專利名稱：一種含組成型啟動子pPGK和G418抗性基因的釀酒酵母表達載體及其構建方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學基因工程領域，主要涉及一種釀酒酵母用G418為篩選標記的表達載體的構建方法，具體地涉及釀酒酵母以G418為選擇性標記同時質粒上含有 PPGKl啟動子的質粒的構建方法。
背景技術：
大腸桿菌E. coli表達系統是基因表達技術中發展最早，目前應用最廣泛的經典表達系統，但外源蛋白在大腸桿菌E. coli中常以不溶性的包涵體形式表達，產物純化困難。同時，大腸桿菌作為表達宿主，尤其是對于真核基因的表達，翻譯后的加工修飾體系不完善，表達的產物活性低或者沒有活性。為了克服大腸桿菌表達系統的不足，需要發展新的真核表達系統。酵母表達系統擁有轉錄后加工修飾功能，操作簡便，成本低廉，適合于穩定表達有功能的外源蛋白質，而且可大規模發酵，是最理想的重組真核蛋白質生產制備用工具。釀酒酵母是一種極為重要的工業微生物，也是一種重要的基因真核表達系統，常被用于生產多種生物物質，如氨基酸、酶、谷胱甘肽、乙醇等等。由于釀酒酵母全基因組已經測序，它被美國食品與藥品安全管理局(Food and Drug Administration，FDA)認證為安全的微生物，可以用于食品、制藥等行業。但是，在酵母的基因操作領域常用的釀酒酵母表達載體如pTO212、pUG36多為營養缺陷作為篩選標記。這就要求宿主菌必須是營養缺陷型，大大限制了酵母菌基因工程研究中的受體菌的使用單位。使用各種理化因素將一株完整營養型的酵母通過篩選營養缺陷是目前常用而又最常見的方法。但是，誘變篩選是一個繁瑣而又費時費力的過程，誘變存在很大的不確定性，而且容易產生回復突變。同時，篩選得到的營養缺陷菌株應用于實際生產中，需要添加必須的營養成分，無疑增加了生產成本。雖然， 亦可以通過基因敲除手段構建營養缺陷菌株，但是存在著操作成本高，需要一系列基因操作，費時費力。因此常用的營養缺陷為篩選標記的質粒對于釀酒酵母基因工程操作過程中釀酒酵母轉化體系的建立帶來很大不便。G418是一種氨基糖苷類抗生素，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質合成， 對原核和真核等細胞都有毒性，是穩定轉染最常用的選擇試劑。已有研究表明，來自大腸桿菌轉座子Tn903的卡那霉素抗性基因與表達調控序列來自絲狀真菌Astibya gossypii (針孢酵母)的TEF基因相融合，所組成的KanMX元件可以在酵母細胞中表達氨基糖苷磷酸轉移酶，將G418轉變成無毒形式，從而賦予酵母細胞以G418抗性。由于G418可用于選擇細菌、酵母，植物和哺乳動物細胞。可以以G418作為篩選標記，大大簡化了重組轉化酵母的篩選過程。將G418基因從pFA6a-GFPS65T-kanMX6表達載體上克隆下來連接到常用的表達載體上，使該載體獲得G418抗性，有利于釀酒酵母轉化子的篩選
發明內容
本發明是克服上述技術的不足，構建出一種用G418為篩選標記釀酒酵母表達載體，并提供了一條可行的釀酒酵母表達載體構建方法。本發明的目的通過以下技術方案來實現本發明以pYES 2. 0載體作為基本骨架，以質粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6為模板， 采用PCR的方法克隆獲得KanMX的抗性基因；同樣以釀酒酵母基因組DNA為模板，采用PCR 的方法獲得PGK啟動子片段，構建出具有G418抗性的組成型釀酒酵母表達載體；并以構建的表達載體，采用醋酸鋰方法轉化工業釀酒酵母二倍體菌株，使得轉化后的菌株可以耐受 120ug/ml的G418，使轉化子的篩選簡便易行。1、KanMX抗性標記基因的克隆根據pYES 2. 0酶切位點特性，選擇KanMX基因的插入位點，設計克隆KanMX基因的引物，兩端分別含有Nhe I/Nde I酶切位點，以質粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6為模板，用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，電泳回收目的片段，克隆到pMDIS-T載體上，轉入大腸桿菌 E. coli DH5a，測序。命名該克隆載體為pMD18-T_KanMX。2、G418抗性載體的構建分別用限制性內切酶Nhe I和Nde I酶切ρYES 2. 0和pMD18_T_KanMX，回收相應片段，用T4 DNA連接酶進行連接，轉化E. coli DH5 α感受態細胞。提取質粒進行酶切鑒定。 載體命名為pYES-Kanl。3、PGK啟動子的克隆根據pYES 2. 0質粒啟動子pGAL酶切位點特性，選擇組成型啟動子pPGK基因的插入位點，設計引物，引物兩端分別引入Age I和EcoR I酶切位點，以釀酒酵母染色體DNA為模板，用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，電泳回收目的片段，克隆到pMDIS-T載體上，轉入大腸桿菌E. coli DH5a，測序。命名該克隆載體為pMD18_T_PGK。4、組成型G418抗性載體的構建分別用限制性內切酶Age I和EcoR I酶切pYES-Kanl和pMD18_T_PGK，回收相應片段，用T4 DNA連接酶進行連接，將克隆的PGK啟動子構建至pYES-Kanl相應位置，轉化 E. coliDH5a感受態細胞，提取質粒進行酶切鑒定。即得到釀酒酵母組成型表達載體，載體命名為 pPGK-KanMX。本發明通過將構建的重組質粒，采用醋酸鋰方法轉化釀酒酵母工業菌株(可以耐受80ug/ml G418)，用G418抗性平板篩選轉化子(120ug/ml)，使得該菌株可以在120ug/ml 的G418，表明本發明方法構建的質粒轉化釀酒酵母可以增加G418抗性，使轉化子的篩選簡單易行，大大簡化了釀酒酵母遺傳轉化過程。通過實施本發明具體的技術指標，實現本發明內容，達到以下有益效果。本發明通過提供一種釀酒酵母組成型表達載體及其構建方法，為探索一條可行的釀酒酵母表達載體構建方法或構建出商品化的釀酒酵母表達載體將具有重要的意義。


圖1 :KanMX抗性標記基因的PCR電泳圖，其中M是分子量標準DL2000，1為擴增得到的目的基因片段。圖2 重組質粒載體pMD18-T-KanMX的PCR鑒定的電泳圖，其中M是分子量標準DL2000,1，2，3，4，5，6，7為PCR擴增得到的KanMX基因產物。圖3 重組質粒pYES-Kanl的酶切電泳圖，其中，M是分子量標準DL2000，1為表達載體的酶切產物，2為非重組質粒。圖4 :PGK啟動子的基因的PCR電泳圖，其中，M是分子量標準DL2000，1為擴增得到的目的基因片段。圖5 重組質粒pYES-KanMX的酶切電泳圖，其中，M是分子量標準DL2000，1為表達載體的酶切產物，2為非重組質粒。圖6 含G418為抗性篩選標記的組成型表達載體的質粒圖譜。
具體實施例方式通過以下實例對本發明作進一步的詳細說明，但并不以此來限定本發明。實施例1 實驗材料和試劑1. 1菌株與質粒大腸桿菌E. coli DH5 α、釀酒酵母均為本實驗保存。質粒pFA6a-GFPS65T_kanMX6 為本實驗室保存，克隆載體PMD18-T購自TaKaRa寶生生物工程(大連)有限公司，質粒pYES 2. 0 購自 hvitrogen 公司。1. 2主要生化試劑質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；高保真DNA聚合酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase、T4 連接酶、限制性內切酶 EcoRI、Nhe I,Nde I 均購自寶生生物工程(大連)有限公司。限制性內切酶Age I、DNA膠純化回收試劑盒購自！^rmentas 公司。引物合成及菌液測序由南京金絲瑞生物科技有限公司完成。實施例2引物設計根據質粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6中的KanMX的基因序列結合ρYES 2. 0質粒序列特征設計引物并引入合適的酶切位點，引物如下KanMX6基因序列的克隆引物Kan-F 見序列表中序列1 (引入Nde I酶切位點)Kan-R 見序列表中序列2 (引入Nhe I酶切位點)含KanMX基因質粒pMD18-T_KanMX的PCR鑒定引物RV-M 見序列表中序列3M13-47 見序列表中序列4啟動子pPGK基因序列的克隆引物pPGK-F 見序列表中序列5 (引入Age I酶切位點)pPGK-R 見序列表中序列6 (引入EcoR I酶切位點)實施例3KanMX基因的克隆以質粒 pFA6a-GFPS65T-kanMX6 為模板，以 Kan_F、Kan-R 為引物，擴增 KanMX 基因。 擴增條件為:94V 5min ；94°C變性 30s，55°C退火 lmin20s，72°C延伸 2min，30 個循環，72°C
5延伸lOmin。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。實施例4擴增產物的克隆和測序4. IPCR產物的回收將KanMX基因用Silica Bead DNA Gel Extraction Kit(Fermentas)回收試劑盒進行特異性擴增產物的回收純化，操作步驟如下(1)在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳中電泳，使擴增產物分離形成單一的目的條帶，切下目的條帶放入干凈的離心管中；(2)按3倍膠的重量體積加入溶膠液，即IOOmg加入300ul的binding buffer ； 55°C水浴5min至膠完全溶解；溶解后溶液顏色為黃色。(3)加入混懸均勻的硅粉懸液3-5ul，55°C水浴5min，讓DNA與硅粉結合，其間偶爾搖動保持硅粉懸浮；(4) 12000rpm離心5s，使DNA/硅粉沉淀，棄去廢液；(5)加入500ul漂洗液(washing buffer)漂洗，重懸硅粉；12000rpm離心5s，棄
上清。重復漂洗3次；(6) 37 °C培養箱培養20-30min，以去除乙醇；用滅菌的雙蒸水或者TE緩沖液 5-10ul懸浮硅粉，55°C水浴5min，12000rpm離心5s，上清即為回收的目的片段。4. 2回收產物的連接和轉化回收產物連接到pMDIS-T載體上，按照TaKaRa公司的連接試劑盒說明書進行操作。轉化E. coli DH5a感受態采用熱激法進行。(1)將回收的純化的PCR產物連接到pMDIS-T載體上，在離心管中分別加入下列成分回收產物3. 5ul ；T載體Iul ；2XT4Buffer 5ul ；T4DNA連接酶0. 5ul ；輕輕混勻后4°C連接 12-lMir ；(2)從_70°C冰箱中取出IOOul感受態細胞，至于冰上解凍后加入IOul的連接產物，輕輕混勻，冰浴30min ；(3) 42°C水浴熱激90s，迅速置冰上冷卻2_5min ；(4)向管中加入Iml LB液體培養基，混勻后37°C培養90min ；(5)4000rpm 離心 5min，上清棄去 850ul，加入 Amp 1.5_3ul(濃度為 100mg/ml)，取 200ul涂布含有50-100ug/ml Amp的LB篩選平板，37°C倒置培養12_16hr ；(6)待平板上長出菌落后即為重組子。4. 3質粒DNA提取用滅菌牙簽挑取含Amp的LB平板上的單菌落，接種于3ml含Amp (50ug/ml) LB液體培養基，37°C振蕩培養過夜。質粒提取按照天根生化科技(北京)有限公司試劑盒使用操作手冊的方法進行。(1)取500ul過夜培養的菌液，12000rpm離心lmin，棄去上清；(2)用250ul已加RNaseA的溶液I均勻懸浮細菌沉淀，室溫放置5min ；(3)加入250ul溶液II，溫和上下翻轉4_6次混勻，使菌體充分裂解；(4)加入350ul溶液III，上下翻轉4-6次混勻，12000rpm離心IOmin ；(5)吸取離心的上清并轉到DNA制備管中，12000rpm離心Imin ；
(6)將制備管放回離心管中，加入500ul的Buffer Wl，12000rpm離心Imin ；棄濾液；(7)將制備管放回離心管中，加入700ul的Buffer W2，12000rpm離心Imin ；棄濾
液；重復洗滌一次。(8)將制備管移入新的干凈的離心管中，在膜正中央處加入30-40ul的滅菌的雙蒸水，室溫靜置Imin ； 12000rpm離心lmin。將得到的質粒于_20°C保存。4. 4質粒的PCR鑒定及測序根據pMD18-T載體圖譜，以外源片段插入的兩端引物(RV_M/M13_47)對提取的質粒進行PCR鑒定。將鑒定的陽性克隆的菌液，送南京金絲瑞生物科技有限公司測序部進行基因測序。命名該載體為pMD18-T-KanMX，全長為4058bp，其特征在于所含的KanMX基因可作為構建其他表達載體的供體。實施例5載體pMD18-T_KanMX 和 pYES 2. 0 質粒的酶切將質粒pYES 2. 0和測序后正確的質粒pMD18-T-KanMX，首先用限制性內切酶Nde I進行酶切。酶切體系為50ul，由2ul Nde I (10U/ul)、5ul IOXH buffer與38ul滅菌的雙蒸水組成，37°C過夜酶切。酶切后加入1/10體積的3mol/L的醋酸鈉(pH 5. 2),2.5倍體積的無水乙醇進行沉淀。_20°C沉淀30-50min，12000rpm離心lOmin，用70%的乙醇洗一次。 純化后使用限制性內切酶Nhe I進行二次酶切。酶切體系為50ul，由2ul Nhe I (10U/ul)、 5ul IOXM buffer和40ul滅菌的雙蒸水組成，37°C過夜酶切。質粒pYES 2. O和測序后正確的質粒pMD18-T_KanMX后經兩次單酶切后回收的方法按照實施例4中的4.1進行。實施例6G418抗性載體的構建將經Nde I和Nhe I酶切后的質粒pYES 2. O和pMD18-T_KanMX的酶切產物，在4°C 條件下連接12-1他1·，即可以獲得以G418為抗性篩選標記的質粒pYES-Kanl。連接體系為 10ul，由 lullOXT4 DNA 連接 buffer、0. 5ul T4 DNA 連接酶(350U/ul)、限制性酶切后的質 SpYES 2. O片段和KanMX基因序列片段分別為1. 2ug和5ug，以滅菌的雙蒸水補足至10ul。將連接產物按照實施例4中的4. 2進行轉化保存，按照實施例4中4. 3的方法進行質粒的提取。以提取后的質粒為模板，以引物Kan-F/Kan-R進行PCR驗證。實施例7釀酒酵母基因組DNA的提取(1)取細1酵母菌4000rpm離心5min后收集沉淀，再用等體積的無菌蒸餾水洗滌 1-2 次；(2)將細胞沉淀用 200ul 裂解緩沖液(2% (v/v) Triton X-100U % (v/v) SDS, IOOmM NaClUOMm Tris-HCl pH 8. OUmM EDTA ρΗ 8.0)中重新懸浮，然后加入約0. 3g玻璃珠和200ul的1 1苯酚/氯仿混合液；(3)漩渦振蕩l-2min ；加200ul TE (pH 8. 0)，輕輕倒轉混勻；(4) 12000rpm離心IOmin取上清，加入等體積的酚氯仿異戊醇Q5 24 1), 12000rpm離心lOmin，取上清；重復抽提一次；
(5)加入2. 5倍體積預冷的無水乙醇和1/10體積的醋酸鈉(3M，pH5. 2)，_20°C冰箱放置 30-40min ;12000rpm 離心 lOmin，棄上清；加入 600-800ul 75% (ν/ν)洗滌一次，倒置晾干；(6)待乙醇完全揮發后，加20_40ul ddH20,室溫放置，使DNA溶解；實施例8pPGK啟動子基因的克隆以釀酒酵母基因組DNA為模板，以pPGK-F、pPGK-R為引物，擴增pPGK基因。擴增條件為:94V 4min ；94°C變性 lmin，54°C退火 lmin20s，72°C延伸 lmin20s，30 個循環，72°C 延伸15min。擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。pPGK基因PCR產物的回收、回收產物與pMD18_T連接和轉化、質粒pMD18_T_PGK提取、質粒pMD18-T-PGK的PCR鑒定及測序與實施例4的操作步驟相同。實施例9載體pYES-Kanl 和質粒 pMD18_T_PGK 的酶切將質粒pYES-Kanl和測序后正確的質粒pMD18_T_PGK，首先用限制性內切酶Age I 進行酶切。酶切體系為50ul，由2ul Age I (10U/ul)、5ul IOXbuffer O與35ul滅菌的雙蒸水組成，37°C過夜酶切。酶切后加入1/10體積的3mol/L的醋酸鈉(pH 5. 2),2.5倍體積的無水乙醇進行沉淀。-20°C沉淀30-50min，12000rpm離心lOmin，用70%的乙醇洗一次。 純化后使用限制性內切酶Nhe I進行二次酶切。酶切體系為50ul，由2ul EcoR I (10U/ul)、 5ul IOXHbuffer和!35ul滅菌的雙蒸水組成，37°C過夜酶切。質粒pYES-Kanl和測序后正確的質粒PMD18-T-PGK后經兩次單酶切后回收的方法按照實施例4中的4.1進行。實施例10組成型載體PPGK-KanMX的構建將經Age I和EcoR I酶切回收后的質粒pYES-Kanl和pMD18-T_KanMX的酶切產物，在4°C條件下連接12-16hr，即可以獲得以G418為抗性篩選標記組成型質粒pPGK-Kan。 連接體系為 IOul，由 Iul IOXT4DNA 連接 buffer,0. 5ul T4DNA 連接酶(350U/ul)、限制性酶切后的質粒pYES-Kanl片段和pPGK基因序列片段分別為1. 2ug和5ug，以滅菌的雙蒸水補足至IOul。將連接產物按照實施例4中的4. 2進行轉化保存，按照實施例4中4. 3的方法進行質粒的提取。以提取后的質粒為模板，以限制性內切酶Age I和EcoR I進行酶切驗證。實施例1111. 1質粒pPGK-KanMX轉化釀酒酵母(1)將釀酒酵母CGMCC 2842劃線接種于YPD平板上，在30°C培養酵母單菌落大小為2mm左右；(2)挑取酵母單菌落到5mL YPD培養基，30°C，200rpm培養16_18hr ；以1 %的接種量轉接于50mlYPD培養基，300C，200rpm培養2_4hr，使OD600達到1. 3-1. 5左右；(3)取一管硅精DNA變性，煮沸5min，迅速置于冰水混合物中，制成單鏈DNA ；(4)取適量預培養物在室溫下1500 Xg離心5min，收集細胞，用IX TE洗滌離心兩次，棄上清；
(5)用 anl lXLiAc/0. 5XTE 懸浮，室溫放置 5-10min ；(6)吸取IOOul步驟(5)中的酵母懸液至1. 5ml離心管中，加入Iug的質粒DNA， IOOug飽和的單鏈魚精DNA，再加入700ul的lXLiAc/40% PEG-3350/1 X TE后混合均勻 (同時設置空白對照)；(7)將混合物30°C培養30min，加入88ul的DMS0，輕輕倒轉混勻；(8)在421熱激15-301^11，在 3000\8下離心308，去除上清;(9)吸取Iml液體YPD加入每管，重懸菌體，在30°C培養3_4hr ；(10)每管轉化菌吸取一定量涂在YPD-G418(120ug/ml)平板上，30°C培養3_4d。11.2酵母質粒pPGK-KanMX的提取方法(1)接種轉化平板上生長的釀酒酵母一環于3ml液體YPD培養基中，加入G418使其終濃度為120ug/ml，30°C恒溫搖床，培養12 IMi至對數期；Q)5000rpm離心5min收集菌體，用TE洗滌一次；(3)用蝸牛酶滅菌的雙蒸水懸浮菌體，37°C處理30 60min，至大部分菌體變為球形；G)3000rpm離心5min收集原生質體；(5)將原生質體懸浮于 50mmol/L Tris-HCl (pH 7. 4)，20mmol/L EDTA (pH 7.4)， 1% SDS溶液中65°C處理30min ；(6)加入體積的5mol/L KAc溶液混勻后冰浴30min ；(7) 12000rpm離心lOmin，將上清液轉入另一離心管中，用酚氯仿抽提一次；(8)將上層水相轉入另一心離心管中，加入2倍體積預冷的無水乙醇，于-20°C放置Ih ；(9) I2OOOrpm,離心 lOmin，棄去上清液；(10)加入適量TE溶解沉淀。所獲得的質粒DNA濃度較低并含大量雜質，不能用于酶切電泳，按照實施例4的操作步驟轉化大腸桿菌，再提取質粒酶切電泳鑒定。酶切鑒定的結果表明提取的質粒為本實施方式構建的質粒。釀酒酵母CGMCC 2842對120ug/ml的G418敏感，本發明構建的質粒pPGK-KanMX 轉化釀酒酵母CGMCC 2842后，使得對G418敏感的菌株可以耐受120ug/ml的G418，表明本發明構建的質粒實現了以G418作為釀酒酵母轉化子抗性篩選標記，使轉化子的篩選簡單易行；同時該載體的啟動子由原來的半乳糖誘導的啟動子改造為組成型的PPGK組成型的啟動組，不需誘導就可以實現相關基因的表達。
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權利要求
1.一種含組成型啟動子PPGK和G418抗性基因的釀酒酵母表達載體及其構建方法，其特征在于，以PYES 2. 0為基本骨架，釀酒酵母表達載體含有組成型啟動子pPGK基因。
2.根據權利要求1中所述的釀酒酵母用的表達載體，其特征在于所述釀酒酵母表達載體同時含有KanMX基因，即G418的抗性基因。
3.權利要求1所述的釀酒酵母組成型表達載體構建方法，其特征在于，所述的表達載體構建方法具體操作如下(1)KanMX抗性標記基因的克隆根據pYES 2. 0酶切位點特性，選擇質粒pYES 2. 0上尿嘧啶篩選標記插入KanMX基因，同時設計克隆KanMX基因的引物，引物兩端分別含有Nhe I/Nde I酶切位點，以質粒pFA6a-GFPS65T-kanMX6為模板，用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，電泳回收目的片段，克隆到PMD18-T載體上，轉入大腸桿菌E.coli DH5ci，測序。命名該克隆載體為pMD 18-T-KanMX。(2)G418抗性載體的構建分別用限制性內切酶Nhe I和Nde I酶切pYES 2. 0和pMD18-T_KanMX，回收相應片段， 用T4 DNA連接酶進行連接，轉化E.coli DH5 α感受態細胞。提取質粒進行酶切鑒定。載體命名為pYES-Kanl。(3)PGK啟動子的克隆根據pYES 2. 0質粒啟動子pGAL酶切位點特性，選擇啟動子pPGK基因的插入位點，設計引物，引物兩端分別引入Age I和EcoR I酶切位點，以釀酒酵母染色體DNA為模板，用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增，電泳回收目的片段，克隆到pMDIS-T載體上，轉入大腸桿菌 E.coli DH5a，測序。命名該克隆載體為pMD18_T_PGK。(4)組成型G418抗性載體的構建分別用限制性內切酶Age I和EcoR I酶切ρYES-Kanl和pMD18_T_PGK，回收相應片段，用T4DNA連接酶進行連接，將克隆的PGK啟動子構建至pYES-Kanl相應位置，轉化 E. coliDH5a感受態細胞，提取質粒進行酶切鑒定。即得到釀酒酵母組成型表達載體，載體命名為 pPGK-KanMX。
全文摘要
本發明公開了一種含組成型啟動子pPGK和G418抗性基因的釀酒酵母表達載體及其構建方法，其目的是解決目前釀酒酵母表達載體多以營養缺陷為篩選標記，難以在工業酵母菌株進行基因工程改造過程中使用這一難題。其構建方法步驟如下克隆KanMX基因，與pYES2.0載體連接，構建質粒pYES-Kan1。同時，以釀酒酵母染色體DNA為模板，克隆pPGK啟動子基因，將其與pYES-Kan1質粒連接，將其原來的pGAL誘導型啟動子替換為pPGK啟動子，從而構建組成型釀酒酵母表達質粒pPGK-KanMX。本發明操作簡單，構建的質粒無需對工業酵母菌株進行營養缺陷改造即可進行基因操作，大大簡化了酵母基因工程改造過程。
文檔編號C12N15/66GK102304541SQ20111023521
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月17日 優先權日2011年8月17日
發明者周長林, 奚濤, 曹喜濤, 李揚, 王慧, 竇潔, 陳凱 申請人:中國藥科大學