專利名稱：一種基因進入細胞檢測和注射一體化系統及工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因進入細胞檢測和注射一體化系統及其制造工藝，就其功能而言，這個系統可以同時實現檢測和注射。就其結構而言，這個系統由納米探針和微米管道組成。
背景技術：
一些重大疾病如艾滋病、肝炎，惡性腫瘤，遺傳疾病，傳統的治療方法不僅花費巨大，給社會和家庭帶來巨大的經濟負擔，而且治療效果不理想。基因治療可以從根本上治療這些疾病，不會出現腫瘤的復發，肝炎病毒、遺傳疾病給患者帶來的終身困擾，從而真正達到治療目的，引起了世界范圍內的廣泛關注，是今后疾病治療研究的一個重要方向和必然發展趨勢。將基因送入細胞是基因治療的首要問題又是核心問題，目前基因送入細胞的主要方法有.磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、機械法和陽離子脂質體試劑。以上方法存在的共同問題提供了基因進入細胞的環境，無法對進入過程進行控制和檢測，基因進入細胞存在很大的隨機性，影響了治療效果，是目前基因治療研究出現的難題， 使得基因治療無法深入研究。針對目前的機械法注入基因，沒有對于基因精確的操縱，多是靠經驗和后期的檢測來判斷基因進入細胞的效果，忽略了基因進入細胞的前期過程。即到底在細胞膜上發生了什么變化，這種變化的程度。如何控制和利用這種變化，細胞膜的這種變化的監控和評價。本專利提出制造兼具注入功能納米檢測探針，實現基因進入細胞的精確導入和監控的一體化系統集成，完成向細胞內可控注入基因，利用原子力顯微鏡的直觀性和直接獲得摩擦力的性能檢測細胞膜表面的變化，在細胞膜表面進行標記，將作用區域精確到納米范圍， 排除傳統方法存在的不能精確操作性和不可控性，揭示基因進入細胞的機制，細化基因進入細胞時細胞膜的變化所對應的生物學表現，澄清目前基因治療研究中的機理問題。

發明內容
為了克服傳統方法存在的缺陷或不足，本發明的目的在于提供一種新的基因進入細胞的檢測注射一體化系統制造工藝。本發明的技術方案是這樣實現的一種基因進入細胞檢測和注射一體化系統，包括原子力顯微鏡中的激光發生器、 反射鏡、光電檢測器，探針、探針內注射管道、微量控制系統與探針、探針內注射管道組成的原子力顯微鏡探針連接；激光發生器發出的激光打在探針的懸臂梁上，通過反射鏡被光電檢測器讀到，探針與懸臂梁的一端連接，懸臂梁內有管道，探針兩側開孔與懸臂梁內的管道接通，懸臂梁的另一端連接微量控制系統，探針針尖直徑為8nm lOnm，懸臂梁內部管道的矩形截面長20 30 μ m，寬1 μ m。微量注射系統又包括減速裝置、微量泵、控制系統和信號檢測。
一種基因進入細胞檢測和注射一體化系統制備工藝，具體步驟如下1)硅片上旋涂光刻膠厚度0. 4 0. 9 μ m，曝光45秒，刻蝕得到溝槽結構，然后通過鍵合技術形成具有內部通道結構的懸臂梁；2)在懸臂梁一端旋涂電子束光刻膠厚度0.5 μ m，刻蝕得到直徑8 10納米的針尖，制作定位基準，針尖兩側套刻出直徑200 300nm的圓孔；3)微量控制系統通過控制系統調節微量泵，由減速裝置實現微流體的準確進入細胞。所述的檢測注射一體化系統，該系統基本組成單元為具有內部通道的探針和懸臂 M
TTC。探針、探針內注射管道所采用的材料是硅或氮化硅。所采用的細胞是腫瘤細胞或正常細胞。本創新技術與現有技術相比具有如下優點1.能夠精確制作具有內部通道結構的探針，易于大規模生產；可以通過懸臂梁內部通道進行注射，通過探針實現檢測與注射一體化。2.便于基因進入的檢測與監控，操作可以進行控制和引導，能精確找到基因進入的最佳位點。3.更適合研究基因進入細胞的機理和準確評價細胞發生的變化。


圖1是本發明的系統基本原理結構圖。圖2帶有通道的探針系統。圖3探針通道的制造工藝。圖4探針尖端兩側通道的制造工藝。下面將結合附圖對本支架的結構及工藝流程加以詳述。
具體實施例方式一種基因進入細胞檢測和注射制造工藝，其特征在于納米級的探針與懸臂梁連通組成一個檢測注射系統；其中懸臂梁內部有通道，一端連接微量控制系統；探針既能完成檢測和成像，找到特異性結合位置如受體的位置，然后基因可以準確從該位置被注入細胞內。所述的探針、懸臂梁材料采用硅，氮化硅等。上述系統的制造工藝，其特征在于包括下列步驟1)首先利用光刻，刻蝕，鍵合加工制造具有內部通道的懸臂梁，其中通道長在 140 170 μ m之間，通道界面為矩形，長在20 30μπι，寬Ιμπι;2)懸臂梁上利用電子束直寫，刻蝕，套刻形成探針和探針兩側的圓孔與通道相連。3)懸臂梁另一端連接微量控制系統。圖1是系統使用基本結構圖。該系統具有內部通道結構，用于完成注射功能，還可以檢測和成像，并可以與原子力顯微系統進行連接完成基因進入細胞的控制和評價，組成更大的檢測系統。
圖2包括帶有通道的探針13，硅片14和17，通道15和16。圖3和圖4分別是探針通道和探針尖端兩側通道的制造工藝。具體工藝結合附圖3，4說明如下首先利用計算機輔助設計(CAD)軟件(如PR0E、UG等)設計懸臂梁內部流通管道和探針結構，懸臂梁內部通道長在140 170 μ m之間，通道界面為矩形，長在20 30 μ m, 寬Iym ；探針針尖直徑為8nm IOnm之間然后設計刻蝕所用的掩膜板。圖3硅片涂覆光刻膠18，曝光19，顯影20，刻蝕21，得到帶有凹槽結構的硅片22， 通過鍵合封裝完成具有內部通道的懸臂梁。圖4探針材料采用100金相的硅片，涂敷電子束光刻膠23，進行電子束直寫M，刻蝕出探針25，制作定位基準沈，確定針尖兩側的圓孔27，套刻出針尖兩側的圓孔觀，刻蝕得到懸臂梁另一端與微量控制系統相連接。刻蝕時應保證接觸力量均勻，脫模時，應仔細剝離，避免脫模時損壞內部通道結構和針尖。由于基因尺寸極小，如一對堿基對的長度為0. 34nm,目前可以將21 22個堿基序列送入細胞改變基因。而這21 22的堿基序列長度在6 7個納米左右，因此要對基因進入細胞進行操作同時檢測細胞發生的變化，現有的技術手段無法達到。首先制造兼具注入功能納米檢測探針，實現基因進入細胞的精確導入和監控的一體化系統集成，完成向細胞內可控注入基因，利用原子力顯微鏡的直觀性和直接獲得摩擦力的性能檢測細胞膜表面的變化，在細胞膜表面進行標記，將作用區域精確到納米范圍，排除傳統方法存在的不能精確操作性和不可控性，揭示基因進入細胞的機制，細化基因進入細胞時細胞膜的變化所對應的生物學表現，澄清目前基因治療研究中的機理問題。
權利要求
1.一種基因進入細胞檢測和注射一體化系統，包括原子力顯微鏡中的激光發生器 (1)、反射鏡⑵、光電檢測器⑶，探針(4)、探針內注射管道(5)、微量控制系統(6)與探針 G)、探針內注射管道( 組成的原子力顯微鏡探針連接；激光發生器(1)發出的激光打在探針(4)的懸臂梁上，通過反射鏡(2)被光電檢測器讀到，其特征在于，探針(4)與懸臂梁的一端連接，懸臂梁內有管道，探針(4)兩側開孔與懸臂梁內的管道接通，懸臂梁的另一端連接微量控制系統(6)，探針針尖直徑為8nm lOnm，懸臂梁內部管道的矩形截面長20 30 μ m, ^ 1 μ m。
2.根據權利要求1所述的一種基因進入細胞檢測和注射一體化系統，其特征在于，微量注射系統又包括減速裝置(7)、微量泵(8)、控制系統(9)和信號檢測(10)。
3.一種基因進入細胞檢測和注射一體化系統制備工藝，其特征在于，具體步驟如下1)硅片上旋涂光刻膠厚度0.4 0. 9 μ m，曝光45秒，刻蝕得到溝槽結構，然后通過鍵合技術形成具有內部通道結構的懸臂梁；2)在懸臂梁一端旋涂電子束光刻膠厚度0.5 μ m，刻蝕得到直徑8 10納米的針尖，制作定位基準，針尖兩側套刻出直徑200 300nm的圓孔；3)微量控制系統(6)通過控制系統調節微量泵，由減速裝置實現微流體的準確進入細胞。
4.根據權利要求3所述的一種基因進入細胞檢測和注射一體化系統制備工藝，其特征在于，所述的檢測注射一體化系統，該系統基本組成單元為具有內部通道的探針和懸臂梁。
5.根據權利要求3所述的系統，其特征在于，探針G)、探針內注射管道(5)所采用的材料是硅或氮化硅。
6.根據權利要求3所述的系統，其特征在于，所采用的細胞是腫瘤細胞或正常細胞。
全文摘要
本發明公開了一種新的基因進入細胞檢測和注射一體化系統及其制備工藝，其主要內容是以具有微米內部通道的懸臂梁和納米針尖為基本單元，構建基因進入細胞的檢測和評價系統，即首先通過刻蝕、鍵合的方法構建出具有內部通道的亞微米級通道的懸臂梁，然后通過電子束直寫，套刻等方法在懸臂梁上制造出納米針尖，針尖與懸臂梁連通，懸臂梁另一端連接微量注射控制系統，所制得的系統可以進一步與原子力顯微系統集成用于基因進入細胞的檢測和注射。
文檔編號C12N15/89GK102352312SQ20111020402
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月21日 優先權日2011年7月21日
發明者劉亞雄, 李滌塵, 賀健康, 連岑, 高琨 申請人:西安交通大學, 西安瑞特快速制造工程研究有限公司