專利名稱：非小細胞肺癌中miR-96基因的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種非小細胞肺癌中miRNA基因的應用。
背景技術：
微RNA (microRNA，miRNA )功能調控是當前生命科學的重要前沿。miRNA是一類長度為21-22 nt的非編碼RNA分子，其通過轉錄后基因沉默調控靶基因的活性。對miRNA生物學功能及其調控的靶基因的研究表明，miRNA在腫瘤發生過程中起重要作用，miRNA很有可能成為癌癥治療的新途徑。miRNA與靶基因mRNA的非編碼序列(3' -UTR或5' -UTR)存在著一對多的關系。miRNA通常是在細胞核內由RNA聚合酶II轉錄，初級轉錄產物為pr1-miRNA,pr1-miRNA被核酸酶RNase III Drosha和其輔助因子Pasha加工成為發卡型前體miRNA (pre-miRNA),pre-miRNA被轉運蛋白Exportin 5從細胞核輸出到細胞質，之后被Dicer酶復合物剪切成為短的miRNA雙鏈，在解旋酶的幫助下miRNA雙鏈被解離，成熟的miRNA和RNA誘導的沉默復合體(R ISC)結合。miRNA與RISC的復合體通過堿基配對可與靶基因mRNA 3' -UTR中的互補序列相結合，隨即依據miRNA與其靶基因序列的互補性高低，或是抑制蛋白質翻譯，或是引發mRNA降解，從而負調控靶基因的表達。肺癌是導致全球癌癥死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人數超過100萬，并且每年新增病例120萬。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常見的癌癥,其中約80%的肺癌是非小細胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC),其5年存活率僅為15%,主要原因是缺乏有效的針對肺癌的早期診斷和治療手段。miRNA通過調控靶基因mRNA的翻譯，在肺癌發生、發展及轉移發揮重要作用。miRNA可能成為新的肺癌早期診斷和癌癥進程相關的標記物，有助于疾病的準確診斷及個性化治療。這一切設想的實現必須建立在miRNA靶基因功能研究工作的基礎上。

發明內容
本發明的目的之一在于提供一種miR-96基因在抑制非小細胞肺癌癌細胞增殖中的應用。本發明的目的之二在于提供一種miR-96基因在促進非小細胞肺癌癌細胞凋亡中的應用。本發明的目的之三在于提供一種miR-96基因在H1299細胞系中下調CREBl表達水平的應用。本發明首先利用Solexa測序技術，利用qRT_PCR技術檢測多種非小細胞肺癌系中miR-96的表達量變化，并從中選擇一種miR-96表達下調最明顯的非小細胞肺癌系，在此細胞系中過表達miR-96以檢測其功能。細胞轉染所用的轉染試劑為Lipo2000(Invitrogen)。為了降低細胞密度、試劑用量及轉染等因素造成的孔間差異，保證實驗的可靠性和重復性，本實驗中每個轉染樣品設置了 3個復孔。接種細胞時，每孔接種的細胞數量盡量保持一致，并且細胞在各孔的表面平均分布。細胞總RNA的提取采用生工生物公司的Trizol試劑。具體提取步驟如下:
丄J直接在培養板中加入Total RNA Extractor裂解細胞,每10 cm2面積加I ml TotalRNA Extractor，用移液器吹打混勻；
②將裂解后樣品或勻漿液室溫放置5-10min，使得核蛋白與核酸完全分離；
③加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15 sec,室溫放置3 min。12, 000 rpm 4 °C離心10
min ；
吸取水相轉移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min ；
⑤12,000 rpm 4 °C 離心 10 min,棄上清；
⑥加入Iml 75%乙醇洗漆沉淀，12，000 rpm 4 V離心3 min,棄上清,室溫干燥5-10
min ；
⑦加入30-50 1 RNase-free ddH20，充分溶解RNA，將所得到的RNA溶液置于-70 V
保存或用于后續試驗。反轉錄PCR 米用 Takara 公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA SynthesisKit。由于miRNA與mRNA不同,miRNA不具有Poly (A)結構,但本轉錄試劑盒可以同時對樣品中的miRNA以及它的small non-coding RNA進行Poly(A)加尾反應,然后利用UniversalAdaptor Primer將經過加尾的RNA以及mRNA進行反轉錄反應得到cDNA,并引入UniniRqPCR Primer的結合位點，利用這一位置對樣品中任何cDNA進行定量PCR反應。用來檢測的儀器為Bio-Rad公司的iQ5系統，試劑為TaKaRa公司的SYBR Green Mix。這種試劑里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix, SYBR Green dye。U6用來作為內參基因。本實驗所用到的引物為:miR-96 引物 Forward:5' - TTTGGCACTAGCACATTTTTGCT-3'，Reverse:為 Un1-miR qPCR primer ；U6 引物為 Forward:5' -CTCGCTTCGGCAGCACA- 3'，Reverse:5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。第二步，利用CCK8技術和流式細胞儀技術，分別檢測過表達miR-96后H1299細胞的增殖和凋亡情況的變化。非小細胞肺癌H1299細胞被培養在含有10%胎牛血清的1640培養基中。CO2培養箱中含有5% 0) 2并且濕潤，溫度為37°C。為了降低細胞密度、試劑用量及轉染等因素造成的孔間差異，保證實驗的可靠性和重復性，本實驗中每個轉染樣品設置了 3個復孔。接種細胞時，每孔接種的細胞數量盡量保持一致，并且細胞在各孔的表面平均分布。轉染步驟如下:①轉染非小細胞肺癌細胞的前一天，接種適當數量的細胞至培養板中，每孔加入不含抗生素的培養基，使轉染時的細胞密度能夠達到50%。轉染時，細胞密度是影響轉染效率的關鍵因素之一，細胞生長過度會削弱細胞活力，降低細胞的轉染效率一準備mimic-lipo2000混合液:a.稀釋miRNA mimic:用50 1不含血清培養基Opt1-MEM稀釋miRNA mimics,使加入細胞中的終濃度為50 nmol/L,輕輕混勻，室溫孵育5 min ；b.稀釋lipo2000:用60 1不含血清的Opt1-MEM稀釋I 1 lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min ；c.將a與b輕輕混勻，室溫孵育20 min。注意:稀釋好的lipo2000長時間放置可能導致轉染試劑活性的降低，應盡量在25 min之內與稀釋好的mimics混合。在混合試劑時，不能劇烈吹打或震蕩，手指輕彈管壁即可，過度用力可能會破壞脂質體的結構和miRNA-mimics-lipo2000混合物的形成；③將miRNA-mimics-lipo2000混合液加入含有細
胞及培養液的培養孔中，輕輕混勻；④將培養板置于37°C的CO2培養箱中48 h。培養6 h后，將孔里含有mimics-1 ipo2000混合液的培養基移去，更換新鮮培養基。本實驗采用D0JIND0公司的CCK8 (Cell Counting Kit_8)試劑盒。該試劑盒利用了水溶性四銼鹽-WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)_5_ (2，4-二磺基苯)-2H-四銼單鈉鹽)。它在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原成水溶性的甲瓚染料。它在450 nm吸光度下可直接在96孔板中讀出，無需額外處理，由450 nm處吸光度確定的CCK8的量直接與培養物中活細胞的數量成正比。熒光染料碘化丙啶(PI)是一種可對DNA染色的細胞核染色劑，常用于細胞凋亡檢測。PI是一種溴化乙錠的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿過活細胞膜，卻能穿過破損的細胞膜而對核染色。AnnexinV是一種檢測細胞凋亡的試劑，在正常的細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂雙層內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸由脂膜內側翻向外側。AnnexinV作為一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。將AnnexinV與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區分開來。
第三步，通過Targetscan軟件預測miR-96的靶基因，并將其mRNA的:V -UTR連接至pGL-3載體。將miR-96與重組質粒共轉入HEK-293T細胞，48 h后檢測熒光強度。人胚腎細胞HEK-293T (購自中科院生化細胞所細胞庫)被培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中。CO2培養箱中含有5% C0 2并且濕潤，溫度為37°C。通過查找NCBI數據庫，查找到CREBl基因的mRNA序列，進而查找到該mRNA的3' -UTR序列。查找TargetScan數據庫，發現在該mRNA的:V -UTR序列的1691-1697位點上含有miR-96種子序列的結合位點。設計引物，進行PCR，將該位點包含在內。CREB1-3' -UTR引物Forward:5' - GCTCTAGAGCCACAACCTGAAAGACAAA -3'，Reverse: 5' -CGGAATTCGTCCCACATTCAAATCCTCTC-3'。該引物引入了油a I和I兩個酶切位點。PCR的退火溫度為55°C，產物長度為619 bpo第四步，在H1299細胞中過表達miR-96，檢測CREBl mRNA水平變化。非小細胞肺癌細胞株H1299被培養在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中。CO2培養箱中含有5% C0 2并且濕潤，溫度為37°C。細胞轉染所用的轉染試劑為Lipo2000 (Invitrogen)0為了降低細胞密度、試劑用量及轉染等因素造成的孔間差異，保證實驗的可靠性和重復性，本實驗中每個轉染樣品設置了 3個復孔。接種細胞時，每孔接種的細胞數量盡量保持一致，并且細胞在各孔的表面平均分布。之后提取RNAdiJ用 Takara 公司的 Primescript RT Master Mix perfect Real Time 試劑盒進行反轉錄，再進行qRT-PCR檢測。用來檢測的儀器為Bio-Rad公司的iQ5系統，試劑為TaKaRa公司的SYBR Green Mix。這種試劑里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix, SYBR Greendye。18S用來作為內參基因。本實驗所用到的引物為:CREBl引物Forward:5 '-CCACTGTAACGGTGCCAACT-3 '，Reverse:5 ' - GCTGCATTGGTCATGGTTAATGT-3 ' ;18S 引物Forward:5' -CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3' , Reverse:5' -TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3'。H1299細胞系中miR-96基因通過與其靶基因CREBl的mRNA的3 ^ -UTR互補，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接降解靶mRNA。結合生化與分子生物學實驗，確定了在H1299細胞系中miR-96與CREBl有相互作用，這種相互作用影響了 H1299細胞的增殖、凋亡等生命活動。本實驗通過軟件預測、構建載體，同時對靶基因的3' -UTR利用試劑盒進行突變，然后在HEK293T細胞中利用熒光素酶報告基因分析驗證了 CREBl是miR-96的靶基因，并在H1299細胞中利用qRT-PCR技術，進一步驗證了該發現。所公開的為在H1299細胞系中CREBl是miR-96的靶基因的首次報道，該發明在臨床上為利用miRNA來診斷和治療非小細胞肺癌，以及提供藥物靶點方面提供了一定的應用價值。


圖1非小細胞肺癌細胞系中miR-96的相對表達含量；
圖2過表達miR-96后抑制H1299細胞的增殖；
圖3過表達miR-96后促進H1299細胞的凋亡，其中A為轉染了陰性對照NC后對細胞凋亡的影響情況；B為轉染了 miR-96 mimics后對細胞凋亡的影響情況；
圖4為miR-96在不同物種之間的保守結合位點；
圖5為miR-96與靶基因CREBl野生型與突變型的結合位點情況；
圖6為miR-96與靶基因CREBl野生型與突變型雙熒光酶報告分析柱狀圖。
具體實施方式
下面將結合具體實例進一步闡述本發明。這些實例僅用于闡述本發明，而不用于限制本發明的范圍。下列實例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例一:根據Solexa測序結果，確定miR-96在非小細胞肺癌細胞系中低表達 本發明所用到的k-ras基因突變小鼠肺癌模型(L703T2)和正常肺癌模型(L1805)由中
科院生化細胞所季宏斌教授課題組提供。將正常小鼠的肺組織和患有非小細胞肺癌的小鼠的肺組織取樣，用TRIZOL法裂解組織，加入氯仿，待蛋白與核酸分層，離心之后吸取上清并加入異丙醇沉淀，再次離心后以乙醇洗滌沉淀，晾干，獲得總RNA。利用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒構建兩種組織的cDNA文庫，以oligo dT為引物進行反轉錄,通過變性反應和反轉錄2步獲得后續實驗的cDNA。將樣品利用Solexa方法測序(Solexa測序由華大基因公司完成)，進一步研究發現在非小細胞肺癌細胞系中miR-96的表達顯著下調(參見圖1)。實施例二:miR-96對H1299細胞增殖的影響
將H1299細胞均勻的鋪在96孔板中，使用的培養基為1640。24 h后將miR-96的mimics通過lipo2000轉染試劑，通過無血清培養液的共孵育后轉入H1299細胞中，轉染6 h后換掉細胞培養液，放入新鮮的培養液，然后立即加入CCK8試劑，在培養箱里培養2.5 h，再吸出來在酶標板里測，每隔24 h測量一次，檢測波長為450 nm。檢驗發現，轉染組與對照組相比較，其吸光度有顯著的下降，也即轉染了 miR-96的細胞的增殖速度顯著低于對照組，說明miR-96具有抑制H1299細胞增殖的作用(參見圖2)。
實施例三:miR-96對H1299細胞凋亡的影響
將H1299細胞均勻地鋪在6孔板中，24 h后將miR-96的mimics通過lipo2000與無血清培養液1640共孵育后轉入H1299細胞中，轉染6 h后將細胞培養液換為新鮮培養液。轉染 48 h 后，將收集到的細胞用 annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)凋亡檢測試劑盒(Sigma-Aldrich，USA)染色細胞。用流式細胞技術檢測H1299細胞的凋亡情況。結果表明，轉染了 miR-96的H1299細胞凋亡率明顯大于對照組(參見圖3)。實施例四:雙熒光素酶報告基因分析
將CREBl mRNA的3' -UTR (619 bp)連接在pGL_3質粒上，該質粒上含有SV40的啟動子，連接上的3' -UTR包含了 miR-96與CREBl的結合位點。用lipo2000轉染試劑把miR-96的mimics與構建好的質粒共轉入HEK-293T細胞中，并同時轉入pRL質粒作為背景信號，在轉染6 h后將培養液換為新鮮培養液。轉染48 h后,用Promega公司的雙突光素酶報告基因分析試劑盒檢測PGL和pRL的熒光表達。轉染的質粒的終濃度為400 nmol/L,mimics的終濃度為20 nmol/L。結果發現，轉染了 miR-96的HEK-293T細胞中雙熒光素酶的表達顯著低于對照組。之后利用突變試劑盒做了 CREBl 3' -UTR的點突變，用lip2000轉染試劑把miR-96的mimics與構建好的點突變質粒共轉入HEK-293T細胞中。轉染48 h后，用promega公司的雙突光素酶報告基因分析試劑盒檢測。結果發現,轉染了 miR-96的HEK-293T細胞中雙熒光素酶的表達與對照組沒有什么變化，這些都說明CREBl是miR-96的靶基因(參見圖4)。
實施例五:qRT_PCR驗證miR_96對H1299細胞內源CREBl基因的抑制作用
將 H1299 細胞均勻地鋪在 6 孔板中，24 h 后將 miR-96 mimics,NC,miR-96 inhibitor、ant1-NC通過lipo2000與無血清培養液1640共孵育后轉入H1299細胞中，轉染6 h后將細胞培養液換為新鮮培養液。轉染48 h后，收集細胞，提取RNA，利用Takara公司試劑盒反轉錄為cDNA，之后進行qRT-PCR檢測。結果表明，miR-96對CREBl具有抑制作用(參見圖5和圖6。盡管本發明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和范圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明范圍內的變動。
權利要求
1.一種miR-96基因在抑制非小細胞肺癌癌細胞增殖中的應用。
2.—種miR-96基因在促進非小細胞肺癌癌細胞凋亡中的應用。
3.一種miR-96基因在H1299細 胞系中下調CREBl表達水平的應用。
全文摘要
本發明涉及一種非小細胞肺癌中miRNA基因的應用。H1299細胞系中miR-96的一種靶基因CREB1，miR-96通過與靶基因mRNA的3′-UTR互補，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接降解靶基因的mRNA。本發明確定了在H1299細胞系中miR-96與CREB1有相互作用影響了H1299細胞的增殖、凋亡等生命活動。本發明通過軟件預測、構建載體，再在HEK293T細胞中利用熒光素酶報告基因分析，初步驗證了CREB1是miR-96的靶基因，接著在H1299細胞中利用過表達miR-96、qRT-PCR的技術，進一步驗證了該發現。所公開的為在H1299細胞系中CREB1是miR-96的靶基因的首次報道，該發明在臨床上為利用miRNA來診斷和治療非小細胞肺癌，以及提供藥物靶點方面提供了一定的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK103224983SQ20131005623
公開日2013年7月31日 申請日期2013年2月22日 優先權日2013年2月22日
發明者金由辛, 侯品品, 申雨晴, 王德韜, 馬中良, 韋嘉勵 申請人:上海大學