNAstar軟件分析EHEC0157:H7Stx2A!亞單位的基因序列;圖3:截短的EHEC0157:H7Stx2A!亞單位活性片段Stx2a!PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳l.DNAmarker2.Stx2a!的PCR擴增產物；圖4:pMD18—T/stx2a!經Ndel、Xhol雙酶切鑒定M:100bpmarker1:pMD18—T/stx2a!(質沖立1)2:pMD18-T/stx2a丄(質粒2);圖5:原核重組質粒pET-22b/stx2aj至Ndel、Xhol雙酶切鑒定M:100bpmarker1:pET_22b/stx2a!(/承'4玄纟且,^"誶二1)2:pET-22b/stx2a,(原核重組質粒2);圖6:pET-22b/BL21空載體與重組質粒pET-22b/stx2a^BL21誘導表達分析1.蛋白Marker2、3、4、5.:pET-22b/BL21空載體經IPTG誘導0小時、1小時、3小時、5小時的表達產物6、7、8、9.:重組質粒pET-22b/stx2a〃BL21經IPTG誘導0小時、1小時、3小時、5小時的表達產物；圖7:16。C低溫誘導后可溶性表達分析M:蛋白marker1:16。C誘導的破菌后的上清2:16。C誘導的^s皮菌后的沉淀；圖8:pET-22b/stx2ai/BL21原核表達的純化產物的SDS-PAGE分析M:蛋白marker1:流穿2-7:目的蛋白洗脫；圖9:表達產物純化層析峰形圖；圖10:Westernblot分析截短的EHEC0157:H7Stx2A!亞單位活性片段Stx2a!表達產物的免疫活性；M:子貞染蛋白marker1:純化的Stx2a,目的蛋白顯色條帶2:純化的0157天然毒素顯色條帶。具體實施方式以下實施方式結合附圖進一步加以描述(以截短Stx2A,羧基端15個氨基酸為例)。實施例l:腸出血性大腸桿菌0157:H7Stx2A,亞單位活性片段Stx2a,的克隆1貧扭大腸桿菌99A021由江蘇省疾病控制中心提供，質粒pET-22b和大腸桿菌BL21、DH5oc為申請人實驗室保存，ExTaqDNA聚合酶、限制性核酸內切酶XhoI和NdeI、丁4連4妄酶及DNAmarker均為大連TaKaRa7>司產品；質粒抽提試劑盒為OMEGA公司產品；膠回收試劑盒為BBI公司產品；細菌基因組DNA提取試劑盒為天根公司產品。2.根據EHEC0157:H7Stx2A,亞單位全長基因序列，如SEQIDNIO:3所示。應用DNAstar專欠件分析見附圖2說明。3.引物的設計與合成(下劃線是酶切位點)才艮據DNAstar軟件分析表明其羧基端約20個氨基酸抗原性較低，且根據其活性中心位于77和167位氨基酸上及其抗原性、可塑性、親水性、柔韌性等分析，將其羧基端去掉15個氨基酸，所得的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其對應的基因序列如SEQIDN0:2所示。依照酶切位點檢索和引物設計原則，應用軟件Primer5.0根據此修改后的核酸序列設計引物為Pi(SEQIDNO:4),P2(SEQIDNO:5),上游引物5'端引入NdeI酶切位點，下游引物的3'端引入XhoI酶切位點上游5'TCCATATGCGGGAGTTTACGATAGAC3NdeI下游P25'TGCTCGAGAAAGGATATTCTCCCCAC3'XhoI4.模板的準備無菌接種環蘸取保存的99a021菌林三線法接種于lb平板，37。c培養12小時，挑取單個菌落接種于5mlLB培養液中，3rC搖床培養8小時按TIANampBacteriaDNAKit說明提取大腸桿菌99A021基因組DNA,-20。C保存備用。5.PCR擴增pcr擴增體系(50m1)。pcr條件為94。c預變性5分鐘，94。c變性1分鐘，6(TC退火30秒，72。C延伸l分鐘，30個循環，72。C完全延伸IO分鐘。PCR體系如下:模板DNA1jilPl(25pmo1/ja1)1ju1P2(25prao1/|i1)1ia1dNTPs(2.5mmol/1each)4ja110xPCR緩沖液10julMgCl2(25mmol/i)5p1^Y-ragDNA聚合酶0.25|a1ddH2032.75ja1PCR產物(取3ja1)經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分子量大小PCR擴增效果如附圖3所示。6.PCR產物的純化回收:參照EZ-10SpincolumnDNAGelEntiactionKit說明進行7.PCR產物的克隆與鑒定采用TA克隆方法克隆PCR產物，經NdeI、XhoI雙酶切鑒定見附圖48.PCR產物與pET-22b載體酶切回收將pET-22b載體和已克隆的PCR產物分別用NdeI和XhoI酶切，酶切體系為50jul，于37。C酶切4小時得到酶切產物。9.酶切產物的純化回收參照EZ-10SpincolumnDNAGelEntiactionKiti兌明進4亍。10.連接目的基因與pET-22b載體連接反應按TJ)NA連接酶的說明書進行，反應體系為IO于22'C連接過夜。11.重組質粒pET-22b/stx2a!連接鑒定目的基因與pET-22b載體經T4DNA連接酶連接過夜后轉化感受態大腸桿菌BL21,轉化產物涂布于含氨節青霉素的LB平板，37。C培養過夜，挑取單菌落接種于5ml的含氨節青霉素的LB液體培養基中，37。C搖床培養過夜，抽提質粒，經NdeI、XhoI雙酶切鑒定和測序(見附圖5)。結果此截短的目的基因stx2ai與表達載體pET-22b連接轉化宿主菌后經NdeI和Xhol雙酶切鑒定，證明已連接上表達載體此截短的目的基因構建成功，測序結果與理^侖的225個氨基酸序列一致。實施例2:EHEC0157:H7Stx2A!亞單位活性片段Stx2a,在大腸桿菌中的表達與純化1.目的基因的誘導表達將經NdeI、XhoI雙酶切和測序鑒定正確的活性片,殳Stx2ai重組菌種和pET-22b載體/BL21菌液接種至含氨節青霉素的LB液體培養液中，按常規方法誘導表達，(37。C搖床培養至A鋼為0.6-0.8,各取樣加入SDS-PAGE上樣緩沖液凍存，加入IPTG至終濃度為0.lmmol}_,37。C搖分別于1小時、3小時、5小時取樣加入SDS-PAGE上樣緩沖液凍存，沸水煮5分鐘后按常》見方法進行SDS-PAGE凝膠電泳分析(見附圖5)。結果顯示與pET-22b空載體對比，重組Stx2a!蛋白在25kDa大小左右有明顯條帶，表明EHEC0157:H7Stx2A:亞單位活性片段Stx2a!在大腸桿菌中表達。2.表達形式的鑒定將鑒定正確的重組菌種按常規方法誘導表達，37。C搖床培養至A,為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.1鵬ol，16。C搖床培養12小時，收集菌液5000rpm離心15分鐘，棄上清后加入30mlTris-HC1(pH7.5)懸浮沉淀物，將懸浮物超聲破菌(功率300W,超聲8秒，間隔6秒，循環99次)，制成裂解液，12000rpm離心30分鐘，取破菌后上清和沉淀，按常^見方法進行SDS-PAGE凝膠電泳分析(見附圖6)。結果顯示在16。C用終濃度為0.1mmol的IPTG誘導目的基因在大腸桿菌中表達，Stx2a!重組蛋白為可溶性表達，且表達量達40%。3.基因表達產物的純化用緩沖液A(20mMTris+0.5MNaCl,pH7.5)平衡10個床體積，流速為lml/分鐘，將20ml超聲破菌上清經0.45wm濾膜過濾，上樣，流速為0.5m1/分鐘，用緩沖液A再洗IO個柱床體積，流速為1ml/分鐘，用分別含IOO、150、500mM咪唑的緩沖液B(緩沖液A+0.5M咪唑+0.5MNaCl,pH7.5)進行階段洗脫，流速為lml/分鐘，收集各階段的洗脫峰，用SDS-PAGE檢測蛋白的分子量大小和純度(見附圖7、8)。SDS-PAGE結果顯示純化后的蛋白分子量大小約為25kDa與理論大小相符，純度為98%。4.Westernblot;險測表達產物的抗原性將純化的目的蛋白進行SDS-PAGE(12%)電泳，然后以100mA電轉移1小時，將目的蛋白轉移到NC膜上，加入5。/。脫脂奶粉4。C封閉過夜，TTBS洗膜5分鐘x4，加入由本實驗室構建的抗EHEC0157:H7Stx2Ai亞單位的單克隆抗體SA(1:1000)，37。C孵育1小時，TTBS洗膜5分鐘x4,加入二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG),孵育1小時，TTBS洗膜5分鐘x4，加入DAB底物顯色5分鐘，水洗終止反應，掃描記錄，同時作天然毒素Stx2與SA的Westernblot作為對照試驗。見附圖9。結果印記顯示本實驗室純化的天然毒素與一抗SA在32kDa大小左右有明顯顯色條帶，重組目的蛋白Stx2ai與一抗SJ)s在25kDa大小左右有明顯顯色條帶，表明EHEC0157:H7Stx2Ai亞單位活性片段Stx2a!具有免疫反應性。實施例3:酶聯免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測EHEC0157:H7類毒素免疫小鼠的抗體的產生1.EHEC0157:H7類毒素制備采用福爾馬林滅活法將本實驗室純化出的天然EHEC0157:H7毒素蛋白加入曱醛終濃度1%,37。C滅活5天。2.免疫程序免疫5-6周齡的Balb/c小鼠五只，100|ig/只，100ju1滅活的天然毒素首次免疫加等量免疫原弗氏佐劑，此后加不完全弗氏佐劑注射小鼠腹部和腹股溝皮下免疫。首次免疫后兩周進行第二次免疫，以后每周一次，于免疫四次后第七天取d、鼠的血液上清檢測產生的抗體。3.釆用EHEC0157:H7StxM!亞單位活性片段Stx2a!具有免疫反應性重組蛋白包被的ELISA板4全測純化的EHEC0157:H7天然毒素蛋白免疫的Balb/c小鼠產生的抗體，步驟如下1)酶標板的預處理將新購酶標板用雙蒸水浸泡過夜，晾干后備用。2)用包被液將抗原稀釋為合適的濃度純化的EHEC0157:H7天然毒素蛋白稀釋濃度分別為0.25jag/ml，0.5jig/ml，0.75|ng/ml,1|ng/ml。3)包被酶標板加10Gjil/孔上述抗原液，4。C過夜，洗滌液洗滌5遍，空干。4)封閉加封閉液300/孔，4。C過夜，洗滌5遍，空干，密封4°C保存備用。5)采血及稀釋小鼠眼眶取血，離心取上清用抗體稀釋l:IOOO倍稀釋。6)取包被好的酶標板，加入依次稀釋血清100nl/孔，37。C水浴30分鐘，洗滌4遍，空干。7)加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體工作液(l:20000稀釋)100Ml/孔，37。C水浴30分鐘，洗滌4遍，空干。8)加底物顯色液IOOial/孔，室溫避光反應5-10分鐘。9)加終止液50lil/孔，立即在酶標4義上以492nm波長測定OD值10)結果判斷OD值大于或等于陰性對照(小鼠免疫前血清1:IOO倍稀釋)的2.1倍時視為抗體陽性。結果Stx2a,重組蛋白檢測的0157:H7天然毒素免疫小鼠產生的抗體效價為1:64000。說明本發明構建的活性片段Stx2ai能夠特異性識別并檢測EHEC0157:H7免疫小鼠產生的抗體。實施例4:腸出血性大腸桿菌0157:H7Stx2^亞單位活性片段Stx2a^重組蛋白免疫小鼠的保護性效果觀察1.試驗材料0157感染動物模型Balb/c小鼠，雌性，5-6周齡，由本實驗室程建平和易勇等建立(程建平，易勇，毛旭虎等。腸出血性大腸桿菌0157:H7感染動物模型的建立。中國人獸共患病雜志，2005，21(4):42-45。)，(人和牲畜預防用出血性大腸桿菌0157:H7疫苗及制備方法，王慶旭，200510057206.9)2.動物免疫及抗體^:測方法目的蛋白經過純化后免疫5-6周齡的Balb/c小鼠五只，100pg/只，100p1抗原與等量弗氏佐劑混合，注射小鼠腹部和腹股溝皮下免疫。首次免疫后兩周進行第二次免疫，以后每周一次，分別于免疫3、4次后的5天采血，ELISA檢測血清特異性抗體效價的改變。結果目的蛋白免疫3次后的抗體陽性率在90°/。，免疫4次后的抗體陽性率達到95%。3.免疫動物的攻毒保護實驗同上相同的免疫方案，免疫四次后的第IO天采用致死劑量的0157:H7菌超聲上清液(含Stx2毒素及其他致病物質，蛋白濃度1mg/ml)0.05ml腹腔注射對免疫小鼠及對照小鼠進行攻毒實驗，觀察各組小鼠的死亡情況，在30天的觀察期后計算免疫小鼠的死亡/生存率如表表:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結果Stx2a!免疫組在攻毒實驗30天后存活數量為45只，保護率達90%,而對照組在攻毒實驗5天后就全部死亡，保護率為0。通過以上實驗說明本發明的活性片段Stx2a!重組蛋白具有良好的免疫原性并且能夠對EHEC0157:H7感染起到保護作用，能夠誘導機體產生免疫應答，表達本發明Stx2aj舌性片段在亞單位疫苗的應用上是成功的。雖然本發明已以較佳實施例披露如上，然其并非用以限定本發明，任何所屬
技術領域：
的技術人員，在不脫離本發明之精神和范圍內，當可作些許之更動與改進，因此本發明之保護范圍當視權利要求所界定者為準。序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫大學<120>腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A1亞單位活性片段Stx2a!重組蛋白及表達方法與應用<130><160>3<210>1<211〉225<212〉PRT<213>腸出血性大腸桿菌(Enterohe匿rhagic^sr力e".c/w'3co7力<220><223>活性片段Stx2ai的氨基酸序列<400>1ArgGluPheThrlieAspPheSerThrGinGinSerTyrValSer15151015SerLeuAsnSerlieArgThrGlulieSerThrProLeuGluHis302025lieSerGinGlyThrThrSerValSerVallieAsnHisThrPro453540Pro'GlySerTyrPheAlaValAsplieArgGlyLeuAspValTyr605055GinAlaArgPheAspHisLeuArgLeulielieGluGinAsnAsn756570LeuTyrValAlaGlyPheValAsnThrAlaThrAsnThrPheTyr908085ArgPheSerAspPheThrHislieSer10595100ValSerMetThrThrAspSerSerTyr120110115AlaAlaLeuGluArgSerGlyMetGin135125130ValSerSerTyrLeuAlaLeuMetGlu150140145ThrArgAspAlaSerArgAlaValLeu165155160AlaGluAlaLeuArgPheArgGinlie180170175AlaLeuSerGluThrAlaProValTyr195185190ValAspLeuThrLeuAsnTrpGlyArglieSerAsnValLeuPro210200205225ValProGlyValThrThrThrThrLeuGinArgVallieSerArgHisSerLeuPheSerGlyAsnThrMetArgPheValThrValThrGinArgGluPheArgGinThrMetThrProGlyAspGluTyrArgGlyGluAspGlyValArgValGlyArglieSerPhe215220<210>2<211>675〈212>腿<213〉腸出血性大腸桿菌(Enterohe匿rhagic￡sc/ei-/c^.sco7j')<220><223〉活性片段Stx2a!的核苷酸序列<400>2Cggg3gttt3cgategacttttcgacccaacaaagttatgtctcttcgtt60cggacagagatatcgacccctcttgaacaatatctcaggggaccacatcggtgtctgtt120attaaccacaccccaccgggcagttattttgctgtggatatacgsgggcttgatgtctat180caggcgcgttttgaccatcttcgtctgattattgagcaaaataatttatatgtggccggg240ttcgttaatacggcaac犯atactttctaccgtttttcagattttacacatatatcagtg300cccggtgtgacaacggtttccatgacaacgg3C3gC8gttataccactctgcaacgtgtc360gcagcgctggaacgttccggagtcgtcactcactggtttcatcata/tctg420gcgttaatgg3gttC3gtggaccagagatgC3tcca_g3gcagttctgcgt480tttgtcactgtcac3gcagaagccttacgcttcaggcagatacagag兆satttcgtcag540gcactgtctgaaactgctcctgtgta_tscgatgacgccggg卿Cgtgg3cctcactctg600aactgggggcgaatcagc犯tgtgcttccgg8gt3tCgggg卿ggatggtgtc卿gtg660ggg卿3tatccttt675<210>3<211〉720<212〉腿<213>腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic￡s"cAarj'c/_z'aco/i)<220>〈223>EHEC0157:H7Stx2M亞單位的核苷酸序列<400〉3cgggagtttacgatagacttttcgacccaacaaagtteitgtctcttcgtt60cggac卿gatatcgacccctcttgaacaatatctcaggggaccacatcggtgtctgtt120attaaccacaccccaccgggcagttattttgctgtgg咖tacg鄉gcttgatgtctat180caggcgcgttttgaccatcttcgtctgattattgagc犯atgtggccggg240ttcgtt犯tatactttctacCgtttttC3gattttacaca城3tC3gtg300cccggtgtgacaacggtttccatgacaacggacagcagttataccactctgcaacgtgtc360gcagcgctgg犯cgttccgg肌tgca犯tcagtcgtcactcactggtttc420gcgt恤tggagttcagtggaccag3g3tgcatccagagcagttctgcgt480tttgtcactgtcacagcagaagccttacgcttcaggcagaatttcgtcag540gcactgtctgaaactgctcctgtgtatacgatgacgccggg卿cgtggacctcactctg600aactgggggcg肪tcagca^tgtgcttccgg3g城Cgggg卿ggatggtgtc卿gtg660ggg卿自tcctttaataatatatcagcgatactggggactgtggccgtt720權利要求1.一種腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素2A1亞單位活性片段Stx2a1重組蛋白，其特征在于包括1)腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素2A1亞單位活性片段Stx2a1蛋白和表達載體片段；或2)腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素2A1亞單位活性片段Stx2a1蛋白羧基端經一個或幾個氨基端缺失或添加獲得的與Stx2a1蛋白具有相似功能的蛋白和表達載體片段。2.才艮據權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A1亞單位活性片段Stx2a1重組蛋白，其特征在于所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2Ai亞單位活性片段Stx2a!蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.根據權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A,亞單位活性片段Stx2a1重組蛋白，其特征在于所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2Ai亞單位活性片段Stx2a,蛋白的編碼核脊酸序列如SEQIDN0:2所示。4.權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2、亞單位活性片段Stx2ai重組蛋白的表達方法，其特征在于將截短去掉腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2&亞單位羧基端1~20個氨基酸后對應的核苷酸序列片段與表達載體連接，然后轉化宿主菌進行表達。5.根據權利要求4所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A:亞單位活性片段Stx2a,重組蛋白表達方法，其特征在于在于將截短去掉腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位羧基端15個氨基酸后對應的核苷酸序列列片段與表達載體連接，然后轉化宿主菌進行表達。6.根據權利要求4所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2ai重組蛋白表達方法，其特征在于包含以下步驟1)通過生物信息學軟件分析腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位，截短去掉其羧基端1~20個氨基酸后，根據截短后的氨基酸序列對應的核苦酸序列片段設計引物；2)以步驟l)設計的引物、通過PCR擴增腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2a!蛋白基因；3)將所述出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A,亞單位活性片段Stx2a:蛋白基因克隆至表達載體，然后轉化至宿主菌；4)誘導表達Stx2ai蛋白；5)純化步驟4)得到的Stx2a!蛋白；6)純化后的Stx2a!蛋白的免疫原性的檢測。7.根據權利要求4所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2a,重組蛋白表達方法，其特征在于步驟1)中設計得到的引物為SEQIDNO:4-5。8.根據權利要求4所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A:亞單位活性片段Stx2a!重組蛋白表達方法，其特征在于步驟2)中的PCR模板為專產志賀毒素2的菌林99A021。9.根據權利要求4所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2a!重組蛋白表達方法，其特征在于步驟3)中所述的表達載體為pET-22b，宿主菌為BL21。10.根據權利要求4所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2ai重組蛋白表達方法，其特征在于步驟3)中得到的宿主菌BL21中導入了包含腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A,亞單位活性片段Stx2a,蛋白的編碼核苷酸序列SEQIDNO:2的表達載體pET-22b。11.根據權利要求4所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A:亞單位活性片段Stx2a!重組蛋白表達方法，其特征在于步驟5)中采用免疫親和層析法純化所述Stx2a!蛋白。12.權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素2A!亞單位活性片段Stx2a:重組蛋白在制備檢測試劑盒中的應用。13.權利要求1所述的腸出血性大腸桿菌0157:H7志賀毒素"i亞單位活性片段Stx2ai重組蛋白在制備抗腸出血性大腸桿菌0157:H7感染的亞單位疫苗中的應用。全文摘要本發明公開了一種腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素2A₁亞單位活性片段Stx2a₁重組蛋白，其包括1)腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素2A₁亞單位活性片段Stx2a₁蛋白和表達載體片段；或2)腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素2A₁亞單位活性片段Stx2a₁蛋白羧基端經一個或幾個氨基端缺失或添加獲得的與Stx2a₁蛋白具有相似功能的蛋白和表達載體片段；本發明還公開了上述腸出血性大腸桿菌O157:H7志賀毒素2A₁亞單位活性片段Stx2a₁重組蛋白的制備方法及其在制備檢測試劑盒和制備防治EHECO157:H7感染的亞單位疫苗中的應用。文檔編號A61K39/108GK101240019SQ20081006939公開日2008年8月13日申請日期2008年2月27日優先權日2008年2月27日發明者璐劉,張衛軍,浩曾,萍羅,鄒全明申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學