專利名稱：一種提取抗氧化綠豆多糖的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種提取抗氧化綠豆多糖的方法。
背景技術：
綠豆是我國傳統的雜糧作物，具有很好的食用及藥用價值，有“食中佳品，濟世之食谷”之說。傳統中醫認為，綠豆具有清熱解毒、消炎、利水潤膚等功效，現代營養醫學研究亦證實綠豆在抑菌、降脂、抗腫瘤以及解除重金屬(鉛等)中毒方面有顯著作用。綠豆皮是綠豆的種皮，又俗稱豆衣，古代醫書上稱有“清風熱，去目翳，化斑疹，消腫脹”之功效，而通常認為綠豆的清熱功能是由綠豆皮發揮的?，F代營養分析表明，綠豆皮主要由膳食纖維構成，其含量高達60% _70%，其中絕大部分是不可溶性膳食纖維；此外，還含有一些具有天然抗氧化物質，如多酚、黃酮、單寧、皂甙等。綠豆皮是常見綠豆制品加工，如綠豆芽、綠豆淀粉、綠豆仁等生產中的副產物，除少量作為中藥材外，大部分是作為低附加值的飼料或廢棄物，資源未得到充分利用。多糖(Polysaceharides)是一類具有廣泛生物活性的生物大分子物質，是構成生命活動四大基本物質之一，與維持生物機能密切相關。近年來，大量研究揭示，多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖、抗凝血等作用，且與藥物相比，對機體的毒副作用小，因此成為當今食品及營養醫學領域的研究熱點。綠豆皮中富含的膳食纖維絕大部分是多糖類物質，此類多糖的含量如何以及是否具有上述功能活性，目前仍缺乏可靠的研究報道。目前有個別關于綠豆皮中多糖提取工藝的文獻報道，采用高溫(95°C)水提取或超聲輔助提取。有關綠豆皮中多糖提取的專利未見申請。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種綠豆皮中提取多糖的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟1)將綠豆皮與水混勻，得到混合物；2)將步驟1)得到的混合物在微波反應器中反應、離心取上清液，即得到多糖。步驟1)中，所述綠豆皮和水的配比為Ig 15mL_20mL，所述綠豆皮和水的配比具體為 Ig 15mL、18mL 或 20mL ；步驟2~)中，所述微波反應器的微波功率為500W-900W，所述微波反應器的微波功率具體為500W、700W或900W ；所述反應時間為50s_90s，所述反應時間具體為50s、70s或 90s ；所述離心的溫度為23°C 48°C，所述離心的溫度具體為231、251或觀1，所述離心的轉速為4200rpm-5000rpm，所述離心半徑為16cm，所述離心的時間為15min_25min ；所述離心的轉速具體為4200rpm、4500rpm、5000rpm，所述離心的時間具體為 15min、20min、25mino在步驟1)前還包括如下步驟
A、將綠豆皮干燥、粉碎，得到粉碎產物；B、將步驟A得到的粉碎產物用80% (體積百分含量)乙醇水溶液浸泡，過濾、收集濾渣；C、將步驟B得到的濾渣依次分別用95% (體積百分含量)乙醇水溶液、無水乙醇、 丙酮和乙二醚洗滌、干燥，得到脫除小分子糖及色素的綠豆皮；在步驟2)的離心取上清液后還包括如下步驟D)將所述上清液濃縮得到濃縮產物、所述濃縮產物進行乙醇沉淀得到沉淀產物、所述沉淀產物進行干燥，得到干燥產物即為多糖。步驟A)中，所述干燥的溫度為60°C -80°C，所述干燥的溫度具體為60°C、7(TC或 80°C，所述干燥采用烘干的方式，所述粉碎為粉碎至40-80目大小，所述粉碎具體為粉碎至 40目、60目或80目大??；步驟B)中，所述浸泡的時間為4_8h，所述浸泡的時間具體為4hjh或他，所述浸泡的溫度為23°C 48°C，所述浸泡的溫度具體為231、251或觀1；步驟C)中，所述干燥的溫度為23°C 48°C，所述干燥的溫度具體為23°C、25°C或 ^°C，所述干燥的時間為20h-2 !，，所述干燥的時間具體為20h、24h或^h ；步驟D)中，所述濃縮采用真空旋轉蒸發濃縮，所述濃縮的溫度為55°C _60°C，所述濃縮的溫度具體為或60°C，所述濃縮為至所述上清液體積的1/6 ；所述乙醇沉淀包括如下步驟a、將所述濃縮產物與三倍體積無水乙醇混勻，靜置、離心收集一次沉淀產物；b、將步驟a得到的一次沉淀產物用水溶解、離心收集上清液；C、將步驟b得到的上清液與三倍體積無水乙醇混勻，靜置、離心收集沉淀產物；所述干燥包括如下步驟d、將步驟c得到的所述沉淀產物用無水乙醇洗滌、離心取沉淀；e、將步驟d得到的沉淀于大氣壓力為0. lKpa、溫度為-45°C-60°C下干燥，得到多糖。步驟a和步驟c中，所述靜置的溫度均為2V _6°C，所述靜置的時間均為10h_16h ；所述靜置的溫度均具體為2°C、4°C或6°C，所述靜置的時間均具體為10h、12h或 16h ；步驟a、b、c、d中，所述離心的溫度為23°C ，所述離心的溫度具體為23°C、 25°C或^°C，所述離心的轉速為4200rpm-5000rpm，所述離心半徑為16cm，所述離心的時間為 15min_25min ；所述離心的轉速具體為4200rpm、4500rpm或5000rpm，所述離心的時間具體為 15min、20min 或 25min ；步驟e中，所述干燥時間為Mh_48h，所述干燥時間具體為Mh、30h或48h，所述干燥的溫度為_45°C、_50°C或_60°C。由上述方法得到的多糖也是本發明保護的范圍。上述得到的多糖在制備具有抗氧化功能產品中的應用也是本發明保護的范圍。上述應用中，所述抗氧化功能為清除自由基，所述自由基為DPPH自由基。上述應用中，所述產品可為保健品、藥物或化妝品等。
本發明的實驗證明，本發明以綠豆皮為原料，通過原料預處理、微波輔助提取、濃縮、醇沉、復溶、二次醇沉及冷凍干燥等技術制備綠豆多糖，所采用提取方法為微波輔助提取，不僅有利于多糖成分的較充分溶出，得率顯著提高；而且微波穿透式內外加熱，熱量傳導快速均勻，只需幾十秒或幾分鐘即可完成，極大節省了提取時間。本發明方法得到的綠豆多糖最終產品得率6. 81 % 7. 00 %，多糖純度為65 % 70 %，且具有良好的抗氧化功能。 本發明利用綠豆皮這一富含植物多糖的副產物資源，采取目前工業應用上較為成熟的微波萃取技術，獲得高附加值的功能性綠豆皮多糖。相關技術與產品將帶動綠豆加工業的綜合利用與增值轉化，符合當前我國農產品加工業發展要求，未來產業化前景良好。


圖1為綠豆皮多糖提取流程圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。綠豆皮從景七綠豆淀粉加工企業購買；微波提取裝置為家用微波爐。實施例1、綠豆皮多糖的制備多糖提取的流程圖如圖1所示。一、多糖提取1)綠豆皮預處理將綠豆皮于60°C下烘干，粉碎至40目；80% (體積百分含量)乙醇水溶液浸泡他， 浸泡的溫度為23°C，除去濾液；濾渣分別用95% (體積百分含量)乙醇水溶液、無水乙醇、 丙酮和乙二醚洗滌，室溫(23°C)下干燥Mh，得到脫除小分子糖及色素的較純凈綠豆皮。2)微波提取取預處理后的綠豆皮5g與90mL(lg 18mL)蒸餾水混合均勻，置于微波反應器中，在微波功率700W下反應70s，得到微波提取料液。3)離心將冷卻至室溫的微波提取料液離心(23°C，5000rpm,離心半徑為16cm，15min)、收集上清液；濾渣用蒸餾水清洗兩遍，與上清液合并，得到提取液；4)濃縮提取液采用真空旋轉蒸發濃縮，溫度為55. 0°C，至溶液體積濃縮至IOmL左右停止 (即濃縮至上清液體積的1/6)，得到濃縮液。5)乙醇沉淀a、在攪拌狀態下，向濃縮液中緩慢加入三倍體積無水乙醇，4°C下靜置12h ；23°C, 5000rpm轉速下離心20min，收集一次沉淀產物；b、將一次沉淀產物用IOmL水重新溶解，混合均勻；于5000rpm條件下離心20min， 收集上清液；用三倍乙醇復溶，4°C下靜置12h ；23°C,5000rpm條件下離心20min，收集沉淀產物。6)干燥
將所得沉淀產物用IOmL無水乙醇洗滌離心，重復該操作2次；洗滌后多糖沉淀于真空冷凍條件下干燥(-60°C，0. lKPa)Mh，至物料水分含量降至10%以下；得到最終多糖實驗設置三次重復，結果取平均值。二、多糖組分分析產品中，水分含量檢驗采用(GB/T 21305-2007)；總氮含量檢測采用凱氏定氮法 (GB/T 50095-2003)；多糖含量檢驗采用苯酚-硫酸法；糖醛酸含量檢驗采用硫酸_咔唑法。①苯酚-硫酸法標準曲線繪制配制100 μ g/mL葡萄糖(分析純，國藥集團化學試劑北京有限公司)標準液。分別取1、2、3、4、5、6、7、8和9mL的100 μ g/mL葡萄糖標準液，與去離子水混合定容至10mL，得不同濃度葡萄糖標準溶液。各取ImL不同濃度(0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μ g/ mL)的葡萄糖標準溶液，加入1. OmL 6%苯酚溶液，混合均勻后再加入5. OmL濃硫酸進行反應。反應混合液靜置IOmin后于25 30°C水浴中放置25min。待溶液顏色穩定后，以試劑空白為對照，于490nm下測定吸光值。以吸光值A為橫坐標，葡萄糖濃度為縱坐標，得到苯酚-硫酸法標準曲線。②硫酸-咔唑標準曲線繪制準確稱量50mg咔唑(試劑純度，公司)，用95%乙醇定容至50mL，配制成濃度為 0. 的咔唑溶液。稱取干燥的半乳糖醛酸IOmg溶解于IOOmL去離子水中，配制成0. lmg/mL 標準溶液。準確量取0、0. 1、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. OmL該標準溶液并加去離子水補至1. OmL0 冰水浴中向各不同濃度的標準溶液中加6mL濃硫酸溶液，漩渦混合均勻后，于85°C熱水浴中保溫20min。各標準溶液冷卻至室溫后，分別加入0. 2mL咔唑溶液，室溫下保持2h，于 530nm下測定其吸光數值。以吸光度A為橫坐標，半乳糖醛酸濃度為縱坐標，得到硫酸_咔唑法標準曲線。③多糖得率計算取一定量的最終多糖樣品，按適當比例加水稀釋，按標準曲線制作的實驗步驟測定吸光值，再由苯酚-硫酸法標準曲線方程計算總糖含量。多糖得率的計算公式如下產品得率(％ )=綠豆多糖質量/綠豆皮原料質量X 100%，實驗設3次重復，結果取平均數。結果表明，上述方法提取得到的綠豆多糖為均勻淺棕色粉末，3次重復實驗得到的多糖質量平均為0. 348g，3次重復實驗的產品得率平均為6. 98%。多糖組分分析結果表明，采用如上方法所得綠豆多糖產品，水分含量為7.對％， 粗蛋白含量為11. 35%，總糖含量66. 25% (體現了多糖純度，但用總糖含量可能更為準確些)，糖醛酸含量12. 54%。實施例2、綠豆多糖的制備多糖提取的流程圖如圖1所示。一、多糖提取1)綠豆皮預處理將綠豆皮于70°C下烘干，粉碎至60目；80%乙醇浸泡4h(25°C )，除去濾液；濾渣分別用95%乙醇、無水乙醇、丙酮和乙二醚洗滌，室溫(25°C)下干燥20h，得到脫除小分子糖及色素的較純凈綠豆皮。2)微波提取取預處理后的綠豆皮5g與75mL(lg 15mL)蒸餾水混合均勻，置于微波反應器中，在微波功率500W下反應50s，得到微波提取料液。3)離心將冷卻至室溫的微波提取料液離心(25°C，4500rpm，25min)、收集上清液；濾渣用蒸餾水清洗兩遍，與上清液合并，得到提取液；4)濃縮提取液采用真空旋轉蒸發濃縮，溫度為60. 0°C，至溶液體積濃縮至IOmL左右停止 (即濃縮至上清液體積的1/6)，得到濃縮液。5)乙醇沉淀a、在攪拌狀態下，向濃縮液中緩慢加入三倍體積無水乙醇，2°C下靜置16h ；25°C, 4500rpm轉速下離心25min，收集沉淀物；b、將沉淀物用IOmL水重新溶解，混合均勻；25°C，于4500rpm條件下離心25min， 收集上清液；用三倍乙醇復溶，2°C下靜置16h ；4500rpm條件下離心25min，收集沉淀。6)干燥將所得沉淀用IOmL無水乙醇洗滌離心，重復該操作2次；洗滌后多糖沉淀于真空冷凍條件下干燥(_45°C，0. lKPa)30h，至物料水分含量降至10%以下；得到最終多糖產品。實驗設置三次重復，結果取平均值。二、多糖組分分析方法同實施例1中所述一致。實驗設3次重復，結果取平均數。結果表明，上述方法提取得到的綠豆多糖為均勻淺棕色粉末，3次重復實驗得到的多糖質量平均為0. 33g，3次重復實驗的產品得率平均為6. 82%。多糖組分分析結果表明，采用如上方法所得綠豆多糖產品，水分含量為7. 36%，粗蛋白含量為11. 94%，總糖含量65. 73%，糖醛酸含量13. 07%。實施例3、綠豆多糖的制備多糖提取的流程圖如圖1所示。一、多糖提取1)綠豆皮預處理將綠豆皮于80°C下烘干，粉碎至80目，80%乙醇浸泡8h，除去濾液；濾渣分別用95%乙醇、無水乙醇、丙酮和乙二醚洗滌，室溫下干燥^h，得到脫除小分子糖及色素的較純凈綠豆皮。2)微波提取取預處理后的綠豆皮5g與100mL(lg 20mL)蒸餾水混合均勻，置于微波反應器中，在微波功率900W下反應90s，得到微波提取料液。3)離心將冷卻至室溫的微波提取料液離心O8°C，4200rpm，20min)、收集上清液；濾渣用蒸餾水清洗兩遍，與上清液合并，得到提取液；4)濃縮提取液采用真空旋轉蒸發濃縮，溫度為55. 0°C，至溶液體積濃縮至IOmL左右停止 (即濃縮至上清液體積的1/6)，得到濃縮液。5)乙醇沉淀a、在攪拌狀態下，向濃縮液中緩慢加入三倍體積無水乙醇，6°C下靜置IOh ；28°C, 4200rpm轉速下離心15min，收集沉淀物；b、將沉淀物用IOmL水重新溶解，混合均勻；于4200rpm條件下離心25min，收集上清液；用三倍乙醇復溶，6°C下靜置IOh ；4200rpm條件下離心15min，收集沉淀。6)干燥將所得沉淀用IOmL無水乙醇洗滌離心，重復該操作2次；洗滌后多糖沉淀于真空冷凍條件下(_50°C，0. IKPa)干燥48h，至物料水分含量降至10%以下；得到最終多糖產品。實驗設置三次重復，結果取平均值。二、多糖組分分析方法同實施例1中所述一致。實驗設3次重復，結果取平均數。結果表明，上述方法提取得到的綠豆多糖為均勻淺棕色粉末，3次重復實驗得到的多糖質量平均為0. 34g，3次重復實驗的產品得率平均為6. 72%。多糖組分分析結果表明，采用如上方法所得綠豆多糖產品，水分含量為7.對％，粗蛋白含量為11. 35%，總糖含量67. 45%，糖醛酸含量12. M%?，F有從綠豆皮中多糖提取工藝，采用95°C熱水、1 20料水比下攪拌提取池，之后采用同樣的后處理方式，得到綠豆多糖產品得率為4. 10%，較本發明的微波法低41. 3%;總糖含量為64. 46 %，與本發明的微波法相近。實施例4、綠豆多糖的體外抗氧化活性實驗分別用實施例1、2和3得到的綠豆多糖進行DPPH清除效果實驗。方法準確稱取一定量綠豆多糖溶于蒸餾水中，得到50、100、150、200和250 μ g/ mL濃度的樣品溶液。依次添加0. ImM DPPH-95%乙醇水溶液1. 5mL，樣品溶液1. 5mL,震蕩后于室溫下放置30min，517nm測定吸光度。DPPH自由基清除效果計算公式如下
權利要求
1.一種綠豆皮中提取多糖的方法，包括如下步驟1)將綠豆皮與水混勻，得到混合物；2)將步驟1)得到的混合物在微波反應器中反應、離心取上清液，即得到多糖。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述綠豆皮和水的配比為Ig 15mL-20mL，所述綠豆皮和水的配比具體為 Ig 15mL、lg 18mL 或 Ig 2OmL ；步驟中，所述微波反應器的微波功率為500W-900W，所述微波反應器的微波功率具體為500W、700W或900W ；所述反應時間為50s_90s，所述反應時間具體為50s、70s或90s ； 所述離心的溫度為23°C 48°C，所述離心的溫度具體為231、251或觀1，所述離心的轉速為4200rpm-5000rpm，所述離心半徑為16cm，所述離心的時間為15min_25min ；所述離心的轉速具體為4200rpm、4500rpm、5000rpm，所述離心的時間具體為15min、 20min、25mino
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于 在步驟1)前還包括如下步驟A、將綠豆皮干燥、粉碎，得到粉碎產物；B、將步驟A得到的粉碎產物用80%(體積百分含量)乙醇水溶液浸泡，過濾、收集濾渣；C、將步驟B得到的濾渣依次分別用95%(體積百分含量)乙醇水溶液、無水乙醇、丙酮和乙二醚洗滌、干燥，得到脫除小分子糖及色素的綠豆皮；在步驟2)的離心取上清液后還包括如下步驟D)將所述上清液濃縮得到濃縮產物、所述濃縮產物進行乙醇沉淀得到沉淀產物、所述沉淀產物進行干燥，得到干燥產物即為多糖。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟A)中，所述干燥的溫度為60°C _80°C，所述干燥的溫度具體為60°C、70°C或80°C， 所述干燥采用烘干的方式，所述粉碎為粉碎至40-80目大小，所述粉碎具體為粉碎至40目、 60目或80目大小；步驟B)中，所述浸泡的時間為4h-8h，所述浸泡的時間具體為4h、他或他，所述浸泡的溫度為23°C 48°C，所述浸泡的溫度具體為23°C、25°C或；步驟C)中，所述干燥的溫度為23°C 48°C，所述干燥的溫度具體為231、251或觀1， 所述干燥的時間為20h48h，所述干燥的時間具體為20h、24h或^h ；步驟D)中，所述濃縮采用真空旋轉蒸發濃縮，所述濃縮的溫度為55°C _60°C，所述濃縮的溫度具體為或60°C，所述濃縮為至所述上清液體積的1/6 ； 所述乙醇沉淀包括如下步驟a、將所述濃縮產物與三倍體積無水乙醇混勻，靜置、離心收集一次沉淀產物；b、將步驟a得到的一次沉淀產物用水溶解、離心收集上清液；c、將步驟b得到的上清液與三倍體積無水乙醇混勻，靜置、離心收集沉淀產物；所述干燥包括如下步驟d、將步驟c得到的所述沉淀產物用無水乙醇洗滌、離心取沉淀；e、將步驟d得到的沉淀于大氣壓力為0.lKpa、溫度為-45°C -60°C下干燥，得到多糖。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步驟a和步驟c中，所述靜置的溫度均為2V -6°C，所述靜置的時間均為10h-16h ； 所述靜置的溫度均具體為2°C、4°C或6°C，所述靜置的時間均具體為IOhUa1或16h ； 步驟a、b、c、d中，所述離心的溫度為23°C 48°C，所述離心的溫度具體為23°C、25°C 或^°C，所述離心的轉速為4200rpm-5000rpm，所述離心半徑為16cm，所述離心的時間為 15min_25min ；所述離心的轉速具體為4200rpm、4500rpm或5000rpm，所述離心的時間具體為15min、 20min 或 25min ；步驟e中，所述干燥時間為Mh-48h，所述干燥時間具體為Mh、30h或48h，所述干燥的溫度為-45 V、-50 V 或-60 V。
6.由權利要求1-5中任一所述方法得到的多糖。
7.權利要求6中所述多糖在制備具有抗氧化功能產品中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于所述抗氧化功能為清除自由基；所述自由基為DPPH自由基。
全文摘要
本發明公開了一種提取抗氧化綠豆多糖的方法。本發明提供了一種綠豆皮中提取多糖的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟1)將綠豆皮與水混勻，得到的混合物；2)將步驟1)得到的混合物在微波反應器中反應、離心取上清液，即得到多糖。本發明的實驗證明，本發明以綠豆皮為原料，通過原料預處理、微波輔助提取、濃縮、醇沉、復溶、二次醇沉及冷凍干燥等技術制備綠豆多糖，得率顯著提高；多糖純度為65％-70％，且具有良好的抗氧化功能。
文檔編號A23L1/09GK102304189SQ201110203090
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者周素梅, 曾志紅, 林偉靜, 王燕, 鐘葵 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所