專利名稱：細胞高富集靶向分離方法
技術領域：
本發明專利屬于一種生物治療和細胞生物的技術領域，特別涉及一種細胞高富集靶向分離方法。
背景技術：
在生物醫學工程關于細胞的科研領域及醫學臨床應用中，主要目的是研究細胞的功能和作用。例如臍血干細胞是一種具有分化潛能的原始細胞，具備自我更新和增值的能力，并能在特定因素的影響及誘導下，可以向各種細胞或組織分化。目前，造血干細胞移植已成為最基礎的治療手段，已廣泛應用于許多疾病的治療，包括惡性血液疾病、遺傳性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤放化療后的造血支持治療等。基于臍血干細胞取材方便，擴增量大，移植成活率高等特點，使其在臨床應用方面具有重大的理論意義和潛在的應用價值。因此目前國際和國內在臨床醫院、實驗室都在著力開發細胞治療技術領域，細胞分離技術是提取所需細胞的基礎和必要的手段，獲取高質量的所需要的細胞，是在細胞治療中增生所需細胞的一個關鍵前提和必要保障。如何獲得高質量、種類齊全、體積小、活性強的細胞，是分離技術成敗的關鍵。但是目前所采用的分離方法和分離材料都不能有效地獲得高質量的、種類齊全、體積微小、活性強的細胞，致使活性年輕細胞回收率和提取細胞存活率低。本專利提供一種全新的高富集靶向分離新技術及專用試劑。本專利的目的在于克服上述普通分離技術中存在的“活性年輕細胞回收率和提取細胞存活率低”的不足，而提供一種細胞高富集的靶向分離方法及專用試劑，該技術程序簡單、便于操作，細胞的回收率95%;細胞的存活率85%，達到國際、國內領先水平。提高了細胞提取精度和效率、節約了分離提取細胞的成本。使其在生物治療和細胞生物臨床應用方面具有重大的理論意義和潛在的應用價值。如上構思，本發明的技術方案是一種細胞高富集靶向分離方法，其特征在于包括如下步驟(一 )專用試劑的組成和制備將氯化鈉NaCl、氯化鉀KCl、氯化鈣CaCl2 · 2H20和蒸餾水混合配制成標本稀釋液 A液；將羥乙基淀粉和蒸餾水混合配制成紅細胞沉降液B液；將葡聚糖和蒸餾水混合配制成高富集細胞分離液C液；將輔酶、三磷酸腺苷和蒸餾水混合配制成高富集細胞保存液D液；( 二)分離操作方法步驟(1)將含有枸椽酸鈉或肝素抗凝的骨髓、臍帶血、外周血或經血與A液按照1 1 的比例充分混勻；(2)將B液全部加入步驟(1)混合后的液體中，放入容器封閉后充分混勻，室溫靜置 20-30min ；(3)室溫靜止后觀察有明顯的紅細胞沉降至最下層時，用移液管將上清液移至離心管中，并置于離心機中，離心力1210Xg(2500rpm)，離心4-5min;或用移液管將上清液移至無菌容器中；
(4)取步驟(3)離心后的離心管，棄上清液，每管加注射用生理鹽水混勻，收集離心管中底部的細胞合并到移植離心管中；(5)取新的離心管，每支加入C液，并將步驟(4)所得細胞懸液或步驟C3)移至無菌容器中的上清液沿離心管壁緩緩加入到裝有C液的離心管中，同時保證兩液體分界清楚；(6)將步驟(5)的離心管用離心力720Xg(1200 2000rpm)，離心20_30min ；(7)將步驟(6)離心后吸取中間云霧狀的薄層加至新的離心管中，每支離心管中收集液的體積< 20ml ；(8)在步驟(7)收集液中加注射用生理鹽水充分混勻，離心力1210Xg(2500rpm)， 離心4-5min，棄去上清，收集；再用注射用生理鹽水洗滌2次，離心條件同上，收集細胞備用。在步驟(5)的細胞懸液中加入由輔酶、三磷酸腺苷和蒸餾水混合配制成的高富集細胞保存液D液并充分混勻，離心力1210Xg (2500rpm)，離心5分鐘，棄去上清，收集，再用D 液洗滌2次，用離心力720Xg(1200 2000rpm)，離心20_30min，收集細胞備用。上述標本稀釋液A液150ml由氯化鈉NaCl 4. 2g、氯化鉀KCl 3. 8g、氯化鈣 CaCl2 · 2H204. Ig和蒸餾水混合配制成。上述紅細胞沉降液B液150ml由羥乙基淀粉6g和蒸餾水混合配制成。上述高富集細胞分離液C液IOOml由葡聚糖25g和蒸餾水混合配制成。上述高富集細胞保存液D液150ml由輔酶6g、三磷酸腺苷5g和蒸餾水混合配制成。本發明具有如下的優點和積極效果1、利用該技術及專用試劑對骨髓、臍帶血、外周血、經血和脂肪進行處理，以獲取所需要的有核細胞(包括干細胞)。目前細胞處理技術已廣泛應用于醫學及生物工程科研領域，同時也廣泛應用于生物治療和細胞生物及醫學臨床方面。2、由于同一機體中不同的血細胞膜電位不同，因此采用本專利的細胞高富集靶向分離技術及專用試劑，便可以將所需的有核細胞(包括干細胞、間充質干細胞)成功、有效地分離提取出來。3、本發明的專用試劑主要原材料為葡聚糖、氨基酸、能量合劑、離子、蒸餾水等。這些原材料已經作為成熟的產品或制劑產品用于臨床上對疾病的診斷或輸液使用。4、由于該靶向分離細胞的主要原材料如葡聚糖等是由微生物發酵制成的成熟上市產品，而不是由各種動物、病原體、人源的組織和體液等生物材料制成，因此該方法涉及到的材料也是一種無毒、安全的生化制劑，不存在生物安全性方面的風險。在銷售和運輸過程中無需特殊裝備和特殊運輸，普通包裝和一般避免震動運輸即可滿足需要，因此對使用者和環境不會產生不利影響。5、本發明適于從人類骨髓、臍帶血、外周血、經血和脂肪中分離、純化有核細胞 (包括干細胞、間充質干細胞)。該專利將為醫學科研和臨床治療提供了一種全新的細胞高富集靶向分離新的技術和專用試劑，它可以幫助科研人員更快更好地實現生物治療和細胞生物應用的多種目的。
具體實施例方式一種細胞高富集靶向分離方法，首先配制專用試劑1、將氯化鈉(NaCl)-4. 2g、氯化鉀(KCl) _3. 8g、氯化鈣(CaCl2 ·2Η20)_4. Ig 和蒸餾水混合配制成150ml標本稀釋液A液。2、將羥乙基淀粉-6g和蒸餾水混合配制成150ml紅細胞沉降液B液。3、將葡聚糖_25g和蒸餾水混合配制成IOOml高富集細胞分離液C液。4、將能量合劑(輔酶_6g、三磷酸腺苷_5g)、蒸餾水混合配制成150ml高富集細胞保存液D液。A、D液為透明液體，B液、C液為微帶乳光的水溶液；A液、B液、C液、D液內毒素均< 0. 5EU/ml ；分離細胞開始前，室溫應控制在20°C 且在無菌環境下，可以選擇下列二種操作方法操作方法1 1、將含有枸椽酸鈉或肝素抗凝的骨髓、臍帶血、外周血或經血與A液1 1的比例轉移至A液瓶內，充分混勻。2、再將B液全部加入第1步后的液體中，容器封閉后充分混勻，室溫靜置(靜置期間不得再搖動容器)，約30分鐘。3、30分鐘后，觀察有明顯的紅細胞沉降至最下層時，用25ml移液管將上清液(約占全容量的2/ 移至50ml離心管中，每管50ml，盡量不吸取紅細胞層。4、將第3步收集到離心管中的液體，置于離心機中，離心力1210Xg (約2500rpm)， 離心5min。5、取第4步離心后的離心管，棄上清液，每管加注射用生理鹽水7-10ml混勻，收集離心管中底部的細胞，總體積在40-50ml合并到移植離心管中。6、取新的50ml離心管，每支加入20 25ml C液。7、將第5步所得細胞懸液沿離心管壁緩緩加入到裝有25ml C液的離心管中，注意加入速度要慢，保證兩液體分界清楚。8、將第7步的離心管用離心力720Xg (約1200 2000rpm)，離心20-30分鐘。9、離心后吸取中間云霧狀的薄層加至新的離心管中，每支離心管中收集液的體積不超過20ml。10、在第7步收集液中加注射用生理鹽水至50ml充分混勻，離心力1210Xg(約 2500rpm)，離心5分鐘，棄去上清，收集。再用注射用生理鹽水洗滌2次(離心條件同上)， 收集細胞備用。11、(選擇步驟)在第7步收集液中加D液至50ml充分混勻，離心力1210Xg(約 2500rpm)，離心5分鐘，棄去上清，收集。再用D液洗滌2次(離心條件同第8步)，收集細胞備用。操作方法2 1、將含有枸椽酸鈉或肝素抗凝的骨髓、臍帶血、外周血或經血與A液1 1的比例轉移至A液瓶內，充分混勻。2、再將B液全部加入第1步后的液體中，容器封閉后充分混勻，室溫靜置(靜置期間不得再搖動容器)，約30分鐘。3、30分鐘后，觀察有明顯的紅細胞沉降至最下層時，用25ml移液管將上清液(約占全容量的2/ 移至無菌容器中，盡量不吸紅細胞層。4、取新的50ml離心管，每支加入20 25ml C液。5、將第3步所得細胞懸液沿離心管壁緩緩加入到裝有25ml C液的離心管中，注意加入速度要慢，保證兩液體分界清楚。6、將第5步的離心管用離心力720Xg (約1200 2000rpm)，離心20-30分鐘。7、離心后吸取中間云霧狀的薄層加至新的離心管中，每支離心管中收集液的體積不超過20ml。8、在第7步收集液中加注射用生理鹽水至50ml充分混勻，離心力1210Xg(約 2500rpm)，離心5分鐘，棄去上清，收集。9、再用注射用生理鹽水洗滌2次(離心條件同第8步)，收集細胞備用。10、(選擇步驟)在第7步收集液中加D液至50ml充分混勻，離心力1210Xg(約 2500rpm)，離心5分鐘，棄去上清，收集。再用D液洗滌2次(離心條件同第8步)，收集細胞備用。注意事項1、操作過程應在萬級潔凈實驗室的局部百級凈化工作臺內完成，以保證整個過程無菌操作。2、專用試劑盒不得用紫外線消毒，打開外包裝，包裝瓶用酒精消毒。3、A，B，C、D液三瓶試劑如出現渾濁、沉淀或有絮狀物則不能使用，C液中出現結晶屬于正常現象不影響使用。4、整個分離過程中，溫度應控制在20°C 且在無菌環境下，避免微生物的污染，否則會影響分離質量。5、由于不同品牌離心機的性能不同，國內南北地區溫度環境和四季的差異，可能影響分離效果，用戶可以調節離心轉數，調節離心的時間，摸索最佳的分離條件。6、配制細胞懸液所用的培養液要求等滲，具緩沖作用，并對細胞無毒性。
權利要求
1.一種細胞高富集靶向分離方法，其特征在于包括如下步驟(一)專用試劑的組成和制備將氯化鈉NaCl、氯化鉀KC1、氯化鈣CaCl2 ·2Η20和蒸餾水混合配制成標本稀釋液A液； 將羥乙基淀粉和蒸餾水混合配制成紅細胞沉降液B液；將葡聚糖和蒸餾水混合配制成高富集細胞分離液C液；將輔酶、三磷酸腺苷和蒸餾水混合配制成高富集細胞保存液D液；(二)分離操作方法步驟(1)將含有枸椽酸鈉或肝素抗凝的骨髓、臍帶血、外周血或經血與A液按照1 1的比例充分混勻；(2)將B液全部加入步驟(1)混合后的液體中，放入容器封閉后充分混勻，室溫靜置 20-30min ；(3)室溫靜止后觀察有明顯的紅細胞沉降至最下層時，用移液管將上清液移至離心管中，并置于離心機中，離心力1210Xg(2500rpm)，離心4-5min;或用移液管將上清液移至無菌容器中；(4)取步驟(3)離心后的離心管，棄上清液，每管加注射用生理鹽水混勻，收集離心管中底部的細胞合并到移植離心管中；(5)取新的離心管，每支加入C液，并將步驟(4)所得細胞懸液或步驟C3)移至無菌容器中的上清液沿離心管壁緩緩加入到裝有C液的離心管中，同時保證兩液體分界清楚；(6)將步驟(5)的離心管用離心力720Xg(1200 2000rpm)，離心20_30min；(7)將步驟(6)離心后吸取中間云霧狀的薄層加至新的離心管中，每支離心管中收集液的體積< 20ml ；(8)在步驟(7)收集液中加注射用生理鹽水充分混勻，離心力1210Xg(2500rpm)，離心 4-5min,棄去上清，收集；再用注射用生理鹽水洗滌2次，離心條件同上，收集細胞備用。
2.根據權利要求1所述的細胞高富集靶向分離方法，其特征在于在步驟(6)的細胞懸液中加入由輔酶、三磷酸腺苷和蒸餾水混合配制成的高富集細胞保存液D液并充分混勻，離心力1210Xg(2500rpm)，離心5分鐘，棄去上清，收集，再用D液洗滌2次，用離心力 720Xg (1200 2000rpm)，離心 20_30min，收集細胞備用。
3.根據權利要求1所述的細胞高富集靶向分離方法，其特征在于上述標本稀釋液A 液150ml由氯化鈉NaCl 4. 2g、氯化鉀KCl 3. 8g、氯化鈣CaCl2 ·2Η20 和蒸餾水混合配制成。
4.根據權利要求1所述的細胞高富集靶向分離方法，其特征在于上述紅細胞沉降液B 液150ml由羥乙基淀粉6g和蒸餾水混合配制成。
5.根據權利要求1所述的細胞高富集靶向分離方法，其特征在于上述高富集細胞分離液C液IMml由葡聚糖25g和蒸餾水混合配制成。
6.根據權利要求1所述的細胞高富集靶向分離方法，其特征在于上述高富集細胞保存液D液150ml由輔酶6g、三磷酸腺苷5g和蒸餾水混合配制成。
全文摘要
一種細胞高富集靶向分離方法，1、將骨髓、臍帶血、外周血或經血與標本稀釋液按照1∶1混勻；2、將紅細胞沉降液全部加入步驟1混合后的液體中，放入容器封閉后充分混勻，室溫靜置；3、用移液管將上清液移至離心管經過離心機離心或用移液管將上清液直接移至無菌容器中，將上清液加入到裝有高富集細胞分離液的離心管中；4、將步驟3中的收集液離心，離心后吸取中間云霧狀的薄層加至新的離心管中；5、在步驟4的收集液中加注射用生理鹽水混勻、離心，棄去上清，收集；再用注射用生理鹽水洗滌、再離心，收集細胞備用。本發明便于操作、細胞的回收率≥95％、細胞的存活率≥85％、提高了細胞提取精度和效率，節約了分離提取細胞的成本。
文檔編號C12N5/0789GK102399746SQ20111023576
公開日2012年4月4日 申請日期2011年8月17日 優先權日2011年8月17日
發明者丁澤榮, 任峰, 門劍龍 申請人:天津美德太平洋科技有限公司